原位杂交20061.ppt

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1、原位杂交原位杂交Insituhybridization(ISH)王海龙王海龙2006.03肺泡巨噬细胞肺泡巨噬细胞TGF1原位杂交染色原位杂交染色DAB200 支气管上皮细胞支气管上皮细胞TGF1原位杂交染色原位杂交染色DAB200 第一节第一节 原位杂交概述原位杂交概述一、概念一、概念 原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（交（Insituhybridization），），属于固相核酸分子杂属于固相核酸分子杂交的范畴。交的范畴。是应用已知碱基序列并带有标记物的核是应用已知碱基序列并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待测的核酸（酸探针与组织、细胞中

2、待测的核酸（mRNA）按）按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，在核酸原有的后再应用与标记物相应的检测系统，在核酸原有的位置进行细胞定位和定量。位置进行细胞定位和定量。二、原位杂交与其他杂交技术的区别二、原位杂交与其他杂交技术的区别菌落菌落杂交：交：细菌裂解菌裂解释放出放出DNA，然后然后进行行杂交；交；Southern杂交：是交：是鉴定定DNA中某一特定的基因片段；中某一特定的基因片段；Norhtern印迹印迹杂交：是交：是检测某一特定的某一特定的RNA片段的。片段的。它它们都只能都只能证明明细胞或胞或组织中

3、是否存在待中是否存在待测的的核酸，而不能核酸，而不能证明明该核酸分子在核酸分子在细胞或胞或组织中存在中存在的部位和数量。的部位和数量。三、原位杂交的历史三、原位杂交的历史 1969年美国耶鲁大学年美国耶鲁大学Gall 和和Pardue首先用首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。因定位于卵母细胞的核仁中。同时，同时，Nardelli、John及其同事等相继利用及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。从而创造了

4、原位杂交细胞或组织化学技术。第二节第二节 原位杂交技术原位杂交技术一、杂交前准备一、杂交前准备（一）（一）DEPCDEPC水是经水是经DEPCDEPC处理过的灭菌蒸馏水处理过的灭菌蒸馏水 DEPC即二乙基焦碳酸酯即二乙基焦碳酸酯，可灭活各种蛋白质，可灭活各种蛋白质，是是RNA酶的强抑制剂。酶的强抑制剂。原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用剂均需用DEPC处理，或用处理，或用DEPC水配制，包括乙水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需洗涤也需DEPC水洗涤。水洗涤。终浓度一

5、般为终浓度一般为0.1%0.4%注注意意：DEPCDEPC是是一一种种潜潜在在的的致致癌癌物物质质，在在操操作作中中应应尽尽量量在在通通风风的的条条件件下下进进行行，并并避避免免接接触触皮皮肤肤。含含有有TrisTris缓冲液的溶液中，不能加入缓冲液的溶液中，不能加入DEPCDEPC。（二）固定（二）固定1 1、目的：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内、目的：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNADNA或或RNARNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。的水平；使探针易于进入细胞或组织。2 2、固定剂：、固定剂：4%4%多聚甲醛多聚甲醛 对于对于mRNA的定位，常采用的方法是将组织的定位，常采

6、用的方法是将组织固定于固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中多聚甲醛磷酸缓冲液中12h，在冷在冷冻前浸入冻前浸入15%蔗糖溶液中，置蔗糖溶液中，置4冰箱过夜，次冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中用恒冷箱切片机或振荡切日切片或保存在液氮中用恒冷箱切片机或振荡切片机切片。片机切片。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入后才将其浸入4%多聚甲醛约多聚甲醛约10min，空气干燥空气干燥后保存在后保存在-70。（三）玻片的处理（三）玻片的处理1、清洗、清洗（1 1）泡酸泡酸 清洗清洗 160 160以上烤箱中以上烤箱中烘烤烘烤4 4h h以上或经以上或经1515磅

7、高压灭菌磅高压灭菌2020minmin（2 2）HClHCl处理法处理法2、包被、包被 多聚赖氨酸多聚赖氨酸 铬矾铬矾-明胶液明胶液 APES（氨丙基三乙氧基硅浣）氨丙基三乙氧基硅浣）（四（四）杂交前操作杂交前操作1、增强组织的通透性和核酸探针的穿透性、增强组织的通透性和核酸探针的穿透性 稀释的酸洗涤稀释的酸洗涤清洗剂清洗剂Triton X-100酒精酒精消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶 2、预杂交（、预杂交（Prehybridization）是减低背景染色的一种有效手段。是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫预杂交

