大肠杆菌代谢物组成的核磁共振分析.pdf
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1、第3 9 卷2 0 1 1 年8 月分析化学(F E N X IH U A X U E)研究报告C h i n e s eJ o u r n a lo fA n a l y t i c a lC h e m i s t r y第8 期1 1 8 6 1 1 9 4大肠杆菌代谢物组成的核磁共振分析叶央芳1,2张利民1安艳捧1豪富华1唐惠儒1(波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉磁共振中心,中国科学院武汉物理与数学研究所,武汉4 3 0 0 7 1)2(宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室。宁波3 1 5 2 1 1)摘要为了认识重要模式生物大肠杆菌的内源性代谢物组成,本研究综合使用一维和二
2、维高分辨核磁共振波谱技术,系统测定了大肠杆菌的代谢物种类和含量。结果表明:核磁共振方法可检测到分别来自多个代谢途径的氨基酸、有机羧酸、糖类、核苷及其衍生物等4 0 多种高丰度代谢物。葡萄糖是稳定期大肠杆菌中含量最丰富的物质;谷氨酸、甜菜碱、腐胺和核糖一5 磷酸的含量次之;其它代谢物的含量都相对较低。这些结果证实N M R 技术能同时有效检测细菌中含量丰富且极性各异的初级和次级代谢产物。关键词大肠杆菌;代谢组;核磁共振(N M R)1引言大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l i)因其遗传背景清楚且易培养而被广泛用作各种生物化学、生物技术研究的模式微生物【1 1。大肠杆菌
3、的基因组、转录组、蛋白质组、相互作用组、代谢组和生理组等方面都得到了不同程度的研究嘲。尽管D N A、m R N A 以及蛋白质的存在为生物过程的发生提供了物质基础,但代谢产物和代谢表型是基因型与环境共同作用的综合结果。因此,代谢组学研究可以揭示生物体的最终生命活动状态及对内源和或外源刺激的综合应答的本质,也是对基因组学和蛋白质组学研究信息的扩展和重要补充口】。尽管目前还没有一种单一的实验方法可获得E c o l i 中全部的代谢物组成信息,但E c o l i 代谢组的研究已取得了迅猛发展,已经从早期的酶学方法 4 5 1 和薄层层析(T L C)方法瞄7 1 演变成以质谱(M S)为主的高
4、通量分析技术I S,9 1。气相色谱一质谱法(G C M S)可检测到E c o l i 的2 0 0 多种代谢物;液相色谱一质谱(L C M S)技术被用于检测不同代谢表型E c o l i 的果糖一1,6 _ 二磷酸、肌苷酸、环磷酸酰苷、苯丙氨酸和组氨酸等特定代谢物的变化“,或被用于分析E c o l i 在碳或氮饥饿状态下6 8 种代谢物的响应特征【1 2】。此外,毛细管电泳电喷雾质谱联用技术(C E-E I M S)也被应用于分析E c o l i 的代谢产物“3 1。但这3 种基于M S 的代谢组研究方法均面临定量分析与代谢物结构的可靠确定等问题。基于核磁共振(N M R)的微生物代
5、谢组学技术在微生物分类“4 1 6 1、突变体筛选1 1 7 1 和污染物降解 1 8 1 方面得到了成功应用,并证实了基于N M R 的代谢组学技术是一种可靠的、高通量的研究方法。该方法通常不需要分离过程就可以对代谢物进行结构确定和定量分析,同时具有良好的重现性。基于N M R 的代谢组数据常常与质谱数据具有较强的互补性,但目前基于N M R 的微生物代谢组学技术对模式生物大肠杆菌的研究相对较少。主要问题包括微生物代谢组的相关核磁共振波谱学基础数据相对不足,大肠杆菌代谢物的结构确定的基础工作也相对缺乏。为了获得这些重要的基础数据,本研究对标准大肠杆菌菌株H B l 0 1 的代谢物进行了系统
6、的结构确定以及半定量分析。2实验部分2 1 菌株、仪器与试剂标准大肠杆菌菌株H B l 0 1A B 9 3 0 5 7 购自中国典型培养物保藏中心。所用的B r u k e rA V I I I6 0 0M H z谱仪(德国B r u k e r 公司),配有超低温探头。乙腈、N a C I、N a i l:P O。2 H 2 0 和K:H P O。3 H:0(分析纯,上2 0 1 0-1 0-2 0 收稿;2 0 1l 一0 卜2 1 接受本文系国家杰出青年科学基金(N o 2 0 8 2 5 5 2 0)、传染病专项基金(N o 2 0 0 9 Z X l 0 6 0 1)、浙江省自然科
