第七章分子发光分析法(荧光、磷光和化学发光)教材课件.ppt

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1、第七章第七章 分子发光分分子发光分析法析法molecular luminescenceanalysis 第一节第一节 分子荧光与磷光分子荧光与磷光molecular fluorescence and phosphorescence第二节第二节 分子荧光与磷光分子荧光与磷光分析法分析法molecular fluorescence and phosphorescence analysis第三节第三节 化学发光分析法化学发光分析法chemiluminescenceanalysis2023/1/61一、一、分子荧光与磷光产生过程分子荧光与磷光产生过程luminescence process of mo

2、lecular fluorescence phosphorescence二、激发光谱与荧光光谱二、激发光谱与荧光光谱excitation spectrum and fluore-scence spectrum三、荧光的产生与分子结构关系三、荧光的产生与分子结构关系 relation between fluorescence and molecular structure四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素factor influenced fluorescence第一节 分子荧光与磷光molecular fluorescence and phosphorescence2023/1/62

3、一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程 luminescence process of molecular fluorescence and phosphorescence 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.1.分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基基态态(S0)激激发发态态(S1、S2、激激发发态态振振动动能能级级)：吸吸收收特特定定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激

4、激发发态态基基态态：多多种种途途径径和和方方式式(见见能能级级图图)；速速度度最最快快、激发态寿命最短的途径占优势；激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1、S2；第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T1、T2 ；2023/1/632.2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电电子子激激发发态态的的多多重重度度：M=2S+1，S S为为电电子子自自旋旋量量子子数数的的代代数数和和(0(0或或1)1)；例例如如，钠钠只只有有一一个个外外层层电电子子，S=1/2S=1/2，因因此此M=2(1/2)+1=2M=2(1/2)+1=2，所

5、所以以将将产产生生双双重重线线；若若为为碱碱土土金金属属，有有两两个个外外层层电电子子，它它们们可可能能同同一一个个方方向向自自旋旋，则则S=1/2+1/2=1S=1/2+1/2=1，M=3M=3，为为三三重重线线，或或者者向向相相反反方方向向自自旋旋，S=1/2-1/2=0S=1/2-1/2=0，M=1M=1，为为单重线。单重线。平平行行自自旋旋比比成成对对自自旋旋稳稳定定(洪洪特特规规则则)，三三重重态态能能级级比比相相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；通通常常用用S S和和T T分分别别表表示示单重态和三重态。单重态和三重态。

6、S0T1 禁阻跃迁；禁阻跃迁；通过其他途径进入通过其他途径进入(见见能能级级图图)；进进入入的的几率小；几率小；2023/1/642.2.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁 激激发发态态停停留留时时间间短短、返返回回速速度度快快的的途途径径，发发生生的的几几率率大大，发光强度

7、相对大；发光强度相对大；荧光：荧光：10-710-9 s,第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态；基态；磷光：磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态；基态；2023/1/65S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量l 2l 1l 3 外转换外转换l 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫2023/1/66非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫：同一振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃

8、迁。发生振动弛豫的时间至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12 s。内转换：同多重度电子能级中内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。系间跨越：不同多重态系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级

9、间的非辐射跃迁。有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。轨道耦合进行。2023/1/67辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射：电子由荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级基态（基态（多为多为 S1 S0跃迁跃迁），），发射波长为发射波长为 2的荧光；的荧光；10-710-9 s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；长；2 2 1；磷光发射：磷光发射：电子由电子由第一激发三重态的最低振动能级第一激发三重态的最低振动能级基态（

10、基态（T1 S0跃迁跃迁）；）；电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：（的可能过程：（S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁）S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 发光速度很慢：发光速度很慢：10-4100 s。光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。2023/1/68二、激发光谱与荧光二、激发光谱与荧光(磷光磷光)光谱光谱 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 荧荧光光(磷磷光光)：光光致致发发光光，必必须须选选择择合合适适的的激激发发光光波波长长，激发光波长如何选择？激发光波长如何选

