双水相萃取法幻灯片.ppt

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1、双水相萃取法第1页，共56页，编辑于2022年，星期五 基基因因工工程程产产品品如如蛋蛋白白质质和和酶酶往往往往是是胞胞内内产产品品，需需经经细细胞胞破破碎碎后后才才能能提提取取、纯纯化化，细细胞胞颗颗粒粒尺尺寸寸的的变变化化给给固固-液液分分离离带带来来了了困困难难，同同时时这这类类产产品品的的活活性性和和功功能能对对pHpH值值、温温度度和和离离子子强强度度等等环环境境因因素素特特别别敏敏感感。由由于于它它们们在在有有机机溶溶剂剂中中的的溶溶解解度度低低并并且且会会变变性性，因因此此传传统统的的溶溶剂剂萃萃取取法法并并不不适适合合。采采用用在在有有机机相相中中添添加加表表面面活活性性剂剂产

2、产生生反反胶胶束束的的办办法法可可克克服服这这些些问问题题，但但同同样样存存在在相相的的分分离离问问题题。因因此此基基因因工工程程产产品品的的商商业业化化迫迫切切需需要要开开发发适适合合大大规规模模生生产产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。第2页，共56页，编辑于2022年，星期五 其中其中双水相萃取技术双水相萃取技术(two-aqueous phase two-aqueous phase extraction,ATPS)extraction,ATPS)，又称又称水溶液两相分配技术水溶液两相分配技术(Partion of two aqueous p

3、hase extraction)Partion of two aqueous phase extraction)是是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。术。双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质还可以纯化蛋白质2 25 5倍，与传统的过滤法和离倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本上都要优越得多。上都要优越得多。第3页，共56页，编

4、辑于2022年，星期五双双水水相相萃萃取取法法和和传传统统的的分分离离方方法法(如如盐盐析析或或有有机机溶溶剂剂沉沉淀淀等等)相相比比也也有有很很大大的的优优势势，如如以以-半半乳乳糖糖苷苷酶酶为为例例，用用沉沉淀淀或或双双水水相相萃萃取取纯纯化化的的比比较较见见下下表表。除除此此以以外外，处处理理量量相相同同时时，双双水水相相萃萃取取法法比比传传统统的的分分离离方方法法,设设备备需需用用量量要要少少3 31010倍倍，因因此此已已被被广广泛泛地地应应用用在在生生物物化化学学、细细胞胞生生物物学学和和生生物物化化工工领领域域，进进行行生生物物转转化化、蛋蛋白白质质、核核酸酸和和病病毒毒等等产产

5、品品的的分分离离纯纯化化和和分分析析等等。用用此此法法来来提提纯纯的的酶酶已已达达数数十十种种，其其分分离离过过程程也也达达到到相相当当规规模模，如如乙乙醇醇脱脱氢氢酶酶的的分分离离已已达达到到几十千克湿细胞规模，几十千克湿细胞规模，-半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。第4页，共56页，编辑于2022年，星期五 聚聚合合物物的的不不相相溶溶性性(incompatibility)incompatibility)：当当两两种种高高分分子子聚聚合合物物之之间间存存在在相相互互排排斥斥作作用用时时，由由于于相相对对分分子子质质量量较较大大，分分子子间间的的相相互互排排

6、斥斥作作用用与与混混合合过过程程的的熵熵增增加加相相比比占占主主导导地地位位，一一种种聚聚合合物物分分子子的的周周围围将将聚聚集集同同种种分分子子而而排排斥斥异异种种分分子子，当当达达到到平平衡衡时时，即即形形成成分分别别富富含含不不同同聚聚合合物物的的两两相相。这这种种含含有有聚聚合合物物分分子子的的溶溶液液发发生生分相的现象称为聚合物的不相容性。分相的现象称为聚合物的不相容性。可可 形形 成成 双双 水水 相相 的的 双双 聚聚 合合 物物 体体 系系 很很 多多，如如 聚聚 乙乙 二二 醇醇(polyethylene polyethylene glycol,glycol,PEG)/PEG

7、)/葡葡聚聚糖糖(dextran(dextran，Dx)Dx)，聚聚丙丙二二醇醇(polypropylene polypropylene glycol)glycol)/聚聚 乙乙 二二 醇醇 和和 甲甲 基基 纤纤 维维 素素(methylcellulose)/methylcellulose)/葡葡聚聚糖糖等等。双双水水相相萃萃取取中中常常采采用用的的双双聚聚合合物物系系统统为为PEG/DxPEG/Dx，该该双双水水相相的的上上相相富富含含PEGPEG，下下相相富富含含DxDx。除除双双聚聚合合物物系系统统外外，聚聚合合物物与与无无机机盐盐的的混混合合溶溶液液也也可可形形成成双双水水相相，例例

