教育专题：专题5课题2.ppt

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1、课题2多聚多聚酶酶链式反式反应扩增增DNA片段片段课标领课标领航航1尝试PCR(DNA多多聚聚酶酶链式式反反应)技技术的的基基本操作。本操作。2理解理解PCR的原理和反的原理和反应过程。程。3讨论PCR的的应用。用。【重点重点】PCR的原理和反的原理和反应过程。程。【难点点】PCR技技术的操作的操作过程。程。情境导引情境导引PCR诊断断技技术又又叫叫多多聚聚酶酶,链式式反反应技技术，它它采采用用分分子子技技术,模模拟核核酸酸在在体体内内的的复复制制，从从而而判判,定定疾疾病病病病原原体体的的种种类，所所以以从从本本,质上上来来说，这是是一种分子一种分子诊断方法。断方法。核心要点突破核心要点突破

2、知能过关演练知能过关演练课课题题2多多聚聚酶酶链链式式反反应应扩扩增增DNA片片段段基础自主梳理基础自主梳理基础自主梳理基础自主梳理一、一、PCR扩增的原理及条件增的原理及条件1概概念念：PCR即即_，是是一一种种体体外外迅迅速速扩增增DNA片片段段的的技技术。它它能能以以极极少少量量的的_为模板，在短模板，在短时间内复制出上百万份的内复制出上百万份的DNA拷拷贝。2原理原理(1)DNA的的热变性：在性：在80100的温度范的温度范围内，内，DNA_结构解体，双构解体，双链分开，分开，这个个过程称程称为_。当温度。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新又会重新

3、结合成双合成双链。多聚多聚酶酶链式反式反应DNA双螺旋双螺旋变性性(2)子子链的的合合成成：需需要要_；合合成成方方向向总是是从从子子链的的5端向端向3端延伸。端延伸。3条件条件(1)_模板。模板。(2)分分别与模板与模板DNA两条两条链相相结合的两种引物。合的两种引物。(3)A、T、G、C四种四种_。(4)耐耐热的的DNA聚合聚合酶酶，一般用，一般用TaqDNA聚合聚合酶酶。(5)需要需要稳定的定的_和能和能严格控制格控制_的温控的温控设备.引物引物DNA脱氧核苷酸脱氧核苷酸pH温度温度思考感悟思考感悟1什什么么是是引引物物？若若要要克克隆隆DNA，应加加入入几几种种特特定定的引物？的引物？

4、【提示提示】所所谓引物是指两段与待引物是指两段与待扩增的增的DNA序序列互列互补的一小段的一小段DNA或或RNA片段。片段。DNA是由两条是由两条反向平行排列的脱氧核苷酸反向平行排列的脱氧核苷酸长链构成的。在构成的。在DNA扩增增时，DNA聚合聚合酶酶不能从不能从头开始合成开始合成DNA，只，只能从引物的能从引物的3端延伸端延伸DNA链，因此克隆，因此克隆DNA时应加入两种引物。加入两种引物。二、二、PCR反反应过程程PCR一一般般要要经历三三十十多多次次循循环，每每次次循循环可可以以分分为_、复性和延伸三步。、复性和延伸三步。1变性性：当当温温度度上上升升到到_以以上上时，双双链DNA解聚解

5、聚为单链。2复复性性：温温度度下下降降到到_左左右右，两两种种引引物物通通过_与两条与两条单链DNA结合。合。3延伸：温度上升到延伸：温度上升到_左右，溶液中的四种左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在脱氧核苷酸在_的作用下，根据碱的作用下，根据碱基互基互补配配对原原则合成新的合成新的DNA链。变性性9050碱基互碱基互补配配对72DNA聚合聚合酶酶思考感悟思考感悟2PCR循循环过程程中中，变性性温温度度设置置95，时间设置置30s的原因是什么？的原因是什么？【提示提示】变性温度性温度过低，解低，解链不完全不完全导致致DNA不能不能扩增。增。变性温度性温度过高影响高影响酶酶的活性；在此温的活性；在此温

6、度条件下如果度条件下如果处理理时间过长，将会，将会导致致酶酶的的钝化。化。三、三、实验操作操作1实验用具用具(1)PCR仪：该仪器器能能自自动调控控_，实现DNA的的扩增增。如如果果没没有有PCR仪，可可用用3个个_代代替替，操操作作时按按程程序序在在3个个水水浴浴锅中中来来回回转移移PCR反反应的的微量离心管。微量离心管。(2)微微量量离离心心管管：总容容积为0.5mL，实际上上是是进行行离心的离心的场所。所。(3)微量移液器：用于吸取微量移液器：用于吸取转移移PCR配方中的液体，配方中的液体，其上的一次性吸液其上的一次性吸液枪头每吸取一种每吸取一种试剂后都要更后都要更换。温度温度恒温水浴恒

