第4章--发酵工业无菌技术课件.ppt

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1、第4章 发酵工业无菌技术本章内容本章内容一、一、概念概念二、二、发酵工业污染的防治策略发酵工业污染的防治策略三、三、发酵工业的无菌技术发酵工业的无菌技术四、四、培养基及设备灭菌培养基及设备灭菌五、五、空气除菌空气除菌一、概念：一、概念：灭菌、消毒、除菌、灭菌、消毒、除菌、防腐防腐v灭灭菌菌(sterilization):用用化化学学或或物物理理方方法法杀杀死死物物料料或或设设备备中中所所有有生命物质的过程。有有生命物质的过程。消消毒毒(disinfection):用用物物理理或或化化学学方方法法杀杀死死空空气气、地地表表以以及及容容器和器具表面的微生物。器和器具表面的微生物。除除菌菌(dege

2、rmation):用用过过滤滤方方法法除除去去空空气气或或液液体体中中的的微微生生物物及其孢子。及其孢子。防防腐腐(antisepsis):用用物物理理或或化化学学方方法法杀杀死死或或抑抑制制微微生生物物的的生长和繁殖生长和繁殖。v消毒与灭菌的区别消毒与灭菌的区别v消毒与灭菌在发酵工业中的应用消毒与灭菌在发酵工业中的应用二、发酵工业污染的防治策略二、发酵工业污染的防治策略（一）（一）污染的危害污染的危害（二）（二）污染的防治污染的防治1.1.染菌的不良后果染菌的不良后果 v消耗营养消耗营养v合合成成新新产产物物；菌菌体体自自溶溶、发发粘粘等等造造成成分分离离困难困难v改变改变pHv分解产物分解

3、产物v噬菌体破坏极大噬菌体破坏极大2.染菌危害的具体分析染菌危害的具体分析（1）染菌对不同菌种发酵的影响染菌对不同菌种发酵的影响A细菌细菌v谷谷氨氨酸酸：发发酵酵周周期期短短，培培养养基基不不太太丰丰富富，较较少染杂菌，但噬菌体威胁大。少染杂菌，但噬菌体威胁大。v肌肌苷苷：缺缺陷陷型型生生产产菌菌，培培养养基基丰丰富富，易易染染菌菌，营营养养成成分分迅迅速速被被消消耗耗，严严重重抑抑制制菌菌生生长长和和合成代谢产物。合成代谢产物。B.霉菌霉菌vPenG：青青霉霉素素水水解解酶酶上上升升，PenG迅迅速速破破坏坏，发酵一无所获。发酵一无所获。v柠柠檬檬酸酸：pH2.0，不不易易染染菌菌，主主要要

4、防防止止前前期期染染菌。菌。C.酵母菌酵母菌:易污染细菌以及野生酵母菌易污染细菌以及野生酵母菌D.疫疫苗苗：无无论论污污染染的的是是活活菌菌、死死菌菌或或内内外外毒毒素素，都应全部废弃。都应全部废弃。（1）染菌对不同菌种发酵的影响染菌对不同菌种发酵的影响（2）染菌种类对发酵的影响染菌种类对发酵的影响v青霉素：青霉素：怕染细短产气杆菌怕染细短产气杆菌v链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌v四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌v柠檬酸：怕染青霉菌柠檬酸：怕染青霉菌v肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆

5、菌v谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响）不同发酵时期染菌对发酵的影响v种子扩大时期染菌种子扩大时期染菌:v发酵前期染菌发酵前期染菌：v发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵抗生素发酵柠檬酸发酵柠檬酸发酵a.污染细菌：加大通风，加速产酸，调污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制抑制细菌细菌b.污染酵母：加入污染酵母：加入0.0250.035g/LCuSO4抑制酵母；抑制酵母

6、；通风加大，加速产酸。通风加大，加速产酸。灭菌后弃去灭菌后弃去应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响）不同发酵时期染菌对发酵的影响柠檬酸发酵柠檬酸发酵c.染染黄黄曲曲霉霉：加加入入另另一一罐罐将将近近发发酵酵成成熟熟的的醪醪液液，pH下下降，黄曲霉自溶。降，黄曲霉自溶。d.青霉菌：在青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。很低下能够生长。提前放罐。v发发酵酵后期污染后期污染染菌量不太多，可继续发酵染菌量不太多，可继续发酵污染严重，则提前放罐污染严重，则提前放罐杀菌剂的添加：杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本前期

7、无必要，增加成本；发现后加入，效果要具体评价发现后加入，效果要具体评价（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响v丝状菌发酵被产酸菌污染：丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难溶，发酵液粘度增加，过滤困难处理方法：处理方法：将发酵液加热后再加助滤剂；将发酵液加热后再加助滤剂；先加絮凝先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀。剂使蛋白质凝聚后沉淀。v杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间用溶媒萃取的提取工艺非常