8、如如，PEG/PEG/磷磷酸酸钾钾(KPi)KPi)、PEG/PEG/磷磷酸酸铵铵、PEG/PEG/硫硫酸酸钠钠等等常常用用于于生生物物产产物物的的双双水水相相萃萃取取。PEG/PEG/无无机机盐系统的上相富含盐系统的上相富含PEGPEG，下相富含无机盐。下相富含无机盐。1 1 双水相系统双水相系统第5页，共56页，编辑于2022年，星期五均相区图图a a和和b b分别为分别为PEG/DxPEG/Dx和和PEG/KPiPEG/KPi系统的典型相图系统的典型相图a双节线双节线系线系线b双节线双节线均相区均相区均相区均相区两相区两相区两相区两相区系线系线临界点临界点第6页，共56页，编辑于2022

9、年，星期五 在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即 系系线线的的长长度度是是衡衡量量两两相相间间相相对对差差别别的的尺尺度度，系系线线越越长长，两两相相间间的的性性质质差差别别越越大大，反反之之则则越越小小。当当系系线线长长度度趋趋向向于于零零时时，即即在在图图b b的的双双节节线线上上K K点点，两两相相差差别别消消失失，任任何何溶溶质质在在两两相相中中的的分分配配系系数数均均为为1 1，因因此此K K点称为点称为临界点临界点(critic

10、al point)critical point)。上下相组成分别为上下相组成分别为T和和B,第7页，共56页，编辑于2022年，星期五第8页，共56页，编辑于2022年，星期五2.2.双水相中的分配平衡双水相中的分配平衡 与与溶溶剂剂萃萃取取相相同同，溶溶质质在在双双水水相相中中的的分分配配系系数数也也用用m=c2/c1m=c2/c1表表示示。为为简简便便起起见见，用用c1c1 和和c2c2分分别别表表示示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。有有关关双双水水相相系系统统中中溶溶质质分分配配平平衡衡的的理理论论已已有有很很多多研研究究报报导导。但但是是，由由于

11、于影影响响双双水水相相系系统统中中溶溶质质分分配配平平衡衡的的因因素素非非常常复复杂杂，很很难难建建立立完完整整的的热热力力学学理理论论体体系系。从从双双水水相相萃萃取取过过程程设设计计的的角角度度出出发发，确确定定影影响响分配系数的主要因素是非常重要的。分配系数的主要因素是非常重要的。第9页，共56页，编辑于2022年，星期五已有的大量研究表明，生物分子的分配系数取决于溶质与已有的大量研究表明，生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用主要有静电作用、疏疏水作用和生物亲和作用等水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作

12、用。因此，分配系数是各种相互作用的和的和:lnm=lnme+lnmh+lnmlm me e，m mh h，m ml l 分别为静电作用、疏水作用和生物分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。亲和作用对溶质分配系数的贡献。第10页，共56页，编辑于2022年，星期五1 1静电作用静电作用非电解质非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响，利用相平衡型溶质的分配系数不受静电作用的影响，利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表达式：热力学理论可推导下述分配系数表达式：lnm=-M/RTm-m-分配系数；分配系数；M-M-溶质的相对分子质量；溶质的相对分子质量；-与溶质表面性质和与

13、溶质表面性质和成相系统有关的常数成相系统有关的常数;R-R-气体常数，气体常数，J/(mo1J/(mo1K)K)；T-T-绝对温度，绝对温度，K K。因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若00，不不同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是因为式中的因为式中的随双水相系统而异。随双水相系统而异。第11页，共56页，编辑于2022年，星

14、期五第12页，共56页，编辑于2022年，星期五实实际际的的双双水水相相系系统统中中通通常常含含有有缓缓冲冲液液和和无无机机盐盐等等电电解解质质，当当这这些些离离子子在在两两相相中中分分配配浓浓度度不不同同时时(即即分分配配系系数数1)1)，将将在在两两相相间间产产生生电电位位差差，此此时时，荷荷电电溶溶质质的的分分配配平平衡衡将将受受相相间间电电位位的的影影响响，从从相相平平衡衡热热力力学学理理论论推推导导溶溶质质的的分分配配系系数表达式为数表达式为lnlnmm=ln=lnmmo o+FZ/RTFZ/RT 因因此此，荷荷电电溶溶质质的的分分配配系系数数的的对对数数与与溶溶质质的的净净电电荷荷

