氨基酸的分离鉴定.ppt

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1、实验实验4 氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定 纸层析法纸层析法 层析法层析法（色谱法）（色谱法）n是一种物理的分离方法。固定相与流动相。是一种物理的分离方法。固定相与流动相。n吸附层析、离子交换层析、薄层层析、凝胶层析（凝吸附层析、离子交换层析、薄层层析、凝胶层析（凝胶过滤）、亲和层析、分配层析。胶过滤）、亲和层析、分配层析。分配层析分配层析n分配系数：当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡分配系数：当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这时，它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数。种物质在两种溶剂中的浓度之比是

2、一个常数。n是一种连续抽提法。一种溶剂通常是被结合在固定的是一种连续抽提法。一种溶剂通常是被结合在固定的惰性支持物（柱、膜、纸）上的水，另外一相由流动惰性支持物（柱、膜、纸）上的水，另外一相由流动的被水饱和的有机溶剂构成，它流过固定相。的被水饱和的有机溶剂构成，它流过固定相。n如果某一混全物的各组分在这两相中的分配系数有足如果某一混全物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。够的差异，它们就可以被分离。物质在溶剂II中的浓度物质在溶剂I中的浓度 一、实验目的一、实验目的1.1.通通过过氨氨基基酸酸的的分分离离，学学习习纸纸层层析析法法的的基基本本原原理及操作方法理及操作方法

3、2.2.掌掌握握氨氨基基酸酸纸纸上上层层层层析析法法的的操操作作技技术术（点点样、平衡、展层、显色、鉴定）样、平衡、展层、显色、鉴定）.二、实验原理二、实验原理1.1.是是分分配配层层析析的的一一种种。在在纸纸上上水水被被吸吸附附在在纤纤维维素素的的纤纤维维之之间间形形成成固固定定相相。当当有有机机相相沿沿纸纸流流动动经经过过层层析析点点时时，层层析析点点上上溶溶质质就就在在水水相相和和有有机机相相之之间间进进行行分分配配，溶溶质质中中各各组组分分的的分分配配系系数数不不同同，移移动动速速率率也也不不同同，因因而而可可以彼此分开。以彼此分开。2.2.氨基酸与茚三酮的显色反应。氨基酸与茚三酮的显

4、色反应。3.3.物物质质被被分分离离后后在在纸纸层层析析图图谱谱上上的的位位置置是是用用R Rf f值值来来表表示示的的。在一定的条件下某种物质的在一定的条件下某种物质的R Rf f值是常数。值是常数。RfRf 原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离原点到层析点中心的距离原点到层析点中心的距离4.4.R Rf f值值的的大大小小与与物物质质的的结结构构、性性质质、溶溶剂剂系系统统、P PH H层层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。析滤纸的质量和层析温度等因素有关。5.5.上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。三、仪器、材料和试剂三、仪器、材料和试剂实

5、验仪器实验仪器1 1层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗层析缸、培养皿、小烧杯、长颈漏斗2 2毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱3 3层析滤纸、手套层析滤纸、手套、透明胶带或针线、透明胶带或针线实验材料和试剂实验材料和试剂1 1氨氨基基酸酸溶溶液液分分别别配配制制0.5%0.5%的的LysLys、AluAlu、IleIle、MetMet溶溶液液及及它它们的混合液（各组份浓度均为们的混合液（各组份浓度均为0.5%0.5%）。）。2 2显色剂显色剂0.1%0.1%水合茚三酮丙酮溶液。水合茚三酮丙酮溶液。3 3扩展剂（展层剂）扩展剂（展层剂）酸酸溶溶剂剂系系统统：正正丁丁醇醇:

6、80%:80%甲甲酸酸:水水15:3:215:3:2（体体积积比比），平平衡衡溶剂与扩展剂相同。每组配制溶剂与扩展剂相同。每组配制3030mlml碱碱溶溶剂剂系系统统：正正丁丁醇醇:12%:12%氨氨水水:95%:95%乙乙醇醇13:3:313:3:3（体体积积比比），平衡溶剂为平衡溶剂为12%12%氨水。氨水。四、操作步骤与方法四、操作步骤与方法 溶剂前沿层析点原点溶剂前沿亮苯丙缬脯赖n1 1将盛有扩展剂将盛有扩展剂1010mlml的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。的小烧杯和培养皿置于密闭的层析缸中。n2 2戴手套取层析滤纸一张作标记。戴手套取层析滤纸一张作标记。n3 3。点点样样：干干后

7、后重重复复点点一一次次，直直径径最最大大不不超超过过3 3mmmm。缝缝成成筒筒状状，两两边边不不能能接接触触。点点样样面面朝朝外外，点点样样端端朝朝下下，盖盖上上层层析析缸缸盖盖，平平衡衡约约2020 3030分钟。分钟。n4.4.展展层层用用长长颈颈漏漏斗斗，扩扩展展剂剂的的液液面面需需低低于于点点样样线线1 1cmcm。上上沿沿约约1 1厘米时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。厘米时，取出滤纸，用铅笔标出溶剂前沿界线，干燥。n5 5显显色色用用0.1%0.1%茚茚三三酮酮丙丙酮酮溶溶液液均均匀匀浸浸透透，烘烘箱箱（6565）5 5分分钟钟或或用用热热风风吹吹干干。脯脯氨氨酸酸、羟

8、羟脯脯氨氨酸酸产产生生黄黄色色物物质质外外，所所有有氨氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。五、实验结果与讨论五、实验结果与讨论六、注意事项六、注意事项1 1、切勿用手直接接触滤纸和显色剂。、切勿用手直接接触滤纸和显色剂。2 2、点点样样过过程程中中必必须须在在第第一一滴滴样样品品干干后后再再点第二滴。点第二滴。3 3、使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。、使用的溶剂系统需新鲜配制，并要摇匀。七、思考题n1、何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么？n2、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？n3、滤纸为什么要在层析缸中预先悬空密封饱和30min？n4、展开时为什么要调节滤纸使溶剂前沿线平行于点样线？n5、实验结果为什么有时会产生拖尾、相邻氨基酸分不开等异常现象？