8、不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化。极易发生乳化。1.染菌的检查与判断染菌的检查与判断v显微镜检查法显微镜检查法镜检出杂菌需要一定时间镜检出杂菌需要一定时间v平板划线培养或斜面培养检查法：菌落平板划线培养或斜面培养检查法：菌落噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑v肉汤培养检查法肉汤培养检查法v发酵过程的异常现象判断发酵过程的异常现象判断DO2水平异常变化水平异常变化pH异常变化异常变化尾气尾气CO2异常变化异常变化12污染原因分析污染原因分析 v主要原因：主要原因：种子带菌种子带菌无菌空气带菌无菌空气带菌设备渗漏设备渗漏灭菌不彻底灭菌不彻底操作失误操作失误技术管

9、理不善技术管理不善预防预防v种子带菌的防治种子带菌的防治灭菌彻底灭菌彻底接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠靠保藏可靠保藏可靠v过滤空气带菌的防治过滤空气带菌的防治v设备的渗漏或设备的渗漏或“死角死角”造成的染菌及其防治造成的染菌及其防治“死角死角”v发酵罐的发酵罐的“死角死角”法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件件口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进口：人孔（或手孔）、排风管接口

10、、灯孔、视镜口、进料管口料管口发酵罐罐底发酵罐罐底脓疱状积垢脓疱状积垢造成造成“死角死角”消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀放汽边阀v管道安装不当或配置不合理管道安装不当或配置不合理形成的形成的“死角死角”发酵罐罐底脓疱状积垢造成发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角死角”法兰连接不当造成的法兰连接不当造成的“死角死角”灭菌时蒸汽不易通达的灭菌时蒸汽不易通达的“死角死角”及其消除方及其消除方法法v培养基与设备灭菌不彻底的防治培养基与设备灭菌不彻底的防治原料性状：大颗粒的原料过筛除去。原料性状：大颗粒的原料过筛除去。实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。实罐灭

11、菌时要充分排除罐内冷空气。灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂防止泡沫升顶防止泡沫升顶连消不彻底连消不彻底：最好采用自动控制装置：最好采用自动控制装置灭菌后期罐压骤变灭菌后期罐压骤变 死角死角v操作不当造成染菌操作不当造成染菌 v噬菌体染菌及其防治噬菌体染菌及其防治 预防预防采取哪些措施能够保持无菌发酵？采取哪些措施能够保持无菌发酵？v物料、培养基、中间补料要灭菌；物料、培养基、中间补料要灭菌；v发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；v好气发

12、酵通入的空气要除菌；好气发酵通入的空气要除菌；v种子无污染；接种无菌操作过关种子无污染；接种无菌操作过关；v为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。有关细菌耐热性的特性有关细菌耐热性的特性（1）热热力力致致死死速速率率曲曲线线或或活活菌菌残存数曲线残存数曲线微微生生物物及及其其芽芽孢孢的的热热处处理理死死亡亡数数是是按按指指数数递递减减或或按按对对数数循循环环下降的。下降的。若若以以纵纵坐坐标标为为物物料料单单位位值值内内细细胞胞数数或或芽芽孢孢数数的的对对数数值值，以以横横坐坐标标为为热热处处理理时时间间，可可得得到到一一直直线线热热力力致致死死速速率

13、率曲曲线线或或活菌残存数曲线。活菌残存数曲线。图图1热力致死速率曲线热力致死速率曲线DDDDDD（2）D值值v图图1表表明明，直直线线横横过过一一个个对对数数循循环环时时所所需需要要的的时时间间（分分钟钟）就就是是D值值（Decimalreductiontime）。也也就就是是直直线线斜斜率率的倒数。直线斜率实际反映了细菌的死亡速率。的倒数。直线斜率实际反映了细菌的死亡速率。vD值值的的定定义义就就是是在在一一定定的的处处理理环环境境中中和和在在一一定定的的热热力力致致死死温温度度条条件件下下某某细细菌菌数数群群中中每每杀杀死死90%原原有有残残存存活活菌菌数数时所需要的时间。时所需要的时间。

14、vD值值越越大大，细细菌菌的的死死亡亡速速率率越越慢慢，即即该该菌菌的的耐耐热热性性越强。越强。v因此因此D值大小和细菌耐热性的强度成正比。值大小和细菌耐热性的强度成正比。v注意：注意：D值不受原始菌数影响值不受原始菌数影响vD值值随随热热处处理理温温度度、菌菌种种、细细菌菌活活芽芽孢孢所所处处的的环环境境和其它因素而异。和其它因素而异。表表1瞬间加热和冷却条件下单位时间为瞬间加热和冷却条件下单位时间为D时的细菌死亡速率时的细菌死亡速率单位时间为单位时间为D时的加热时间（分钟）时的加热时间（分钟）单位容积残存活菌数单位容积残存活菌数0D1041D1032D1023D1014D1005D10-1