15、数数成成正正比比,由由于于同同一一双双水水相相系系统统中中添添加加不不同同的的盐盐产产生生的的相相间间电位不同，故分配系数与净电荷数的关系因无机盐而异电位不同，故分配系数与净电荷数的关系因无机盐而异.电位差，总电荷电位差，总电荷 气体常数气体常数第13页，共56页，编辑于2022年，星期五2 2疏水作用疏水作用 一一般般蛋蛋白白质质表表面面均均存存在在疏疏水水区区，疏疏水水区区占占总总表表面面积积的的比比例例越越大大，疏疏水水性性越越强强。所所以以，不不同同蛋蛋白白质质具具有有不不同同的的相相对对疏疏水水性性。在在pHpH为为等等电电点点的的双双水水相相中中，蛋蛋白白质质主主要要根根据据表表面

16、面疏疏水水性性的的差差异异产产生生各各自自的的分分配配平平衡衡。同同时时，疏疏水水性性一一定定的的蛋蛋白白质质的的分分配配系系数数受受双双水水相相系系统统疏疏水水性性的的影影响响。因因此此，有有必必要要确确定定双双水水相相系系统统的的疏疏水水性性尺尺度度，以以便便在在萃萃取取操操作作时时调调整整和和设设计计蛋蛋白白质质的的分分配配系系数数。PEG/DxPEG/Dx和和PEG/PEG/无无机机盐盐等等双双水水相相系系统统的的上上相相(PEGPEG相相)疏疏水水性性较较大大，相相间间的的疏疏水水性性差差用用疏疏水水性性因因子子HF HF(hydrophobic(hydrophobic factor

17、)factor)表表示示。HFHF可可通通过过测测定定疏疏水水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数m maaaa测算测算第14页，共56页，编辑于2022年，星期五lnmlnmaaaa=HF(RH+B)HF(RH+B)其中，其中，RHRH为氨基酸的相对疏水性为氨基酸的相对疏水性(relativehydrophobicity)relativehydrophobicity)，是通过测定是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设疏水性最小的甘氨酸的氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设疏水性最小的甘氨酸的RHRH0 0。B=B=lnmlnmGlyGl

18、y/HF/HF所以，所以，pHpHpIpI时氨基酸在双水相系统中的分配时氨基酸在双水相系统中的分配系数与其系数与其RHRH值呈线性关系，直线的斜率就是该值呈线性关系，直线的斜率就是该双水相系统的双水相系统的HFHF值。值。第15页，共56页，编辑于2022年，星期五利利用用前前式式可可确确定定不不同同双双水水相相系系统统的的HFHF值值。如如果果在在pHpH为为等等电电点点的的双双水水相相中中蛋蛋白白质质的的分分配配系系数数(m m0 0)与与HFHF值值之之间间呈呈线线性性关关系系，则则直直 线线 的的 斜斜 率率 定定 义义 为为 该该 蛋蛋 白白 质质 的的表表 面面 疏疏 水水 性性，

19、用用HFS HFS(hydrophobic factor of solutes)(hydrophobic factor of solutes)表示表示lnmlnm0 0=HF HFSHF HFS一般形式一般形式lnmlnm=HF(HFS+HFS)+HF(HFS+HFS)+FZ/RTFZ/RT 该该式式较较全全面面地地描描述述了了双双水水相相系系统统的的疏疏水水性性和和相相间间电电位位、蛋蛋白白质质的的疏疏水水性性和和净净电电荷荷数数对对分分配配系系数数的的影影响响，同同时时也也间间接接地地通通过过盐盐对对蛋蛋白白质质表表面面疏疏水水性性和和相相间间电电位位的的影影响响表表现现了了盐盐对对蛋蛋白

20、白质分配系数的作用。质分配系数的作用。第16页，共56页，编辑于2022年，星期五3 3.影响物质分配平衡的因素影响物质分配平衡的因素 影影响响物物质质在在双双水水相相系系统统中中分分配配的的因因素素主主要要有有双双水水相相系系统统的的聚聚合合物物组组成成(包包括括聚聚合合物物类类型型、平平均均分分子子量量)，盐盐类类(包包括括离离子子的的类类型型和和浓浓度度、离离子子强强度度、pHpH值值)，溶溶质质的的物物理理化化学学性性质质(包包括括分分子子量量、等等电电点点)以以及及体体系系的的温温度度等等。然然而而，这这些些参参数数并并不不是是独独立立地地起起作作用用。所所以以要要预预测测溶溶质质在

21、在双双水水相相系系统统间间的的分分配配系系数数是是困困难难的的。这这些些系系统统复复杂杂性性表表现现在在如如下下的的一一些些例例子子中中：在在一一相相中中引引入入疏疏水水性性基基团团会会影影响响离离子子的的分分配配和和电电位位，在在大大分分子子(亲亲水水聚聚合合物物或或蛋蛋白白质质溶溶质质)结结构构中中构构象象的的变变化化，能能使使另另一一些些原原子子暴暴露露在在微微环环境境中中。这这些些事事实实导导致致只只能能用用实实验验的的方方法法来来确确定满足分配要求的操作条件。定满足分配要求的操作条件。第17页，共56页，编辑于2022年，星期五3.1 双水相中聚合物组成的影响双水相中聚合物组成的影响

