第一章 实验室设置和基本技术.ppt

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1、第一章第一章 实验室设置和基本技术实验室设置和基本技术本章主要内容本章主要内容:第一节第一节 实验室设置实验室设置 第二节第二节 基本技术基本技术 第三节第三节 培养基的组成培养基的组成 第四节第四节 外植体取材与灭菌外植体取材与灭菌 第五节第五节 培养条件的控制培养条件的控制 教学目的与要求：教学目的与要求：了解细胞工程的通用技术，初步掌握细胞工程实了解细胞工程的通用技术，初步掌握细胞工程实 验技术中的培养基配制、灭菌以及无菌操作的原理验技术中的培养基配制、灭菌以及无菌操作的原理 与操作方法。与操作方法。第一节第一节 实验室设置实验室设置一实验室组成一实验室组成1 1基本实验室基本实验室 准

2、备室 接种室 培养室2 2辅助实验室辅助实验室 细胞学实验室/摄影室及暗室 生化分析室/驯化室二仪器设备配置二仪器设备配置1 1、基本设备：、基本设备：冰箱、天平、电炉、酸度计、蒸馏水器、冰箱、天平、电炉、酸度计、蒸馏水器、超纯水器、培养基分装器、搅拌器。超纯水器、培养基分装器、搅拌器。2 2、灭菌设备：、灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。装置、喷雾消毒器、紫外灯。3 3、无菌操作设备：、无菌操作设备：净化工作台、接种箱。净化工作台、接种箱。无菌室下风口上风口过滤灭菌器过滤灭菌器 针针针针头头头头式式式式滤滤滤滤器器器器

3、 蔡式滤器蔡式滤器 高压蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌器净化工作台净化工作台垂直流垂直流水水平平流流 4 4、光温控制设备：、光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器时间程序控制器、空调及温度感应器5 5、细胞培养设备：、细胞培养设备：培养架、培养箱、摇床、生物反应器等培养架、培养箱、摇床、生物反应器等6 6、细胞学鉴定设备：、细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜光照培养箱光照培养箱培养架培养架生物反应器生物反应器酸度计酸度计倒置显微镜倒置显微镜三培养器皿及实验用具三培养器皿及实验用具1 1、培养容器：、培养容器：包括三角瓶、试管、培养皿、

4、培养瓶等包括三角瓶、试管、培养皿、培养瓶等a a、玻璃器皿：硼硅酸盐玻璃、玻璃器皿：硼硅酸盐玻璃 /钠玻璃钠玻璃b b、塑料器皿：一次性的（聚乙烯、聚丙烯）；、塑料器皿：一次性的（聚乙烯、聚丙烯）；重复使用的（聚丙烯、聚碳酸酯）重复使用的（聚丙烯、聚碳酸酯）2 2、金属用具：、金属用具：镊子、解剖刀、剪刀、接种铲、接种针等镊子、解剖刀、剪刀、接种铲、接种针等3 3、其他用具：、其他用具：封口膜、试管盖、橡皮筋、托盘等封口膜、试管盖、橡皮筋、托盘等第二节第二节 基本技术基本技术一洗涤技术一洗涤技术1 1洗涤液洗涤液铬酸洗涤液：铬酸洗涤液：重铬酸钾(K2Cr2O7)+硫酸 可根据需要配制成弱、中、

5、强三种 仅用于玻璃实验器皿的洗涤。合成洗涤剂：合成洗涤剂：使用面广.2 2洗涤方法洗涤方法玻璃器皿洗涤：玻璃器皿洗涤：新启用的（1%HCl浸泡过夜）、已用过的塑料用品洗涤：塑料用品洗涤：合成洗涤剂金属用品洗涤：金属用品洗涤：酒精擦洗二灭菌技术灭菌方法灭菌方法 物理灭菌物理灭菌（干热、湿热、射线、过滤）化学灭菌化学灭菌（抗菌素）1 1培养基灭菌：培养基灭菌：高压蒸汽灭菌（121，20-25min）、过滤除菌2 2玻璃器皿灭菌：玻璃器皿灭菌：干热灭菌（160-180，40min）、湿热灭菌3 3金属用具灭菌：金属用具灭菌：干热灭菌、酒精、小型电热石英砂灭菌器4 4接种室灭菌：接种室灭菌：紫外灯、气