15、6D10-27D10-38D10-4v从从表表1可可以以看看出出，从从5D以以后后，为为负负指指数数，也也就就是是说说有有1/101/10000活菌残存下来的可能。活菌残存下来的可能。v细细菌菌和和芽芽孢孢按按分分数数出出现现并并不不显显示示，这这只只是是表表明明理理论论上上很难将活菌完全消灭掉。很难将活菌完全消灭掉。v实实际际上上，这这应应该该从从概概率率的的角角度度来来考考虑虑，如如果果100支支试试管管中中各各有有1ml悬悬浮浮液液，每每ml悬悬浮浮液液中中仅仅含含有有1个个芽芽孢孢，经经过过5D处处理理后后，残残存存菌菌数数为为10-1，即即1/10活活10/100，也也就就是是100

16、支支试试管管中中可可能能有有90支支不不再再有有活活菌菌存存在在，而而10支支尚尚有活菌的可能。有活菌的可能。vD值值可可以以根根据据图图1中中直直线线横横过过一一个个对对数数循循环环所所需需的的热热处处理理时时间间求求得得。当当然然也也可可以以根根据据直直线线方方程程式式求求得得，因为它为直线斜率的倒数，即：因为它为直线斜率的倒数，即：v例例1：100热处理时，原始菌数为热处理时，原始菌数为1104，热处理，热处理3分钟后分钟后残存的活菌数是残存的活菌数是1101，求该菌，求该菌D值。值。即即D100或或D110=1.00Z（3）热力致死时间曲线（）热力致死时间曲线（TDT曲线）曲线）vTh

17、ermalDeathTime：热热力力温温度度保保持持恒恒定定不不变变，将将处处于于一一定定条条件件下下的的悬悬浮浮液液中中某某一一菌菌种种的的细细胞胞或或芽芽孢孢全全部部杀杀死死所所必必需需的的最最短短热热处理时间。处理时间。图图2热力致死时间曲线热力致死时间曲线v细细菌菌的的热热力力致致死死时时间间随随致致死死温温度度而而异异。它它表表示示了不同热力致死温度时细菌芽孢的相对耐热性。了不同热力致死温度时细菌芽孢的相对耐热性。v与与热热力力致致死死速速率率曲曲线线一一样样，若若以以热热处处理理温温度度为为横横坐坐标标，以以热热处处理理时时间间为为纵纵坐坐标标（对对数数值值），就得到一条直线，即

18、热力。就得到一条直线，即热力。v表明热力致死规律同样按指数递降进行。表明热力致死规律同样按指数递降进行。vZ值的概念：值的概念：直线横过一个对数循环所需要改变直线横过一个对数循环所需要改变的温度数（的温度数（）。v换句话说：换句话说：Z值为热力致死时间按照值为热力致死时间按照1/10，或，或10倍倍变化时相应的加热温度变化（变化时相应的加热温度变化（）。）。vZ值越大，因温度上升而取得的杀菌效果就越小。值越大，因温度上升而取得的杀菌效果就越小。v通常用通常用121（国外用（国外用250F或或121.1）作为标准温）作为标准温度，该温度下的热力致死时间用符号度，该温度下的热力致死时间用符号F来表

19、示，并称来表示，并称为为F值值。vF值的定义就是在值的定义就是在121.1温度条件下杀死温度条件下杀死一定浓度一定浓度的的细菌所需要的时间细菌所需要的时间F值与原始菌数是相关的。值与原始菌数是相关的。若若T2=121.1，则，则t2=F（4）热力指数递减时间（）热力指数递减时间（TRT）v为为了了计计算算杀杀菌菌时时间间时时将将细细菌菌指指数数递递减减因因素素考考虑虑在在内内，将将D值值概概念念进进一一步步扩扩大大，提提出出了了热热力力指指数数递递减减时时间间（TRT）概念。）概念。vTRT定定义义就就是是在在任任何何特特定定热热力力致致死死温温度度条条件件下下将将细细菌菌或或芽芽孢孢数数减减

20、少少到到某某一一程程度度如如10-n（即即原原来来活活菌菌数数的的1/10n）时所需要的热处理时间（分钟）。）时所需要的热处理时间（分钟）。vTRTn=nD即曲线横过即曲线横过n个对数循环时所需要的热处个对数循环时所需要的热处理时间。理时间。vTRTn值与值与D值一样不受原始菌数的影响。值一样不受原始菌数的影响。vTRT值的应用为运用概率说明细菌死亡情况建立了值的应用为运用概率说明细菌死亡情况建立了基础。基础。v如如121温度杀菌时温度杀菌时TRT12=12D，即经，即经12D分钟杀菌分钟杀菌后罐内致死率为后罐内致死率为D值的主要杀菌对象值的主要杀菌对象芽孢数将芽孢数将降低到降低到10-12。