22、 双双水水相相系系统统作作为为一一种种成成功功的的萃萃取取方方法法，很很大大程程度度上上取取决决于于使使用用的的聚聚合合物物类类型型，当当两两种种不不同同聚聚合合物物的的溶溶液液混混合合时时，可可能能存存在在三三种种情情况况：a a 完完全全混混溶溶性性(匀匀相相溶溶液液)；b b 物物理理的的不不相相溶溶性性(相相分分离离)；c c 复复杂杂的的凝凝聚聚(相相分分离离,聚聚合合物物聚聚集集在在同同一一相相中中，纯纯溶溶剂剂-水水聚聚集集在在另另一一相相中中)。离离子子和和非非离离子子聚聚合合物物都都可可以以使使用用在在双双水水相相系系统统的的构构成成上上，但但是是，当当这这两两种种聚聚合合物

23、物是是离离子子化化合合物物并并带带有有相相反反电电荷荷时时，它它们们互互相相吸吸引引并并发发生生复复杂杂的凝聚。的凝聚。第18页，共56页，编辑于2022年，星期五3.2 3.2 双水相系统物理化学性质的影响双水相系统物理化学性质的影响 双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数：密度双水相系统的性质主要取决于下列物理化学参数：密度()和两相间的密度差，黏度和两相间的密度差，黏度()和两相间的黏度差以及表面张力和两相间的黏度差以及表面张力()。第19页，共56页，编辑于2022年，星期五系线长度系线长度代表了系统达到平衡时上、下相和总组成的关系，在临界点附代表了系统达到平衡时上、下相和总组成的

24、关系，在临界点附近系线的长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此近系线的长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此,分配系数应该是分配系数应该是1 1。随着聚合物和成相盐浓度增大，。随着聚合物和成相盐浓度增大，系线的长度增加系线的长度增加,上相和上相和下相相对组成的差别就下相相对组成的差别就增大，产物如酶在两相增大，产物如酶在两相中的界面张力差别也增中的界面张力差别也增大，这将会极大地影响大，这将会极大地影响分配系数，使酶富集于分配系数，使酶富集于上相。上相。第20页，共56页，编辑于2022年，星期五3.3 盐和缓冲液的影响盐和缓冲液的影响 盐盐的的种种类类和和浓浓度度对对分分配配系系数数的的

25、影影响响主主要要反反映映在在对对相相间间电电位位和和蛋蛋白白质质疏疏水水性性的的影影响响。在在双双聚聚合合物物系系统统中中，无无机机离离子子具具有有各各自自的的分分配配系系数数，不不同同电电解解质质的的正正负负离离子子的的分分配配系系数数不不同同，当当双双水水相相系系统统中中含含有有这这些些电电解解质质时时，由由于于两两相相均均应应各各自自保保持持电电中中性性，从从而而产产生生不不同同的的相相间间电电位位，因因此此，盐盐的的种种类类(离离子子组组成成)影影响响蛋蛋白白质质、核核酸酸等等生生物物大大分分子子的的分分配配系系数数，盐盐浓浓度度不不仅仅影影响响蛋蛋白白质质的的表表面面疏疏水水性性，而

26、而且且扰扰乱乱双双水水相相系系统统，改改变变各各相相中中成成相相物物质质的的组组成成和和相相体体积积比比。例例如如，PEG/KPiPEG/KPi系系统统中中上上、下下相相(或或称称轻轻重重相相)的的PEGPEG和和磷磷酸酸钾钾浓浓度度以以及及ClCl离离子子在在上上、下下相相中中的的分分配配平平衡衡，随随添添加加NaClNaCl浓浓度度的的增增大大而而改改变变。这这种种相相组组成成即即相相性性质质的的改改变变直直接接影影响响蛋蛋白白质质的的分分配配系系数数。离离子子强强度度对对不不同同蛋蛋白白质质的的影影响响程程度度不不同同，利利用用这这一一特特点点，通通过过调调节节双双水水相相系系统统中中的

27、的盐盐浓浓度度，可可有有效效地地萃萃取取分分离离不不同同的的蛋蛋白白质质。在在不不同同的的双双水水相相体体系系中中盐盐的的作作用用也也不不相相同同。在在 PEG/PEG/磷磷酸酸盐盐 /水水中中加加入入氯氯化化钠钠可可以以使使万万古古霉霉素素的的分分配配系系数数由由 4 4提提高高到到 120,120,而而在在PEG/DEX/PEG/DEX/水水体体系中只从系中只从 1.551.55提高到提高到5 5。第21页，共56页，编辑于2022年，星期五3.4 温度的影响温度的影响温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。但一般温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。但一般来说，