7、温水浴锅2操作步操作步骤准准备_混合混合_反反应。四、操作提示四、操作提示1为避避免免外外源源DNA等等因因素素的的污染染，实验中中使使用用的一些用具在使用前必的一些用具在使用前必须进行行_。2所所用用的的_和和酶酶应分分装装成成小小份份，并并在在20储存。存。五、五、DNA含量的含量的测定定1原原理理：利利用用DNA在在260 nm的的紫紫外外线波波段段的的_曲曲线来来测定相定相应含量。含量。2计算公式：算公式：DNA含量含量(g)50(260nm的的读数数)_。移液移液离心离心高高压灭菌菌缓冲液冲液吸收吸收稀稀释倍数倍数核心要点突破核心要点突破要点一要点一PCR原理原理1PCR扩增增方方向

8、向：为了了明明确确地地表表示示DNA的的方方向向，通通常常将将DNA的的羟基基(OH)末末端端称称为3端端，而而磷磷酸酸基基团的的末末端端称称为5端端。DNA聚聚合合酶酶不不能能从从头开开始始合合成成DNA，而而只只能能从从3端端延延伸伸DNA链，即即DNA的合成方向的合成方向总是从子是从子链的的5端向端向3端延伸。端延伸。2PCR原理原理DNA的的热变性原理性原理通通过控制温度来控制双控制温度来控制双链的解聚与的解聚与结合，合，现在使在使用的用的PCR仪实质上也是一台能上也是一台能够自自动控制温度的控制温度的仪器。器。3生物体内生物体内DNA复制与复制与PCR反反应的区的区别体内复制体内复制

9、PCR反反应解旋解旋在解旋在解旋酶酶作用下，作用下，细胞提供能胞提供能量，部分解开量，部分解开加加热至至90以上以上时，双，双链全部全部解开，不需解旋解开，不需解旋酶酶引物引物一小段一小段RNA可以是可以是RNA或或单链DNA分子片分子片段段合成子合成子链在引物基在引物基础上，一条上，一条链连续合合成，另一条成，另一条链不不连续合成合成分分别从两条从两条链的引物端开始，的引物端开始，都是都是连续合成，控制温度合成，控制温度72特点特点边解旋解旋边复制，半保留复制复制，半保留复制体外迅速体外迅速扩增增TaqDNA聚合聚合酶酶不需要不需要需要需要循循环次数次数受生物体自身控制受生物体自身控制30多

10、次多次相同点相同点生物体内的生物体内的DNA复制和复制和PCR体外体外DNA扩增都需要模板、四种增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中冲溶液中进行行(2011年年聊聊城城高高二二检测)下下列列关关于于DNA复复制制和和PCR的描述中，正确的是的描述中，正确的是()ADNA聚聚合合酶酶不不能能从从头开开始始合合成成DNA，只只能能从从5端延伸端延伸DNA链BDNA复制不需要引物复制不需要引物C引物与引物与DNA母母链通通过碱基互碱基互补配配对进行行结合合DPCR扩增的增的对象是氨基酸序列象是氨基酸序列【尝试解答解答】_C_例例例例1 1【解解析析】由

11、由于于DNA聚聚合合酶酶不不能能从从头开开始始合合成成DNA，只只能能从从3端端延延伸伸DNA链，故故DNA复复制制需需要要引引物物，而而且且它它与与DNA母母链通通过碱碱基基互互补配配对结合合。PCR扩增的增的对象是象是DNA，而不是氨基酸。，而不是氨基酸。【探探规寻律律】(1)引引物物是是一一小小段段DNA或或RNA，它它能能与与DNA母母链的的一一段段碱碱基基序序列列互互补配配对。包包括括引引物物和和引引物物两两种种。用用于于PCR的的引引物物长度度通通常常为2030个核苷酸。个核苷酸。(2)细胞内胞内DNA复制与复制与PCR技技术的原理和的原理和过程容易程容易发生混淆，特生混淆，特别应