21、（5）仿热力致死时间曲线）仿热力致死时间曲线v纵纵坐坐标标为为D对对数数值值，横横坐坐标标为为加加热热温温度度，加加热热温温度度与与其其对对应应的的D对对数数值值呈呈直直线线关关系。系。Z图图3仿热力致死时间曲线仿热力致死时间曲线v若若T2=121.1，则，则t2=Fv假定假定T1温度下的温度下的D值已知，则，值已知，则，t1=nD，则，则D、F、Z值之间的关系可以通过下式转换。值之间的关系可以通过下式转换。或或v这样，已知这样，已知T温度下的温度下的D值，值，Z值，再针对罐头产品值，再针对罐头产品需要确定需要确定n值后，就可计算得到相应的值后，就可计算得到相应的F值。值。vn值并非固定不变，

22、要根据工厂和食品的原始菌数值并非固定不变，要根据工厂和食品的原始菌数或着污染菌的重要程度而定。或着污染菌的重要程度而定。v比如在美国，对肉毒杆菌，要求比如在美国，对肉毒杆菌，要求n=12，对生芽梭状，对生芽梭状芽孢杆菌，芽孢杆菌，n=5。v例例2v在某杀菌条件下，在在某杀菌条件下，在121.1用用1min恰好将菌全部杀灭；现恰好将菌全部杀灭；现改用改用110、10min处理，问能否达到原定的杀菌目标？设处理，问能否达到原定的杀菌目标？设Z=10。例例3.2解解已已知知：T1=110，t1=10 min，T2=121.1，t2=1 min，Z=10。利利用用TDT曲曲线线方方程程，将将110、1

23、0min转转化化成成121.1下下的的时时间间t2，则，则t2=0.78mint2说明未能全部杀灭细菌。那么在说明未能全部杀灭细菌。那么在110下需要多长时间才够下需要多长时间才够呢？仍利用上式，得呢？仍利用上式，得t1=12.88min例例3:某某产产品品净净重重454g，含含有有D121.1=0.6min、Z=10的的芽芽孢孢12个个/g；若若杀杀菌菌温温度度为为110，要要求求效效果果为为产产品品腐腐败败率率不不超过超过0.1%。求：。求：（1）理论上需要多少杀菌时间？）理论上需要多少杀菌时间？（2）杀杀菌菌后后若若检检验验结结果果产产品品腐腐败败率率为为1%，则则实实际际原原始始菌数是

24、多少？此时需要的杀菌时间为多少？菌数是多少？此时需要的杀菌时间为多少？例例3解解:（1）F0=D（lgalgb）=0.6(lg5448lg0.001)=4.042minF110=F0lg-1(121.1110)/10=52.1min（2）F0=0.6(lgalg0.01)=4.042min lga=lg0.01+4.042/0.6a=54480，即芽孢含量为，即芽孢含量为120个个/g。此时，此时，F0=D(lgalgb)=0.6(lg54480lg0.001)=4.642minF110=4.642lg-1(121.1110)/10=59.8min例例：有有一一发发酵酵罐罐，内内装装培培养养基

25、基40m3，在在121的的温温度度下下进进行行实实罐罐灭灭菌菌。设设每每毫毫升升培培养养基基含含有有耐耐热热菌菌的的芽芽孢孢2107个个，在在121时时的的灭灭菌菌速速率率常常数数为为0.0287s-1。试试求求灭灭菌菌失失败败的的机率为机率为0.001所需的时间。所需的时间。解：解：例例：有有培培养养基基30m3，在在125的的温温度度下下进进行行6m3/h连连续续灭灭菌菌。设设每每毫毫升升培培养养基基含含有有耐耐热热菌菌的的芽芽孢孢105个个，在在125时时的的灭灭菌菌速速率率常常数数为为11min-1。试试求求灭灭菌菌维维持持时时间间和维持罐体积。和维持罐体积。解：每分钟处理解：每分钟处

26、理0.1m3有有取停留取停留8min除菌的方法除菌的方法v培养基的加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法）培养基的加热灭菌（包括常压或蒸汽高压加热法）v空气的过滤除菌空气的过滤除菌v紫外线或电离辐射紫外线或电离辐射v化学药物灭菌化学药物灭菌（一）高温杀菌作用的种类（一）高温杀菌作用的种类v高高温温致致死死原原理理：由由于于它它使使微微生生物物的的蛋蛋白白质质和和核核酸酸等等重重要要生生物物高高分分子子发发生生变变性性、破破坏坏，例例如如它它可可使使核核酸酸发发生生脱脱氨氨、脱脱嘌嘌呤呤或或降降解解，以以及及破破坏坏细细胞胞膜膜上上的的类类脂脂质质成成分等。分等。v湿湿热热灭灭菌菌要要比比干干热热灭