28、当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，1-21-2度度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。的温度改变不影响目标产物的萃取分离。第22页，共56页，编辑于2022年，星期五 大大规规模模双双水水相相萃萃取取操操作作一一般般在在室室温温下下进进行行，不不需需冷冷却。这是基于以下原因：却。这是基于以下原因：(1)(1)成成相相聚聚合合物物PEGPEG对对蛋蛋白白质质有有稳稳定定作作用用，常常温温下下蛋蛋白白质一般不会发生失活或变性；质一般不会发生失活或变性；(2)(2)常温下溶液粘度较低，容易相分离；常温下溶液粘度较低，容易相分离；(3)(

29、3)常温操作节省冷却费用。常温操作节省冷却费用。第23页，共56页，编辑于2022年，星期五v在在生生物物分分子子回回收收和和纯纯化化以以后后，怎怎样样从从含含有有目目标标产产物物残残余余物物的的水水溶溶液液中中回回收收聚聚合合物物或或盐盐就就成成为为一一个个重重要要的的问问题题。例例如如从从1000kg1000kg面面包包酵酵母母中中萃萃取取反反丁丁烯烯二二酸酸酶酶需需要要用用680kgPEG-1550680kgPEG-1550和和533kgK533kgK3 3POPO4 4，若若不不回回收收利利用用，化化学学品品的的消消耗耗会会使使生生产产成成本本大大幅幅度度上上升升。如如果果产产品品是是

30、蛋蛋白白质质，并并且且分分配配在在盐盐相相，则则盐盐可可以以在在错错流流过过程程操操作作方方法法下下，用用超超滤滤或或渗渗析析膜膜过过滤滤回回收收。如如果果蛋蛋白白质质积积聚聚在在聚聚乙乙二二酵酵中中，可可以以通通过过加加入入盐盐来来精精制制，加加入入的的盐盐导导致致蛋蛋白白质质在在盐盐相相中中重重新新分分配配。PEGPEG的的分分离离同同样样可可以以用用膜膜分分离离来来实实现现，即即用用选选择择性性孔孔径径大大小小的的半半透透膜膜来来截截留留蛋蛋白白质质，同同时时排排除除PEGPEG进进行行回回收收。另另一一种种力力法法是是通通过过盐盐析析或或使使用用水水-可可混混溶溶性性的的溶溶剂剂来来沉

31、沉淀淀蛋蛋白白质质，但但是是固固体体(产产物物)的的去去除除被被存存在在的的PEGPEG阻阻碍碍。也也可可使使用用离离子子交交换换和和吸吸附附，它它们们是是通通过过蛋蛋白白质质与与基基质质的的选选择择性性相相互互作作用用进进行行的的。然然而而，当当黏黏性性聚聚合合物物溶溶液液通通过过柱柱被被处处理理的的时时候候，会会出出现现高高的的压压力力降降。在在上上述述的的三三种种方方法法中中，膜膜分分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物的最佳方法。离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物的最佳方法。第24页，共56页，编辑于2022年，星期五亲和双水相技术亲和双水相技术v亲亲和和双双水水相相

32、技技术术是是指指在在成成相相高高聚聚物物上上偶偶联联亲亲和和性性配配基基 ,以以提提高高溶溶质质的的分分配配系系数数。这这种种技技术术已已经经广广泛泛地地运运用用到到蛋蛋白白质质等等生生物物大大分分子子的的分分离离纯纯化化工工艺艺中。中。v万万古古霉霉素素可可以以和和二二肽肽 N-N-乙乙酰酰-D-Ala-D-Ala-D-Ala-D-Ala形形成成复复合合物物 ,当当二二肽肽作作为为配配基基与与活活性性 MPEGMPEG共共价价结结合合后后 ,加加入入到到 PEG/DEXPEG/DEX系系统统中中,不不仅仅大大大大提提高高了了系系统统的的选选择择性性 ,而且分配系数提高了而且分配系数提高了7

33、7倍。倍。丙氨酸第25页，共56页，编辑于2022年，星期五4.双水相系统的应用双水相系统的应用 双双水水相相萃萃取取自自发发现现以以来来，无无论论在在理理论论上上还还是是实实践践上上都都有有很很大大的的发发展展。在在最最近近几几年年中中更更为为突突出出,在在若若干干生生物物工工艺艺过过程程中中得得到到了了应应用用，其其中中最最重重要要的的领领域域是是蛋蛋白白质质的的分分离离和和纯化，其应用举例如表所示。纯化，其应用举例如表所示。第26页，共56页，编辑于2022年，星期五现举例介绍具体的分离、纯化方法。现举例介绍具体的分离、纯化方法。A A 酶的提取和纯化酶的提取和纯化 双双水水相相的的应应