12、注意区分注意区分PCR反反应需要可需要可变的的温度，而体内温度，而体内DNA复制需要复制需要稳定的温度。定的温度。跟跟踪踪训练(2011年年海海淀淀区区高高二二检测)关关于于DNA片片段段PCR扩增增实验的描述中不正确的是的描述中不正确的是()A加入的加入的TaqDNA聚合聚合酶酶耐高温耐高温B不同大小不同大小DNA在在电场中迁移速率不同中迁移速率不同C此此过程需要程需要DNA连接接酶酶D扩增区域由两种引物来决定增区域由两种引物来决定解解析析：选C。PCR扩增增实验是是在在较高高温温度度下下进行行的的，故故需需要要耐耐高高温温的的TaqDNA聚聚合合酶酶，但但不不需需要要DNA连接接酶酶，A项

13、正正确确，C项错误。因因为不不同同大大小小的的DNA带有有不不同同数数量量的的电荷荷，所所以以在在电场中中迁迁移移速速率率不不同同，B项正正确确。PCR扩增增需需要要两两种种引引物物，分分别与与DNA的两条模板的两条模板链互互补，则D项正确。正确。要点二要点二PCR反应的实验操作过程反应的实验操作过程1反反应体系的配方体系的配方10倍倍浓缩的的扩增增缓冲液冲液5L20mmol/L的的4种脱氧核苷酸的等量混合种脱氧核苷酸的等量混合液液1L20mol/L的引物的引物2.5L20mol/L的引物的引物2.5LH2O2833L15U/L的的TaqDNA聚合聚合酶酶12U模板模板DNA510L注：注：总

14、体体积50L，模板模板DNA的用量在的用量在1pg1mg之之间2.实验用具用具(1)PCR仪：PCR自自动化程度化程度较高，参照下表高，参照下表设计程序即可。程序即可。循循环数数变性性复性复性延伸延伸预变性性94，5min30次次94，30s55，30s72，1min最后一次最后一次 94，1min 55，30s72，1min若若无无PCR仪，可可用用恒恒温温水水浴浴锅代代替替，三三个个恒恒温温水水浴浴锅的的温温度度分分别为94、55和和72，然然后后按按照照上上表表要要求求，在在三三个个水水浴浴锅中中来来回回转移移PCR反反应的的微量离心管。微量离心管。(2)微微量量离离心心管管：一一种种薄

15、薄壁壁塑塑料料管管，总容容积为0.5mL。(3)微量移液器：用于定量微量移液器：用于定量转移移PCR配方中的液体，配方中的液体，其上的一次性吸液其上的一次性吸液枪头用一次更用一次更换一次。一次。3实验操作步操作步骤按照按照PCR反反应体系的配方将所需体系的配方将所需试剂摆放在放在实验桌上桌上 用微量移液器按照配方在微量用微量移液器按照配方在微量试管中依次加入各管中依次加入各组分分 盖盖严离心管口的盖子，用手指离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁管壁 将微量离心管放在离心机上，离心将微量离心管放在离心机上，离心约10min 将离心管放入将离心管放入PCR仪上，上，设置好置好PCR仪的循的循环程序程

16、序(2011年年长春春高高二二检测)多多聚聚酶酶链式式反反应(PCR技技术)是是在在实验室室中中以以少少量量样品品DNA制制备大大量量DNA的的生生化化技技术，反反应系系统中中包包括括微微量量样品品DNA、DNA聚聚合合酶酶、引引物物、足足量量的的4种种脱脱氧氧核核苷苷酸酸等等。反反应中中新新合合成成的的DNA又又可可以以作作为下下一一轮反反应的的模模板板，故故DNA数数以以指指数数方方式式扩增增，其其简要要过程如程如图所示。所示。例例例例2 2(1)某个某个DNA样品有品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一个脱氧核苷酸，已知它的一条条单链上碱基上碱基AGTC1234，则经过PCR仪五次循五次循

17、环后，将后，将产生生_个个DNA分子，其中需分子，其中需要提供胸腺要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是脱氧核苷酸的数量至少是_个。个。(2)分分别以不同生物的以不同生物的DNA样品品为模板合成的各个新模板合成的各个新DNA之之间存在差异，存在差异，这些差异是些差异是_。(3)由由于于DNA分分子子上上的的“遗传因因子子”基基本本都都是是符符合合孟孟德德尔尔的的遗传规律律的的，因因此此人人类可可以以利利用用PCR技技术合合成成的的DNA进行行亲子子鉴定定，其其原原理理是是：首首先先获取取被被测试者者的的DNA，并并进行行PCR扩增增，取取其其中中一一样本本DNA用用限限制制性性核核酸酸内内切切酶