27、灭菌菌更更有有效效，这这一一方方面面是是由由于于湿湿热热易易于于传传递递热热量量，另另一一方方面面是是由由于于湿湿热热更更易易破破坏坏保保持持蛋蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。1干干热热灭灭菌菌法法，将将金金属属制制品品或或清清洁洁玻玻璃璃器器皿皿放放入入电电热热烘烘箱箱内内，在在150170下下维维持持12小小时时后后，即即可可达达到到彻底灭菌的目的。彻底灭菌的目的。在在这这种种条条件件下下，可可使使细细胞胞膜膜破破坏坏、蛋蛋白白质质变变性性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。灼灼烧烧，是是一一种种最

28、最彻彻底底的的干干热热灭灭菌菌方方法法，但但它它只只能能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。用于接种环、接种针等少数对象的灭菌。2湿热灭菌法湿热灭菌法v湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。v多多数数细细菌菌和和真真菌菌的的营营养养细细胞胞在在60左左右右处处理理510min后即可杀死；后即可杀死；v酵酵母母菌菌和和真真菌菌的的孢孢子子稍稍耐耐热热些些，要要用用80以以上上的的温温度处理才能杀死；度处理才能杀死；v而而细细菌菌的的芽芽孢孢最最耐耐热热，一一般般要要在在120下下处处理理15min才能杀死。才能杀死。（1）常压法）常压法v巴巴氏氏消消毒毒法法（pasteur

29、ization）用用于于牛牛奶奶、啤啤酒酒、果果酒酒和和酱酱油油等等不不能能进进行行高高温温灭灭菌菌的的液液体体的的一一种种消消毒毒方方法法，其其主主要要目目的的是是杀杀死死其其中中无无芽芽孢孢的的病病原原菌菌（如如牛牛奶奶中中的的结结核核杆杆菌菌或或沙沙门门氏氏菌菌），而而又又不不影影响响它它们们的的风味。风味。v巴氏消毒法是一种低温消毒法巴氏消毒法是一种低温消毒法v低温维持法：在低温维持法：在63下保持下保持30分钟可进行牛奶消毒；分钟可进行牛奶消毒；v高高温温瞬瞬时时法法：用用于于牛牛奶奶消消毒毒时时只只要要在在72下下保保持持15秒钟即可。秒钟即可。v间间歇歇灭灭菌菌法法，又又称称丁丁

30、达达尔尔灭灭菌菌法法或或分分段段灭灭菌菌法法。适适用于不耐热培养基的灭菌。用于不耐热培养基的灭菌。v方方法法是是：将将待待灭灭菌菌的的培培养养基基在在80100下下蒸蒸煮煮1560分分钟钟，以以杀杀死死其其中中所所有有微微生生物物的的营营养养细细胞胞，然然后后置置室室温温或或37下下保保温温过过夜夜，诱诱导导残残留留的的芽芽孢孢发发芽芽，第第二二天天再再以以同同法法蒸蒸煮煮和和保保温温过过夜夜，如如此此连连续续重重复复3天天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。（2）加压法）加压法v常规加压灭菌法常规加压灭菌法v盛盛有有适适量量水水的的加加压压蒸蒸汽汽灭灭菌

31、菌锅锅加加热热煮煮沸沸，彻彻底底驱驱尽尽后后将将锅锅密密闭闭，再再继继续续加加热热至至121（压压力力为为1kgcm2或或15磅磅英英寸寸2），时时间间维维持持1520分分钟钟，也也可可采采用用在在较较低低的的温温度度（115，即即0.7kgcm2或或10磅磅英寸英寸2）下维持）下维持35分钟的方法。分钟的方法。v此此法法适适合合于于一一切切微微生生物物学学实实验验室室、医医疗疗保保健健机机构构或或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。连续加压灭菌法连续加压灭菌法v在在发发酵酵行行业业里里也也称称“连连消消法法”。此此法法只只在在大大规规模模的的发

32、酵工厂中作培养基灭菌用。发酵工厂中作培养基灭菌用。v主主要要操操作作：将将培培养养基基在在发发酵酵罐罐外外连连续续不不断断地地进进行行加加热热、维维持持和和冷冷却却，然然后后才才进进入入发发酵酵罐罐。培培养养基基一一般在般在135140下处理下处理515秒钟。秒钟。连续加压灭菌法优点连续加压灭菌法优点因因采采用用高高温温瞬瞬时时灭灭菌菌，故故既既可可杀杀灭灭微微生生物物，又又可可最最大大限限度度减减少少营营养养成成分分的的破破坏坏，从从而而提提高高了了原原料料的的利利用用率率，比比“实罐灭菌实罐灭菌”（120，30分钟）提高产量分钟）提高产量510；由由于于总总的的灭灭菌菌时时间间较较分分批批