34、用用始始于于酶酶的的提提取取。由由于于PEG/PEG/精精DextranDextran体体系系太太贵贵，而而粗粗DextranDextran粘粘度度又又太太大大,故故目目前前研研究究相相应应用用较较多多的的是是PEG/PEG/盐盐体体系系。下表中列出一些应用的实例。下表中列出一些应用的实例。第27页，共56页，编辑于2022年，星期五 在在这这些些体体系系中中，酶酶主主要要分分配配在在上上相相，菌菌体体在在下下相相或或界界面面上上。料料液液中中湿湿细细胞胞含含量量可可高高达达30%30%，酶酶的的提提取取率率达达90%90%以以上上。如如果果条条件件选选择择合合适适，不不仅仅可可从从发发酵酵液

35、液提提取取酶酶，实实现现它它与与茵茵体体的的分分离离。而而且且还还可可将将各各种种酶酶互互相相分离，分离，B B 核酸的分离及纯化核酸的分离及纯化 用用PEG/PEG/DextranDextran体体系系萃萃取取核核酸酸时时，盐盐组组成成的的微微小小变变化化将将会会引起分配系数的急剧变动。引起分配系数的急剧变动。C C 人生长激素的提取人生长激素的提取 用用PEG4000 PEG4000 6.66.6磷磷酸酸盐盐1414体体系系从从E.coliE.coli碎碎片片中中提提取取人人生生长长激激素素(hGH)(hGH)，当当pHpH值值7 7及及菌菌体体含含量量为为3535(w(wv)v)干干细细

36、胞胞，混混合合5-105-10秒秒钟钟后后，即即可可达达到到萃萃取取平平衡衡hGHhGH分分配配在在上上相相，其其分分配配系系数数高高达达6.46.4，相相比比为为0.20.2，收收率率大大于于6060，对对蛋蛋白白的的纯纯化化系系数数为为7.87.8。如若进行三级错流萃取，总收率可达如若进行三级错流萃取，总收率可达8181，纯化系数为，纯化系数为3.53.5。第28页，共56页，编辑于2022年，星期五 D D 干扰素干扰素(-IEN)(-IEN)的提取的提取 双双水水相相萃萃取取持持别别适适用用于于干干扰扰素素这这些些不不稳稳定定的的、在在超超滤滤或或沉沉淀淀时时易易失失活活的的蛋蛋白白质

37、质的的提提取取和和纯纯化化,干干扰扰素素是是合合成成纤纤维维细细胞胞或或小小鼠鼠体体内内细细胞胞的的分分泌泌物物。培培养养基基中中总总蛋蛋白白浓浓度度为为1g/L1g/L而而它它的的浓浓度度仅仅为为0.1mg/L0.1mg/L。用用一一般般的的PEGPEGDextranDextran体体系系，不不能能将将干干扰扰素素与与主主要要杂杂蛋蛋白白分分开开，必必须须是是具具有有带带电电基基团团或或亲亲和和基基团团的的PEGPEG衍衍生生物物如如PEGPEG磷磷酸酸酯酯与与盐盐的的系系统统才才能能使使干干扰扰素素分分配配在在上上相相，杂杂蛋蛋白白完完全全分分配配在在下下相相而而得得到到分分离离。并并且且

38、干干扰扰素素的的浓浓度度越越高高，分分配配系系数数越越大大，纯纯化化系系数数甚甚至至可可高高达达350350。这这一一技技术术已已用用于于1101109 9单单位位的的干干扰扰素素的的回回收收。收收率率达达97%97%，干干扰扰素素的的特特异异活活性性1l01l06 6单单位位/mg/mg蛋蛋白白。这这一一方方法法与与层层析析技技术术相相结结合合，组组成成双双水水相相萃萃取取层层析析纯纯化化联联合合流程、已成功地用于工业生产。流程、已成功地用于工业生产。第29页，共56页，编辑于2022年，星期五E E 病毒的分离纯化病毒的分离纯化 当当病病毒毒进进入入双双水水相相体体系系后后，在在上上相相和

