电镜样品制备与观察精选文档.ppt

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1、电镜样品制备与观察本讲稿第一页，共十八页主要内容样品的取材与固定样品的渗透与包埋修快与支持膜的制备玻璃刀的制作与超薄切片电子染色电子显微镜的使用与生物样品超微结构观察本讲稿第二页，共十八页一、样品的取材与固定（一）实验目的1 掌握电镜样品取材的方法与要求2 掌握电镜样品的固定方法与要求（二）实验原理（见原理部分）（三）实验材料小白鼠肝脏（等）本讲稿第三页，共十八页（四）实验方法1 动物麻醉 将小白鼠放入烧杯，放入一蘸有氯仿的脱脂棉球，用培养皿盖住烧杯口，约35min后小白鼠被麻醉；2 解剖分割 迅速解剖，取出肝脏，在硬纸上用新单面刀片分割成0.5*0.5*0.5mm3 小块，迅速投入准备号的固

2、定液；3 前固定 2.5%戊二醛04固定12h（固定液需提前准备号）；4 漂洗 0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次510min,04；本讲稿第四页，共十八页5 后固定 1鋨酸固定12h，04；6 漂洗 0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，每次510min,04；7 脱水 30乙醇 50乙醇 70乙醇，04，每步510min；8 保存 70乙醇04保存。本讲稿第五页，共十八页（五）实验要求1 用具干燥；2 取材 快、准、小、轻；3 鋨酸有毒，需在通风厨中进行，含鋨酸的废液放入指定容器；4 每人固定23块样品；5 在固定的过程中要不断震动样品管。本讲稿第六页，共十八页二、样品的渗透与包埋（一）实验目的掌握超

3、薄切片样品渗透与包埋的方法（二）实验原理见理论部分（三）实验材料上次保存的材料本讲稿第七页，共十八页（四）实验方法1 脱水 85乙醇 95乙醇 100乙醇 100乙醇，每步510min；2 置换 丙酮丙酮，每步510min；3 渗透 1/2丙酮+1/2环氧树脂14h；4 包埋 先将包埋模块加满环氧树脂，再将渗透过 的材料用牙签挑到包埋模块尖端部分，并在其中渗透34h；5 聚合 加热37 45 60，各12h。本讲稿第八页，共十八页（五）实验要求1 所用器具、工具保持清洁干燥；2 手上若沾有环氧树脂，用丙酮棉球擦去；每人包埋23个样品块。本讲稿第九页，共十八页三、修快与支持膜的制备（一）实验目的

4、1 掌握超薄切片包埋块修快的方法；2 掌握支持膜制备的方法。（二）实验原理见理论部分（三）实验材料上次实验包埋的材料本讲稿第十页，共十八页（四）实验方法1 修快（1）用样品夹头夹住环氧树脂包埋块的2/3左右，夹紧，或用手拿住样品块；（2）用小钢锉或单面刀片修快使达到下面要求：切面光滑平整，尽可能是要观察的材料，切面大小0.5*0.5mm2；34个斜面的坡度以45度为宜。本讲稿第十一页，共十八页2 支持膜的制备（1）将玻璃条、250ml烧杯洗净，玻璃条先用纱布擦干，然后再用绸布用力反复擦净，250ml烧杯装满蒸馏水；（2）将玻璃条放入0.20.3%聚乙烯醇缩甲醛的氯仿溶液中24cm深，停留35s

5、后提出，在空气中自然干燥；（3）在玻璃条四周用单面刀片将膜轻轻划开，然后以与水面30度角缓慢插入放在日光灯正下方的250ml烧杯的蒸馏水中，同时用眼观察(使眼正好能看到水面反射的日光灯的光线)，使膜完全脱离玻璃条而漂浮在水面上，膜应为均匀的灰色（约15nm）；本讲稿第十二页，共十八页（4）将24片载网放在膜上，再用镊子轻压12下，使载网与膜紧贴；（5）再用比膜稍大的滤纸放在膜的上方，轻压下滤纸一角，在滤纸刚好全部湿润之际将滤纸提起，载网与膜亦贴在滤纸上；（6）将膜向上保存于培养皿中备用。（五）实验要求1 制膜所用的器具、蒸馏水、纱布、绸布必须干净，用后洗净，制膜过程要防尘；2 每人修快2块，制

6、膜2张，将修好的样品块用纸包好写上组号姓名；3 预习下次实验。本讲稿第十三页，共十八页四、玻璃刀的制作与超薄切片（一）玻璃刀的制作（二）超薄切片本讲稿第十四页，共十八页五、电子染色1 蜡盘的制作 在培养皿中注入融化的石蜡，让其逐渐凝固；2 滴加染液3 铀染4 水洗5 铅染6 水洗7 干燥本讲稿第十五页，共十八页六、电子显微镜的使用与样品超微结构观察（一）JEM-100SX透射电子显微镜的使用1 启动：闭合电子显微镜稳压电源开关与冷却循环水稳压电源开光，压下启动按钮。约30分钟后仪器进入可工作状态。2 放入样品：按程序放入样品。3 加高压：有下列几档可选 40KV、60KV、80KV、100KV

7、，若需高压应先加低压。选择加速电压原则：电压越高，分辨率越高，反差越小；反之，电压越低分辨率越低，反差越大。本讲稿第十六页，共十八页4 加灯丝电源：顺时针旋转至限位处（加灯丝电源必须有高压存在），此时应看到图象，若不能看到图象，请与专职人员联系，切勿随意调整各旋钮。5 观察:调整放大倍数、亮度、样品XY平移、焦距进行观察。6 照相：将要照相部位移至视野中心标记方框内，过卷，调整焦距、亮度至自动曝光两个绿灯同时亮，抬起荧光屏进行曝光。7 关机：将放大倍数调至1000X，调整亮度正好充满荧光屏，取出样品，灯丝旋钮调至最低，高压调至OFF，压下关闭按钮，约5分钟后仪器关闭，切断两个稳压电源开关。8 记录：包括使用起至时间、观察内容、使用人及所属单位及导师，仪器工作情况。本讲稿第十七页，共十八页（二）样品超微结构的观察本讲稿第十八页，共十八页