18、酶切切成成特特定定的的小小片片段段，放放进凝凝胶胶内内，用用电泳泳推推动DNA小小片片段段分分离离，再再使使用用特特别的的“探探针”去去寻找找基基因因。相相同同的的基基因因会会凝凝聚聚在在一一起起，然然后后利利用用特特别的的染染料料在在X光光下下，便便会会显示示由由DNA探探针凝凝聚聚于于一一起起的的黑黑色色条条码。每每个个人人的的条条码一一半半与与其其母母亲的的条条码吻吻合合，另另一一半半与与其其父父亲的条的条码吻合。吻合。限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶能将能将DNA样品切成特定的小品切成特定的小片段，片段，这主要体主要体现了了酶酶的的_。A专一性一性 B高效性高效性C多多样性性D作用条件

19、温和作用条件温和2002年年6月，我国第一月，我国第一张18位点的位点的“基因身份基因身份证明明”在湖北武在湖北武汉诞生。人的生。人的“基因身份基因身份证明明”是是否否终身有效？身有效？_，理由是，理由是_。(4)请指出指出PCR技技术与与转录过程的三个不同之程的三个不同之处：_；_；_。【尝试解答解答】(1)326200(2)碱基碱基(脱氧核苷酸脱氧核苷酸)的数目、比例和排列的数目、比例和排列顺序不同序不同(3)A是是因因为同同一一个个体体的的不不同同生生长发育育阶段段和和不不同同组织的的DNA是是相相同同的的，所所以以它它有有高高度度的的个个体体特特异异性性和和稳定性定性(4)PCR技技术

20、以以DNA的的两两条条单链为模模板板合合成成子子代代DNA，转录以以DNA的一条的一条单链为模板合成模板合成RNAPCR技技术的的原原料料为脱脱氧氧核核苷苷酸酸，转录的的原原料料是是核核糖糖核苷酸核苷酸二者反二者反应时的催化的催化酶酶不同不同(或其他合理答案或其他合理答案)【解解析析】本本题考考查了了PCR技技术的的应用用及及相相关关计算算与与识图能能力力。(1)该DNA样品品复复制制5次次，产生生DNA分分子子数数为2532个个，DNA样品品中中TA200个个，则样品品复复制制5次次，需需要要胸胸腺腺嘧啶脱脱氧氧核核苷苷酸酸的的数数量量至至少少为200(251)6200个个。(2)不不同同生

21、生物物的的DNA样品品中中，脱脱氧氧核核苷苷酸酸(碱碱基基)数数目目、比比例例和和排排列列顺序序不不同同,故故各各个个新新DNA之之间也也存存在在差差异异。(3)限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶能能识别双双链DNA分分子子中中特特定定核核苷苷酸酸序序列列，并并在在特特定定部部位位进行行切切割割，这就就说明明酶酶具具有有专一一性性；人人的的“基基因因身身份份证明明”是是根根据据DNA上上的的遗传信信息息制制成成的的，而而每每个个人人的的DNA在在不不同同生生长发育育阶段段和和不不同同组织细胞中是基本相同的。胞中是基本相同的。转录PCR技技术模板模板DNA的一条的一条单链DNA两条两条链原料原料核

22、糖核苷酸核糖核苷酸脱氧核苷酸脱氧核苷酸碱基配碱基配对A与与UA与与T催化催化酶酶RNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶(4)PCR技技术与与转录过程的不同特点有：程的不同特点有：【互互动探探究究】(1)PCR中中由由碱碱基基错配配而而引引起起哪哪种种变异？异？(2)假假设对一一个个DNA进行行扩增增，第第一一次次循循环时某某一一条条模模板板链上上发生生碱碱基基错配配，则扩增增若若干干次次后后检测所所用用DNA的的扩增增片片段段，与与原原DNA相相应片片段段相相同同的的占多少？占多少？【提示提示】(1)基因突基因突变。(2)50%【易易误警警示示】(1)DNA母母链的的3端端对应着着子子链的的5端，即端，即DNA的两条的两条链是反向平行的。是反向平行的。(2)解解旋旋酶酶的的作作用用是是使使DNA两两条条链的的氢键断断开开，而而DNA聚聚合合酶酶与与DNA连接接酶酶都都是是催催化化形形成成磷磷酸酸二二酯键的。的。(3)DNA聚合聚合酶酶是将是将单个核苷酸加到已有的个核苷酸加到已有的单链片段的片段的3端上，需要模板，而端上，需要模板，而DNA连接接酶酶连接的接的是两条是两条DNA片段的缺口，不需要模板。片段的缺口，不需要模板。知能过关演练知能过关演练本部分内容讲解结束本部分内容讲解结束点此点此进入入课件目件目录按按ESC键退出全屏播放退出全屏播放谢谢使用使用