39、和下下相相间间也也会发生选择性分配，表现出一定的分配系数。会发生选择性分配，表现出一定的分配系数。双水相萃取技术的进展双水相萃取技术的进展 从从上上可可见见双双水水相相萃萃取取技技术术不不但但用用于于生生物物物物质质的的分分离离和和纯纯化化，而而且且己己成成为为一一种种新新的的分分析析测测试试手手段段。近近年年来来还还有了新的进展，主要有两个方向：有了新的进展，主要有两个方向：廉价双水相体系的开发廉价双水相体系的开发 在在生生化化工工程程中中得得到到应应用用的的两两种种双双水水相相体体系系，即即高高聚聚物物高高聚聚物物和和高高聚聚物物盐盐体体系系。这这两两种种体体系系比比较较见见下表：下表：第

40、30页，共56页，编辑于2022年，星期五从表可见，高聚物从表可见，高聚物高聚物体系对活性物质变性作用高聚物体系对活性物质变性作用小，界面吸附少，但价格高因而寻找廉价的高聚物：小，界面吸附少，但价格高因而寻找廉价的高聚物：高聚物双水相体系是双水相萃取技术应用的一个重要高聚物双水相体系是双水相萃取技术应用的一个重要发展方向。发展方向。第31页，共56页，编辑于2022年，星期五目目前前比比较较成成功功的的是是用用变变性性淀淀粉粉PPT(hydroxypropy PPT(hydroxypropy dertvative dertvative of of Starch)Starch)代代替替昂昂贵贵的

41、的dextrandextran。PPTPPTPEGPEG体体系系已已被被用用来来从从发发酵酵液液中中分分离离过过氧氧化化氢氢酶酶、半半乳乳糖糖苷苷酶酶等等。PPTPPTPEGPEG体体系系比比PEGPEG盐盐体体系系稳稳定定。和和PEGPEGdextrandextran体体系系相相图图非非常常相相似似，并并具具有以下优点：有以下优点：(1)(1)蛋蛋白白质质溶溶解解度度大大。蛋蛋白白质质在在PPTPPT浓浓度度到到l5l5以以前前没没有有沉沉淀淀，但但在在PEGPEG浓浓度度大大于于5 5时时，溶溶解解度度显显著著地地减减小小，在在盐盐溶溶液液中中的的溶解度更小。溶解度更小。(2)(2)粘粘度

42、度小小。PPTPPT的的动动力力粘粘度度只只是是粗粗dextrandextran的的1 12 2，因因而而可可以大大改善传质效果。以大大改善传质效果。(3)(3)价价格格便便宜宜。PPTPPT价价格格为为每每千千克克几几十十美美元元，而而粗粗DextranDextran则则要要每每千千克克几几百百美美元元，所所以以PPTPPTPEGPEG双双水水相相体体系系具具有有更更广广泛泛的的应用前景。应用前景。第32页，共56页，编辑于2022年，星期五液液-液双水相萃取分离液双水相萃取分离-淀粉酶淀粉酶-淀淀粉粉酶酶是是广广泛泛应应用用的的生生物物酶酶类类，B.Subtilis细细菌菌-淀淀粉粉酶酶是

43、是研研究究和和应应用用较较多多的的-淀淀粉粉酶酶，其其分分子子量量为为48000道道尔尔顿顿，PI约约为为5，最最适适pH5.3-6.4，在在pH4.8-8.5之之间间稳稳定定。实实验验研研究究了了-淀淀粉粉酶酶在在聚聚乙乙二二醇醇（PEG）/磷磷酸酸盐盐双双水水相相系系统统中中的的分分配配，PEG分分子子量量、PEG浓浓度度、pH、添添加加NaCl和和酶酶浓浓度度等等因因素素对对-淀淀粉粉酶酶分分配配系系数数影影响。响。第33页，共56页，编辑于2022年，星期五PEG：分子量为：分子量为400，1000，4000和和6000-淀粉酶在淀粉酶在PEG/磷酸盐系统的分配系数磷酸盐系统的分配系数

44、系统系统K PEG400（13.2%w/w）磷酸盐）磷酸盐（16.8%w/w）20.42PEG1000(11.5%w/w)磷酸盐磷酸盐(13.4%w/w)17.62PEG4000(10%w/w)磷酸盐磷酸盐(11.5%w/w)1.75PEG6000(7.5%w/w）磷酸盐）磷酸盐（10%w/w）0.35贵州啤酒厂贵州啤酒厂 第34页，共56页，编辑于2022年，星期五双水相萃取法在天然产物纯化中的应用双水相萃取法在天然产物纯化中的应用传统双水相系统在中药有效成分纯化中的应用传统双水相系统在中药有效成分纯化中的应用中药成分中药成分 双水相体系双水相体系 分离效率分离效率 甘草酸甘草酸 聚乙二醇聚