7、学基金(N o Y 3 0 9 0 0 4 6)以及宁波大学学科项目(N o x k l 0 9 1 2 0)资助项目+E-m a i l:h u i r u t a n g w i p m a c c n万方数据第8 期叶央芳等:大肠杆菌代谢物组成的核磁共振分析1 1 8 7海国药集团化学试剂有限公司);蛋白胨与酵母膏(武汉市杰辉生物技术有限公司);磷酸盐缓冲液(P B S,p H7 2 7 6,博士德生物工程有限公司);N a N,(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司);重水(9 9 9 氘代)和2,2,3,3 一氘代三甲基硅烷丙酸钠(T S P)购自美国C a m b r i d g e
8、I s o t o p eL a b o r a t o r i e s 公司。2 2实验方法2 2 1 缓冲液和提取液的配制钠钾磷酸缓冲液(0 1m o l LN a i l 2 P 0 4 1 4:H P O。,p H7 4,含1 0 D 2 0,O 1 N a N,0 0 0 5 T S P)用二次蒸馏水配制【l 郫;代谢物提取液由钠钾磷酸盐缓冲液与乙腈按体积比1:1 配制获得。2 2 2 样品的制备和提取挑取大肠杆菌单菌落转接于新鲜配制的L u r i a-B e r t a n i(L B)培养液中,在3 7 活化培养2 4h 后,作为接种源分别转接到6 个含有3 0m LL B 培
9、养基的三角瓶中,一瓶培养液即一个平行样。在3 7 恒温振荡(1 5 0r m i n)培养2 4h 直到稳定期。快速取样,把三角瓶置于冰上以猝灭代谢过程,在4 下以6 0 0 0r m i n 离心5m i n 收集菌体。用P B S 洗涤菌体3 次后,加入6 0 0 L 提取液,菌体经超声破碎(超停各2S,共9 9 次)后,4 下离心(1 2 0 0 0r m i n,1 0m i n)取上清液。残渣使用上述方法重复提取1 次(不需要超声破碎)后,合并2 次上清液,在真空下除去有机溶剂。再次离心(4,1 2 0 0 0r m i n,1 0m i n)后,移取5 5 0l a L 上清液至5
10、m mN M R 核磁管中进行分析。2 2 3N M R 实验所有的N M R 谱均在2 9 8K 下采集,对应的质子共振频率为6 0 0 1 3M H z。使用标准的N o e s y p r l D 脉冲序列(R D 一9 0。-t 卜9 0 _ t m 一9 0 0。a c q u i s i t i o n)采集一维1 HN M R 谱。在该序列中的等待时间(R D,2s)和混合时间(t m,1 0 0m s)施加强度约5 0H z 的低功率连续波进行水峰抑制。每一个样品的9 0。脉冲宽度均设置约1 0u s。谱宽设置为2 0p p m,采样点数3 2k,F I D 累加6 4 次。在
11、傅里叶变换之前,将所有一维1 HN M R 谱的F I D 乘以增宽冈子为1 0H z 的指数窗函数,再以手动方式进行相位和基线校正。为了对N M R 信号进行归属,采集选定样品的1 H 一1 Hc o s Y,1 H 一1 HT O C S Y,1 HJ 分解谱、1 H 一”CH S Q C和1 H _ 1 3 CH M B C 等一系列2 DN M R 谱口叭”。在C O S Y 和T O C S Y 实验中,采样点数分别为2 0 0(F。)和2 0 4 8(F:),间接采样维F 和直接采样维F:的谱宽设置均为6 3 1 3H z,每一条F I D 累加6 4 次。T O C S Y 实验
12、选用M L E V-1 7 组合脉冲进行自旋锁定,混合时间为8 0m s。在1 HJ 分解谱实验中,采样点数为4 8(F)和4 0 9 6(F:),谱宽分别为6 0H z(F。)和6 3 1 3H z(F 2)。经傅立叶变换、零填充后,所得数据矩阵为4 0 9 6 X 6 4,每一条F I D 累加6 4 次。1 H-”C 相关谱实验选用脉冲梯度场选择的n s Q c 和H M B C 序列。H S Q C 实验在采样期间用组合脉冲(G A R P)对1 3 C 信号去偶,在1 2 8 条F 1 D(F。)中每条采样点数为2 0 4 8(F:),1H 与b C 两维的谱宽分别为6 3 1 3H