8、液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖（酸葡聚糖（Dextran sulphate）。）。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。杂交点的目的，从而减低背景染色。：临用前加；：临用前加；予杂交液不加予杂交液不加（一）原位杂交用探针的分类（一）原位杂交用探针的分类 1 1、根据标记方法的不同可分为放射性探针和、根据标记方法的不同可分为放射性探针和非放射性探针。非放射性探针。1 1、放射性探针：同位素标记（发射性、半衰期）、放射性探针：同位素标记（发射性、半衰期）2 2、非放射性探针、非放射性探针荧光素荧光素DNP磺

9、基化磺基化DNA探针探针生物素生物素地高辛地高辛二、杂交二、杂交2 2、根据探针的核酸性质分为、根据探针的核酸性质分为DNA探针、探针、RNA探针、探针、cDNA探针、探针、cRNA探针探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针4 4、探针的浓度、探针的浓度 ：0.50.55 5ngng/l/l3 3、探针的长度、探针的长度 ：5050100100个碱基个碱基 （二）杂交的温度和时间（二）杂交的温度和时间 原位杂交中，多数原位杂交中，多数DNADNA探针需要的探针需要的TmTm是是9090，而而RNARNA探针需要探针需要9595。杂交液中每增加杂交液中每增加1%的甲酰胺浓度，的甲酰胺浓度，Tm值可值可降低

10、降低0.72。因此，杂交液中加入。因此，杂交液中加入30%30%50%50%甲酰甲酰胺胺。实际采用的原位杂交的温度在实际采用的原位杂交的温度在Tm-25左右，左右，大约在大约在3060之间之间。一般杂交反应时间为一般杂交反应时间为1620h。在杂交液中，甲酰胺占在杂交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸左右，而硫酸葡聚糖占葡聚糖占10%左右。硫酸葡聚糖的主要作用是左右。硫酸葡聚糖的主要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。促进杂交率，特别是对双链核酸探针。甲酰胺甲酰胺可降低可降低Tm值，防止在低温时非同源性片段的结值，防止在低温时非同源性片段的结合。合。（三）杂交后处理（三）杂交后处理 包括系列

11、不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥。必须注意的是在漂洗的过程中，切勿使切片干燥。（四）显示（四）显示 根据核酸探针标记物的种类分别进行放射根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定。进行半定量的测定。第三节

12、第三节 原位杂交的质控原位杂交的质控一、杂交严格度一、杂交严格度 杂交条件的严格度（杂交条件的严格度（stringency）表示通过表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。杂交体的鉴别程度。通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性异性杂交体的形成，提高杂交的特异性/严格度。严格度。低严格度低严格度（low stringencylow stringency）：）：杂交及冲洗条杂交及冲洗条件在件在 Tm-35Tm-35至至Tm Tm 4040之间，高盐或低甲之

13、间，高盐或低甲酰胺浓度。酰胺浓度。约有约有70%70%90%90%的同源性核苷酸序列被结合，的同源性核苷酸序列被结合，导致非特异性杂交信号的产生。导致非特异性杂交信号的产生。中严格度中严格度，Tm-20至至Tm-30的范围的范围。高严格度高严格度（high stringency）为为Tm-10至至Tm-15，低盐和高甲酰胺浓度。只有具有高低盐和高甲酰胺浓度。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。由于原位杂交技术多数是在由于原位杂交技术多数是在Tm-25进行进行的，不属于高严格范围，无疑会产生非特异性的，不属于高严格范围，无疑会产生非特异性结合导致

14、信结合导致信/噪比减低。在这种情况下，可用噪比减低。在这种情况下，可用加强杂交后处理即加强洗涤的严格度使非特异加强杂交后处理即加强洗涤的严格度使非特异性的杂交体减少。性的杂交体减少。二、影响二、影响ISH实验结果的因素实验结果的因素1 1、实验取材后未及时的固定或冷冻、实验取材后未及时的固定或冷冻mRNA的降解而导致假阴性的降解而导致假阴性2、组织细胞穿透力的处理、组织细胞穿透力的处理曲拉通曲拉通-X100、蛋白蛋白酶3、后固定、后固定 为保持组织结构，通常用为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定多聚甲醛再固定4、预杂交、预杂交 降低非特异性杂交降低非特异性杂交 5、探针的长度、探针的长度太