33、灭灭菌菌注注明明显显减减少少，所所以以缩缩短短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利用率；由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率；适宜于自动化操作；适宜于自动化操作；降低了操作人员的劳动强度。降低了操作人员的劳动强度。（二）影响加压蒸汽灭菌效果的因素（二）影响加压蒸汽灭菌效果的因素v（1）灭菌物体含菌量的影响。）灭菌物体含菌量的影响。v 天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成的培养天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成的培养基，一般含菌量较高，而用纯粹化学试剂配制成的基，一般含菌量较高，而用纯粹化学试剂配制成的组合培养基，

34、含菌量低。组合培养基，含菌量低。v（2）灭菌锅内空气排除程度的影响）灭菌锅内空气排除程度的影响v检验灭菌锅内空气排除度，可采用多种方法。最检验灭菌锅内空气排除度，可采用多种方法。最好的办法是灭菌锅上同时装有压力表和温度计，其次好的办法是灭菌锅上同时装有压力表和温度计，其次是将待测气体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听到是将待测气体通过橡胶管引入深层冷水中，如只听到“扑扑扑扑”声而未见有气泡冒出，也可证明锅内已是纯声而未见有气泡冒出，也可证明锅内已是纯蒸汽了。蒸汽了。v（3）灭菌对象）灭菌对象pH的影响的影响v（4）灭菌对象的体积。要防止用常规的压力和时间在）灭菌对象的体积。要防止用常规的压力和时

35、间在加压灭菌锅内进行大容量培养基的灭菌。加压灭菌锅内进行大容量培养基的灭菌。v（5）加热与散热速度。这两段时间也对灭菌效果和培）加热与散热速度。这两段时间也对灭菌效果和培养基成分发生影响。为了使科学研究的结果有良好的养基成分发生影响。为了使科学研究的结果有良好的重演性，在灭菌操作中对这些技术细节都应加以注意。重演性，在灭菌操作中对这些技术细节都应加以注意。（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止消除高温有害影响的措施消除高温有害影响的措施v（1）采用特殊加热灭菌法）采用特殊加热灭菌法v（2）对对易易破破坏坏的的含含糖糖培培养养基基进进行行灭灭菌菌时时，应

36、应先先将将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；糖液与其他成分分别灭菌后再合并；v（3）对对含含Ca2+或或Fe3+的的培培养养基基与与磷磷酸酸盐盐先先作作分分别别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌（在培养基）可进行低压灭菌（在112即即0.57kgcm2或或8磅英寸磅英寸2下灭菌下灭菌15分钟）或间歇灭菌；分钟）或间歇灭菌；（5）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行）在大规模发酵工业中，可采用连续加压灭菌法进行培养基的灭菌培养基

37、的灭菌(二二)灭菌设备灭菌设备l、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很生产中使用高压蒸汽灭菌锅的型号很多多手提式灭菌锅，容量小，多用于母种培养基灭菌。手提式灭菌锅，容量小，多用于母种培养基灭菌。立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培种培养立式或卧式灭菌锅较大，多用于原种或少量栽培种培养基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。基的灭菌，一般能装几十瓶或几百瓶。灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培灭菌柜要和蒸汽锅炉配套，用于大量的原种和栽培种培养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶养基的灭菌，一次能装几百至几千瓶(袋袋)。但投资太大，。但投资太大，适合大型菌种场使用。适合

38、大型菌种场使用。v2常压蒸汽灭菌锅常压蒸汽灭菌锅常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、常压蒸汽灭菌锅是用铁锅、砖、水泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专业户水泥砌成的，造价低，适于一般生产单位和专业户使用。大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料使用。大小可根据需要而定，但最大的锅每次装料也最好不超过也最好不超过500公斤。公斤。3烘箱烘箱烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，烘箱主要是用于玻璃器皿的干燥和灭菌，也可用于其它物品烘干。也可用于其它物品烘干。三、灭菌的实际操作三、灭菌的实际操作v（一）空罐灭菌（一）空罐灭菌 v空空罐罐灭灭菌菌也也称称空空消消。无无论论是是种种子子罐罐、发发酵酵罐罐、还还是是

39、尿尿素素（或或液液氨氨）罐罐、消消泡泡罐罐，当当培培养养基基（或或物物料料）尚尚未未进进罐罐前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。前对罐进行预先灭菌，为空罐灭菌。v为为了了杀杀死死所所有有微微生生物物特特别别是是耐耐热热的的的的芽芽孢孢，空空罐罐灭灭菌菌要要求求温温度度较较高高，灭灭菌菌时时间间较较长长，只只有有这这样样才才能能杀杀死死设设备备中中各死角残存的杂菌或芽孢。各死角残存的杂菌或芽孢。v（二）实罐灭菌（二）实罐灭菌 v将将培培养养基基置置于于发发酵酵罐罐中中用用蒸蒸汽汽加加热热，达达到到预预定定灭灭菌菌温温度度后后，维维持持一一定定时时间间，再再冷冷却却到到发发酵酵温温度度，然然后后接接种