6、体熏蒸（100ml甲醛+5g高锰酸钾）/20m2第三节第三节 培养基的组成培养基的组成 一、无机盐类一、无机盐类大量元素：大量元素：C C、H H、O O、N N、P P、S S、K K、NaNa、GaGa、MgMg微量元素：微量元素：FeFe、B B、MnMn、CuCu、ZnZn、MoMo、CoCo其生理作用：结构物质；生理活性物质；维持离子浓度平衡；影响组织器官的建成二有机化合物二有机化合物1 1、糖类：糖类：蔗糖蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘露糖等麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘露糖等 2 2、维生素：维生素：VB1VB1（盐酸硫胺素）、（盐酸硫胺素）、VB6VB6（盐酸吡哆醇）（盐酸吡哆醇）V

7、ppVpp(烟酸烟酸)、VH(VH(生物素生物素)、VBcVBc（叶酸）（叶酸）VB5VB5（泛酸钙）等。（泛酸钙）等。3 3、肌醇：肌醇：对胚状体和芽的形成有良好的作用。对胚状体和芽的形成有良好的作用。4 4、腺嘌呤：、腺嘌呤：是合成各种细胞分裂素的前体之一是合成各种细胞分裂素的前体之一5 5、氨基酸：、氨基酸：甘氨酸、多种氨基酸的混合物甘氨酸、多种氨基酸的混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白）三生长调节物质（激素）三生长调节物质（激素）1 1、生长素类、生长素类诱导愈伤组织：诱导愈伤组织：2,4-D(2,4-2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)诱导不定根：诱导不定根：IAA(IAA(吲

8、哚乙酸吲哚乙酸)、NAA(NAA(萘乙酸萘乙酸)、IBA(IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)等。等。2 2、细胞分裂素类：、细胞分裂素类：促进不定芽的发生促进不定芽的发生KT(KT(激动素激动素)、BA(6-BA(6-卞基腺嘌呤卞基腺嘌呤)、2-ip(2-ip(异戊烯氨异戊烯氨基嘌呤基嘌呤)、ZTZT（玉米素）、（玉米素）、TDZTDZ（苯基噻二唑基脲）（苯基噻二唑基脲）3 3、赤霉素类：、赤霉素类：促进伸长生长促进伸长生长GA3GA3（赤霉酸）（赤霉酸）四、水四、水 组织培养组织培养：蒸馏水、纯净水蒸馏水、纯净水 细胞或原生质体培养：细胞或原生质体培养：双蒸水、超纯水双蒸水、超纯水五、其它五、其它琼

9、脂：琼脂：0.6%0.6%1.0%1.0%活性炭：活性炭：0.5%0.5%天然提取物：如椰乳、番茄汁、天然提取物：如椰乳、番茄汁、YE(YE(酵母提取物酵母提取物)常用培养基配方及其特点（常用培养基配方及其特点（P80P80表）表）富盐平衡培养基：富盐平衡培养基：MS MS(使用最广）高硝态氮培养基：高硝态氮培养基：B5B5、N6N6、SHSH中盐培养基：中盐培养基：NitschNitsch、H H低盐培养基：低盐培养基：WhiteWhite第四节外植体取材与灭菌第四节外植体取材与灭菌一、母体植株来源：一、母体植株来源：户外、温室或室内、无菌试管苗户外、温室或室内、无菌试管苗二、外植体部位：二

10、、外植体部位：根、茎、叶、花、果实、种子、芽等根、茎、叶、花、果实、种子、芽等三、取材原则：三、取材原则：幼嫩、分生组织、分化浅幼嫩、分生组织、分化浅四、外植体灭菌四、外植体灭菌：（下表）：（下表）几种常用灭菌剂的效果比较几种常用灭菌剂的效果比较灭灭菌菌剂剂使用使用浓浓度度()灭灭菌菌时间时间(分分)效效果果残液去除残液去除难难易易次次氯氯酸酸钙钙10530好好易易次次氯氯酸酸钠钠25530好好易易新新洁洁尔尔灭灭1020530好好易易氯氯化汞化汞0.11210最好最好最最难难过过氧化氧化氢氢1012515较较好好最易最易抗菌素抗菌素450mgl-13060较较好好较难较难第五节培养条件的控制

11、第五节培养条件的控制一光照一光照依培养目的，分阶段进行调整。依培养目的，分阶段进行调整。1 1光照强度：光照强度：强光照不利于外植体启动，且易褐化；强光照不利于外植体启动，且易褐化；分化不定芽需光照。分化不定芽需光照。2 2光质：光质：主要影响器官分化。主要影响器官分化。3 3光照时间光照时间二温度二温度常用温度范围2030，高温危害比低温更严重三湿度三湿度培养容器内：几乎是100%的相对湿度环境条件：相对湿度一般要求 70 80%。四四pHpH值值通常 pH值范围是5.56.5。最适pH值范围是5.55.8 五渗透压五渗透压（原生质体培养）六通气条件六通气条件（细胞悬浮培养）A Glimpse of Plant Tissue Culture本章结束本章结束