15、长，不易进入；太短，非特异性太长，不易进入；太短，非特异性6、杂交的温度、杂交的温度属中度严格杂交，非特异性属中度严格杂交，非特异性7、杂交后洗涤、杂交后洗涤降低非特异性降低非特异性8、显示、显示不同的检测系统，敏感性不一不同的检测系统，敏感性不一9、试剂的配制、试剂的配制杂交前所用试剂需经杂交前所用试剂需经DEPC处理处理第四节第四节 原位杂交的流程原位杂交的流程一、原位杂交程序一、原位杂交程序1、二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。、二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。DEPC-H2O洗洗2次，次，DEPC-PBS洗洗2次，次，5分钟。分钟。2、DEPC-PBS处理的处理的Triton-X100处理处理15分

16、钟。分钟。3、DEPC-PBS洗洗2次，次，5分钟。分钟。4、TE缓冲液稀释的蛋白酶缓冲液稀释的蛋白酶K（5-20g/ml）37孵育孵育1520min。5、用用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗中）清洗0.5-0.5-1 1min以终止蛋白酶以终止蛋白酶K的消化作用，的消化作用，DEPC-PBS洗洗2次，次，5分分钟。钟。6、DEPC-PBS处理的处理的4%多聚甲醛后固定多聚甲醛后固定10-15分钟。分钟。7、DEPC-PBS洗洗2次，次，5分钟。分钟。8、2SSC洗洗5分钟。分钟。9、不含探针的寡核苷酸探针杂交缓冲液中、不含探针的寡核苷酸探针杂交缓冲液中37孵育孵

17、育2 2h h。1010、2SSC洗洗5分钟。分钟。11、含探针杂交缓冲液中含探针杂交缓冲液中37孵育孵育1818h h。1212、1SSC在室温下速洗，在室温下速洗，1SSC在在55 水浴摇洗水浴摇洗 21515minmin，0.5 0.5 SSC在在55 水浴摇洗水浴摇洗21515minmin，0.5 0.5 SSC在室温下洗在室温下洗10min。13、放射自显影或酶显。放射自显影或酶显。二、常用试剂二、常用试剂14%多聚甲醛（多聚甲醛（Paraformaldehyde,PFA）配配法法：称称取取40gPFA溶溶于于装装有有500mlDEPC水水的的玻玻璃璃容容器器（烧烧杯杯或或烧烧瓶瓶）

18、中中，持持续续加加热热磁磁力力搅搅拌拌至至6065，使使成成乳乳白白色色悬悬液液。用用1.0mol/L的的NaOH调调pH值值至至7.0，使使呈呈清清亮亮状状，再再加加入入约约500ml2PBS，充充分分混混匀匀（在在冰冰浴浴或或冷冷水水浴浴中中），可可再再检检测测一一下下pH，过过滤滤后定容至后定容至1000ml，室温或室温或4保存备用。保存备用。注注意意：配配制制时时应应在在通通风风条条件件下下操操作作，并并避避免免接接触触皮皮肤肤和和吸吸入入（戴戴手手套套及及口口罩罩），因因PFA有有较较强强的的固固定定作作用用及及毒毒性性，对对粘粘膜膜及及皮皮肤肤有有固固定定及及毒毒性性，刺刺激激作作

19、用用；加加热热时时，温温度度不不宜宜过过高高，常常为为6065，否否则则，PFA降降解解失失效效；配配制制好好的的PFA虽虽可可存存放放一一定定时时间间，但但过过久久的的液液体体，固固定定效效果下降，建议尽早使用。果下降，建议尽早使用。2、杂交用液、杂交用液 1)SSC(Standard Saline Citrate1)SSC(Standard Saline Citrate)通常配成通常配成10，20，50的储备液，如下：的储备液，如下：先称取上述两种试剂，溶于约先称取上述两种试剂，溶于约800ml ddH2O中，中，滴加滴加10N的的NaOH，将将pH值调至值调至7.0，补足，补足ddH2O至至1000ml，加入终浓度为加入终浓度为0.1%0.2%的的DEPC，分分装后高压灭菌，可室温保存。装后高压灭菌，可室温保存。在用于杂交的湿盒内也常用在用于杂交的湿盒内也常用5 5SSCSSC以保持一定以保持一定湿度。湿度。2 2）杂交液及予杂交液）杂交液及予杂交液：临用前加；：临用前加；予杂交液不加予杂交液不加3)3)杂交后漂洗溶液杂交后漂洗溶液 该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度该液常用于杂交后的初次洗脱，故离子强度（张力）较高。（张力）较高。该液常用于杂交后的第二次洗脱，离子强度较该液常用于杂交后的第二次洗脱，离子强度较低。低。