40、种发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。发酵，这叫做实罐灭菌，又称分批灭菌。v操作要点：操作要点：v三三路路进进汽汽：直直接接蒸蒸汽汽从从通通风风、取取样样和和出出料料口口进进入入罐罐内内直直接接加加热热，直直到到所所规规定定的的温温度度，并并维维持持一一定定的的时时间间。这就是所谓的这就是所谓的“三路进气三路进气”。培养基连消工艺流程图培养基连消工艺流程图喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程v（2）过滤除菌法）过滤除菌法v是是将将液液体体或或气气体体用用微微孔孔薄薄膜膜过过滤滤，使使大大于于孔孔径径的的细细菌菌等等微微生生物物颗颗粒粒阻阻留留，从从而而达达到到除除菌菌目目的的。在在体体外外

41、培培养养时时，过过滤滤除除菌菌大大多多用用于于遇遇热热容容易易变变性性而而失失效效的的试剂或培养液。试剂或培养液。v目目前前，大大多多实实验验室室采采用用微微孔孔滤滤膜膜滤滤器器除除菌菌。关关键键步步骤骤是是安装滤膜及无菌过滤过程。安装滤膜及无菌过滤过程。v滤滤膜膜过过滤滤装装置置、烧烧结结玻玻璃璃滤滤板板过过滤滤器器、石石棉棉板板过过滤滤器器（Seitz滤滤器器）、素素烧烧瓷瓷过过滤滤器器以以及及硅硅藻藻土土过过滤滤器器等等。过过滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体。滤除菌的缺点是无法去除其中的病毒和噬菌体。v（3）其他方法）其他方法v在在配配制制培培养养基基时时，为为避避免免发发生生沉

42、沉淀淀，一一般般应应按按配配方方逐一加入各种成分。逐一加入各种成分。v另另外外，加加入入0.01EDTA或或0.01NTA（氮氮川川三三乙乙酸酸）等螯合剂到培养基中，可防止金属离子发生沉淀。等螯合剂到培养基中，可防止金属离子发生沉淀。v最最后后，还还可可以以用用气气体体灭灭菌菌剂剂如如氧氧化化乙乙烯烯等等对对个个别别成成分进行灭菌处理。分进行灭菌处理。三、化学杀菌剂或制菌剂三、化学杀菌剂或制菌剂（一）表面消毒剂（一）表面消毒剂v常常用用消消毒毒剂剂的的种种类类很很多多，它它们们的的杀杀菌菌强强度度各各不不相相同同。但但几几乎乎都都有有一一个个共共同同规规律律，即即当当其其在在极极低低浓浓度度时

43、时，常常常常会会对对微微生生物物的的生生命命活活动动起起刺刺激激作作用用，随随着着浓浓度度逐逐渐渐增增高高，就就相相继继出出现现制制菌菌和和杀杀菌菌作作用用，因因而而形形成成一一个个连连续续的的作作用用谱。谱。v表表面面消消毒毒剂剂是是指指对对一一切切活活细细胞胞都都有有毒毒性性，不不能能用用作作活活细细胞内的化学治胞内的化学治疗疗用的化学用的化学药剂药剂。v为为比比较较各各种种表表面面消消毒毒剂剂的的相相对对杀杀菌菌强强度度，常常采采用用在在临临床床上上最最早早使使用用的的消消毒毒剂剂石石炭炭酸酸作作为为比比较较的的标标准，并提出了石炭酸系数这一指标。准，并提出了石炭酸系数这一指标。v所所谓

44、谓石石炭炭酸酸系系数数，指指在在一一定定时时间间内内被被试试药药剂剂能能杀杀死死全全部部供供试试菌菌的的最最高高稀稀释释度度与与达达到到同同效效的的石石炭炭酸酸的的最最高高稀稀释释度度的的比比率率。一一般般规规定定处处理理时时间间为为10分分钟钟，而而供试菌定为供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。（伤寒沙门氏菌）。消消 毒毒 试试 验验 v以以人人工工染染菌菌实实物物为为消消毒毒对对象象，模模拟拟现现场场表表面面污污染染大大肠肠杆菌液。杆菌液。v消消毒毒前前采采样样：放放置置无无菌菌规规格格板板，取取无无菌菌棉棉拭拭于于含含5ml稀稀释释液液试试管管中中沾沾湿湿，在在规规