13、 z(F 2)和2 6 4 1 0H z(F。),每一条F I D 累加4 0 0 次。H M B C 实验中远程偶合常数采用6H z,在1 2 8 条F I D(F。)中每条采样点数为2 0 4 8(F:)。1 H 与”C 两维的谱宽分别为6 3 1 3H z(F:)和3 3 2 0 1H z(F),每一条F I D 累加3 5 2 次。在傅里叶变换前,所有二维谱数据填零得到矩阵为2 0 4 8 2 0 4 8。2 2 4 大肠杆菌代谢物的半定量分析根据N M R 原理,一维1 HN M R 谱中质子信号的积分面积与对应的质子浓度成正比。因此,代谢物含量可以通过待检质子信号与内标物T S P
14、 质子信号的积分面积之比计算得到。由于一维谱中物质之间的有些信号交叠严重,因此本研究只选择无交叠的代谢物信号的面积进行积分。3 结果与讨论3 1大肠杆菌提取物的N M R 分析图1 为5 0 乙腈水溶液提取得到的E c o l iH B l 0 1 的一维1 HN M R 谱,根据文献 2 2,2 3 并依照上述二维N M R 谱对代谢物信号进行了归属。核磁共振二维谱的基本原理表明,C O S Y 与T O C S Y 二维谱能够分别提供23 J 耦合与(3 4 个碳链之内)的连接关系;H S Q C 谱提供质子与碳的直接连接关系,而H M B C 谱则提供质子与碳的远程相关关系。将这些连接关
15、系进行综合分析并结合文献数据和本课题组自建的标品数据库,就能够确定代谢物的原子连接关系(平面结构)。譬如,在1 H 一1HT O C S Y 谱中,在艿3 0 3 的三重峰(t,7 5H z)与处在艿1 4 8,艿1 7 3,d1 9 1 及占3 7 8 的质子形成耦合体系,H S Q C 谱中信息表明,艿1 4 8,艿1 7 3 和占1 9 1 这3 个质子分别是3 个亚甲基,而艿3 7 8 对应一个C H 基团。C O S Y 谱分析确定上述4 个质子的直接连接顺序后发现该代谢物可能是赖氨酸。使用H M B C 谱中的远程耦合关系,发万方数据1 1 8 8分析化学第3 9 卷现除了上述3
16、个亚甲基和1 个次甲基的连接关系外,还能观察到1 个羧基的信号与口一H(83 7 8)和伊H(艿1 9 1)信号有相关性。将这些信息综合并通过1 HJ 分解谱中个质子耦合常数和耦合峰形的验证,进一步确定了该代谢物的赖氨酸特征。将此物质的核磁信息与文献及本课题组的标品数据库信息进行比较,最后确定其为赖氨酸。本研究发现的所有代谢物的化学位移数据见表1。这是首次采用N M R 技术系统地对大肠杆菌提取物中的代谢产物进行指认归属。事实上,这样复杂的混合物中N M R 信号复杂,交叠严重,有些代谢物的部分N M R 信息无法得到。即使在这样的情况下,代谢物的特征信号依然能够提供重要的归属信息。如尿苷的归
17、属是依据其尿嘧啶部分的特征峰艿7 8 8(8 1H z)和艿5 9 0(3 9H z)的C O S Y相关,再在H M B C 谱上找到与其相关的两个季碳信号(占1 5 5 0 和占1 6 9 4)和核糖环上的次甲基信号占5 9 1,与报道的尿苷信息核对,最终得到结构确证。目前,这样的归属已成为常规方法。2 92 82 72 62 52 42 32 22 12 01 91 81 71 61 51 41 31 21 11 00 94 74 64 54 44 34 24 14 03 93 83 73 63 53 43 33 23 13 02 92 89 08 58 07 57 06 56 05 5
18、5 2C h e m i c a ls h i f t6图1E c o l iH B l 0 1 提取物的典型6 0 0 M H z1 H N M R 谱。区域占0 9 2 9 和占5 2 9 0 相对于区域艿2 8 4 7 的放大倍数分别是2 和6 倍(信号归属见表1)F i g 1T y p i c a l6 0 0M H z lHN M Rs p e c t r ao fE s c h e r i c h i ac o l i(E c o l i)H B l 0 1e x t r a c t C o m p a r e dw i t hr e g i o n艿2 8 4 7,t h es
19、 p e c t r a lr e g i o n s 占O 9 2 9a n d85 2 9 0w e r ev e r t i c a l l ye x p a n d e df o r2a n d6,r e s p e c t i v e l y(s e eT a b l e1f o rr e s o n a n c ea s s i g n m e n t)从表1 可见,采用N M R 技术可在E c o l i 提取物中检测到多种氨基酸,包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸以及一个氨基酸的衍生物N 一乙酰丙氨