45、乙二醇/硫酸铵硫酸铵 92.2%芦丁芦丁 聚乙二醇聚乙二醇/吐温吐温/硫酸铵硫酸铵 95.0%银杏黄酮银杏黄酮 聚乙二醇聚乙二醇/磷酸钾磷酸钾 98.2%水杨酸水杨酸 乙二醇乙二醇/聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮/硫酸铵硫酸铵 102.10%第35页，共56页，编辑于2022年，星期五双水相萃取法应用于从白萝卜中提取过氧化物酶双水相萃取法应用于从白萝卜中提取过氧化物酶不同工艺制备过氧化物酶的各项指标不同工艺制备过氧化物酶的各项指标 粗酶粗酶 传统盐析法传统盐析法 双水相萃取法双水相萃取法蛋白含量蛋白含量(mg)132.573 2.409 4.196比活比活(O.D./mg min)0.077 4

46、3.308 31.173纯化倍数纯化倍数 559.5 402.8总酶力总酶力 10.2 104.3 130.8提取率提取率/%0.0663 0.0012 0.0021第36页，共56页，编辑于2022年，星期五双水相体系在金属离子分离中的应用双水相体系在金属离子分离中的应用第37页，共56页，编辑于2022年，星期五金金属属离离子子间间的的双双水水相相体体系系液液-液液萃萃取取分分离离是是在在高高聚聚物物/盐盐/萃萃取取剂剂中中,通通过过控控制制一一定定的的条条件件,使使目目的的金金属属离离子子被被定定量量萃萃取取到到高高聚聚物物相相,其其它它金金属属离离子子不不被被萃取而留在下层水相萃取而留

47、在下层水相,从而实现混合金属离子之间的分离。从而实现混合金属离子之间的分离。第38页，共56页，编辑于2022年，星期五双水相生物催化技术双水相生物催化技术双双水水相相生生物物催催化化技技术术的的基基本本原原理理是是:利利用用两两种种不不同同高高聚聚物物的的水水溶溶液液或或一一种种高高聚聚物物和和一一种种无无机机盐盐的的水水溶溶液液,因因其其浓浓度度不不同同而而形形成成互互不不相相溶溶的的两两液液相相体体系系,调调整整浓浓度度将将反反应应物物和和生生物物催催化化剂剂分分配配于于下下相相,产产物物分分配配于于上上相相,实实现现生生物物反反应应与与产产物物分分离离的的耦耦合合。该该技技术术有有利利

48、于于消消除除产产物物抑抑制制和和解解决决催催化化剂剂回回收收问问题题,提提高高催催化化反反应应的的效效率率,简简化化产产物物的的分分离离工工艺艺,降降低低投投资资和和操操作费用。作费用。用用青青霉霉素素G G酰酰基基转转移移酶酶为为催催化化剂剂,在在以以PEG400/PEG400/硫硫酸酸镁镁组组成成的的双双水水相相体体系系中中合合成成头头孢孢氨氨苄苄,酶酶反反应应35 35 h h 后后仍仍然然有有80.16 80.16%的的活活力力。产产物物的的产产率率可以达到可以达到60%,60%,而传统反应体系中产率只能达到而传统反应体系中产率只能达到21%21%。用用水水溶溶性性高高聚聚物物Eudr

49、agit Eudragit S2100 S2100 固固定定化化糜糜蛋蛋白白在在PEG/PEG/Dextran Dextran 双双水水相相体体系系中中催催化化酪酪蛋蛋白白水水解解,84,84%的的产产物物分分配配到到了了dextran dextran 相相,而而酶酶可可以以通通过体系过体系pH pH 值的降低值的降低(pH7.16(pH7.163.18)3.18)从从PEGPEG相中分离相中分离出来出来,然后再回调然后再回调pH pH 值即可重新溶解、重复使用。值即可重新溶解、重复使用。第39页，共56页，编辑于2022年，星期五双水相萃取泰乐菌素双水相萃取泰乐菌素泰乐菌素是禽畜专用的大环内

50、酯类抗生素泰乐菌素是禽畜专用的大环内酯类抗生素,能预防和治疗各种禽畜多能预防和治疗各种禽畜多发病症发病症,在国际上被广泛用作饲料添加剂在国际上被广泛用作饲料添加剂,在国内需求量也很大。在国内需求量也很大。提取部分的成本占到总生产成本的提取部分的成本占到总生产成本的70%70%左右。左右。14%PEG4000 14%PEG4000 和和20%Na20%Na2 2HPOHPO4 4 构构成成的的双双水水相相对对泰泰乐乐菌菌素素进进行行全全发发酵酵液液萃萃取取,小小试试收收率率52.14%52.14%,省省去去了了过过滤滤操操作作,只只需需调调节节一一次次pH,pH,减减少少了了泰泰乐乐菌菌素的失活