45、格格板板空空心心处处旋旋转转自自左左至至右右涂涂抹抹整个区域。整个区域。v消消毒毒后后采采样样：在在前前采采样样地地点点旁旁用用0.05过过氧氧乙乙酸酸溶溶液液消消毒毒物物体体表表面面，30分分钟钟后后将将无无菌菌棉棉拭拭于于含含5ml采采样样液液试试管中沾湿，作为消毒后样液。管中沾湿，作为消毒后样液。v将消毒前后样液充分振荡摇匀后稀释。将消毒前后样液充分振荡摇匀后稀释。v培养待凝固后培养待凝固后37培养培养2448小时，作菌落计数。小时，作菌落计数。灭菌效果监测灭菌效果监测v、高压蒸气灭菌效果监测、高压蒸气灭菌效果监测v(1)高高压压蒸蒸气气灭灭菌菌指指示示卡卡：将将卡卡片片放放入入灭灭菌菌

46、器器不不同同部部位，观察灭菌后指示卡颜色变化。位，观察灭菌后指示卡颜色变化。v(2)芽芽胞胞菌菌片片法法：将将每每片片染染有有嗜嗜热热脂脂肪肪杆杆菌菌芽芽胞胞105cfu/ml的的菌菌片片包包好好、放放入入灭灭菌菌器器内内。灭灭菌菌后后作作细细菌菌计计数数测测定定。对对照照是是不不经经灭灭菌菌的的菌菌片片，芽芽胞胞完完全全被被杀灭或杀来率达杀灭或杀来率达99.9999为合格。为合格。、紫外线消毒效果监测、紫外线消毒效果监测微微型型紫紫外外线线强强度度计计：使使用用时时打打开开仪仪器器开开关关，装装入入电电池池，打打开开电电源源开开关关，接接通通电电源源，将将测测定定电电压压转转换换开开关关拨拨

47、至至电电压一方，此时指针应超过中线。压一方，此时指针应超过中线。测测定定时时，将将测测定定电电压压转转换换开开关关拨拨至至测测定定一一方方，打打开开紫紫外外线线灯灯照照射射分分钟钟后后，将将紫紫外外线线灯灯强强度度计计置置于于紫紫外外线线灯灯下下垂垂直直的的中中央央进进行行照照射射，直直至至仪仪表表指指针针稳稳定定，所示之值即为该紫外线灯的强度值所示之值即为该紫外线灯的强度值(uw/cm2)。(2)紫外线强度与消毒剂量指示卡：紫外线强度与消毒剂量指示卡：测测定定灯灯管管强强度度时时，将将卡卡片片置置于于离离紫紫外外灯灯管管的的中中央央处处，将将图图案案一一面面朝朝向向灯灯管管，照照射射一一分分

48、钟钟（照照射射时时间间要要准准确确）后后，图图案案正正中中涂涂层层由由白白色色变变为为紫紫红红色。与周围相应色块相比，可测知所照射的强度。色。与周围相应色块相比，可测知所照射的强度。新新灯灯管管以以不不低低于于100uw/cm2为为合合格格，旧旧灯灯管管低低于于70uw/cm2应更换。应更换。空气的净化空气的净化一、空气中微生物的分布一、空气中微生物的分布 v空空气气中中微微生生物物的的含含量量和和种种类类，随随地地区区，季季节节和和空空气气中中灰尘粒子多少，以及人们的活动情况而异。灰尘粒子多少，以及人们的活动情况而异。v北北方方气气候候干干燥燥，寒寒冷冷，空空气气中中的的含含菌菌量量较较多多

49、，离离地地面面越越高高，含含菌菌量量越越少少；一一般般每每升升高高10米米，空空气气中中的的含含菌菌量就降低一个数量级；量就降低一个数量级；v城城市市的的空空气气中中含含菌菌量量较较多多，农农村村的的空空气气中中含含菌菌量量较较少少，一般城市空气中杂菌数为一般城市空气中杂菌数为30008000个米个米3。v空气中的微生物种类以细菌和细菌芽胞较多，也有空气中的微生物种类以细菌和细菌芽胞较多，也有酵母，霉菌和病毒。酵母，霉菌和病毒。v这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为或雾滴上，空气中微生物的含量一般为10310

50、4个个/米米3。v灰尘粒子的平均大小约灰尘粒子的平均大小约0.6m左右，所以空气除菌主左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒要是去除空气中的微粒(0.6-1m）二、空气除菌二、空气除菌 v工工业业发发酵酵对对空空气气处处理理的的要要求求随随发发酵酵产产品品和和菌菌种种不不同同而异。而异。v半半固固体体制制曲曲和和酵酵母母生生产产中中无无菌菌要要求求不不十十分分严严格格，一一般无需复杂的空所净化处理；般无需复杂的空所净化处理；v密密闭闭的的深深层层通通气气发发酵酵需需严严格格的的纯纯净净培培养养，进进入入发发酵酵罐罐前前空空气气必必须须进进行行冷冷却却、脱脱水水、脱脱油油和和过过滤滤除除菌菌等