20、酸;检测到旷氨基廿羟基丁酸、乳酸、乙酸、7 L 氨基丁酸、旷氨基乙二酸、丙酮酸、琥珀酸、a 一酮戊二酸、延胡索酸等有机酸;还检测到腐胺、甲基胺、二甲胺、三甲胺、乙酰胺等胺类物质以及核糖一5 一磷酸、尿嘧啶、尿嘧啶核苷、胞嘧啶、胞嘧啶核苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2,3 一环磷酸腺苷和腺苷等核苷及其衍生物。但本研究只检测到一种糖类物质,即葡萄糖。此外,实验检测到胆碱、磷酸胆碱、甜菜碱及甲醇,有一种物质未能得到归属。万方数据第8 期叶央芳等:大肠杆菌代谢物组成的核磁共振分析1 1 8 9表lE c o l iH B l 0 1 低分子量代谢物的N M R 信号归属T a b l elN M Ra s s
21、 i g n m e n t so fl o w-m o l e c u l a r-w e i g h tm e t a b o l i t e sf o u n di nE c o l iH B l 0 1万方数据1 1 9 0分析化学第3 9 卷续表1(C o n t i n u e dt oT a b l e1)万方数据第8 期叶央芳等:大肠杆菌代谢物组成的核磁共振分析1 1 9 l续表l(C o n t i n u e dt oT a b l ei)万方数据分析化学第3 9 卷续表1(C o n t i n u e dt oT a b l e1)a:多重性:s,单峰;d,双峰s t,
22、i 重峰;q,四重峰;d d,双二重峰;d t 双二三重峰;m,多重峰。b:不能确定的信号或多重性。a=M u l t i p l i c i t y:s,s i n g l e t;d d o u b l e t;t r i p l e t;,q,q u a r t e t;d d,d o u b l e to fd o u b l e t s;d r,d o u b l e to ft r i p l e s;l n,m u l t i p l e t U:u n i d e n t i f i e ds i g n a l bT h es i g n a l so rm u l t i
23、p l i e i t i e sw e r en o td e t e r m i n e d 这些代谢物分别代表三羧酸循环(如琥珀酸)、糖酵解(如葡萄糖和丙酮酸)、磷酸戊糖途径(如核糖一5 一磷酸)、蛋白质与氨基酸代谢(如谷氨酸)、嘌呤与嘧啶代谢(如黄嘌呤和胞嘧啶)、胆碱代谢(如胆碱)、有机胺代谢(如腐胺)、有机酸代谢(如乙酸)等代谢途径。因此,尽管本研究所检测到的代谢物种类有限,但这些代谢物的变化能直接或间接反映蛋白质、氨基酸、糖、核酸等一系列主要生物化学物质的代谢趋向,进而推断细胞内的代谢状态和响应于外因或内因所作的各种代谢调节,如能量代谢调节、渗透压调节和抗氧化能力调节。事实上,目前
24、所有的代谢组分析方法无一例外的只能检测出部分代谢物,关键是要考虑检出物质对代谢途径的覆盖面。本研究只关注亲水性代谢物,尚未对疏水性代谢物进行分析。脂类等疏水性代谢物可以使用甲醇与氯仿的混和溶剂提取后获得,再经G C-M S 分析所得到的信息也必然是只与脂代谢途径相关。3 2 大肠杆菌代谢物的半定量分析为了解各代谢物在稳定期E c o l i 中的含量,根据一维1 HN M R 谱中待检测质子信号与内标物T S P质子信号的积分面积之比计算得到了部分代谢物在大肠杆菌提取物中的浓度(表2),用6 个平行样的平均值和标准偏差(m e a n S D,m g L 培养液)表示。结果表明:在稳定期大肠杆
25、菌中,含量最丰富的代谢产物是葡萄糖,达到(2 1 1 l 3 4 8)m g L,其次是谷氨酸、甜菜碱、腐胺和核糖一5 一磷酸,浓度依次为(1 6 3 2 2 4 9)m g L、(1 6 2 9 2 5 7)m g L、(1 4 1 2 1 2 1)m g L 和(1 3 0 9 2 2 9)m g L。其它大部分物质的浓度在l 1 0m g L 之间。而3 种胺类物质、三羧酸循环中的物质、胞嘧啶和甲醇含量低于1m g L。万方数据第8 期叶央芳等:大肠杆菌代谢物组成的核磁共振分析1 1 9 3表2 大肠杆菌H B l 0 1 提取物的代谢物含量T h b l e2M e t a b o l
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- 大肠杆菌 代谢物 组成 核磁共振 分析
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