11、择？1.1.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线的激发光谱曲线 由由于于分分子子对对光光的的选选择择性性吸吸收收，不不同同波波长长的的入入射射光光具具有有不不同同的的激激发发效效率率。如如果果固固定定荧荧光光（或或磷磷光光）的的发发射射波波长长（即即测测量量波波长长)而而不不断断改改变变激激发发光光（即即入入射射光光）的的波波长长,并并记记录录相相应应的的荧荧光光（或或磷磷光光）强强度度，所所得得到到的的发发光光强强度度对对激激发发波波长长的的谱谱图图称为荧光（或磷光）的激发光谱（图中曲线称为荧光（或磷光）的激发光谱（图中曲线I I）。）。如如果果固固定定激激发发光光的的波波长长和和强强度度而而

12、不不断断改改变变荧荧光光（或或磷磷光光）的的测测量量波波长长（即即发发射射波波长长），并并记记录录相相应应的的荧荧光光（或或磷磷光光）的的强强度度，所所得得到到的的发发光光强强度度对对发发射射波波长长的的谱谱图图则则为为荧荧光光（或或磷光）的发射光谱。磷光）的发射光谱。2023/1/692.荧光光谱荧光光谱(或磷光光谱或磷光光谱)固定激发光波长固定激发光波长(选选最大激发波长最大激发波长),),化合物化合物发射的荧光发射的荧光(或磷光强度或磷光强度)与发射光波长关系曲线与发射光波长关系曲线(图中曲线图中曲线II或或III)。激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱可作为发光物质的鉴别手可作为发光物

13、质的鉴别手段，并可用于定量测定时段，并可用于定量测定时作为选择合适的激发波长作为选择合适的激发波长和测量波长的依据。和测量波长的依据。2023/1/610 应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线应该指出，激发光谱曲线与其吸收曲线可能相同，但前者是荧光强度与波长的关系可能相同，但前者是荧光强度与波长的关系曲线，后者则是吸光度与波长的关系曲线，曲线，后者则是吸光度与波长的关系曲线，两者在性质上是不相同的。当然激发光谱曲两者在性质上是不相同的。当然激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子数目最多，线的最高处，处于激发态的分子数目最多，这可说明所吸收的光能量也是最多的，自然这可说明所吸收的光能量也是最多的，

14、自然能产生最强的荧光。能产生最强的荧光。2023/1/611200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱2023/1/6123.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokesa.Stokes位移位移 激激发发光光谱谱与与发发射射光光谱谱之之间间的的波波长长差差值值。发发射射光光谱谱的的波波长长比比激发光谱的长，激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电电子子跃跃迁迁

15、到到不不同同激激发发态态能能级级，吸吸收收不不同同波波长长的的能能量量(如如能能级级图图 2,1)，产产生生不不同同吸吸收收带带，但但均均回回到到第第一一激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能级级再再跃跃迁迁回回到到基基态态，产产生生波波长长一一定定的的荧荧光光(如如 2)。c.镜像规则镜像规则 通通常常荧荧光光发发射射光光谱谱与与它它的的吸吸收收光光谱谱（与与激激发发光光谱谱形形状状一一样）成镜像对称关系。样）成镜像对称关系。2023/1/613镜像规则的解释镜像规则的解释 基基态态上上的的各各振振动动能能级级分分布布与与第第一一激激发发态态上上的的各各振振动动能能级级分布类似；分布类

16、似；基基态态上上的的零零振振动动能能级级与与第第一一激激发发态态的的二二振振动动能能级级之之间间的的跃跃迁迁几几率率最最大大，相相反反跃跃迁也然迁也然。2023/1/614 应用镜像对称规则，可以帮助判别某个应用镜像对称规则，可以帮助判别某个吸收带究竟是属于第一吸收带中的另一振动吸收带究竟是属于第一吸收带中的另一振动带，还是更高电子态的吸收带。根据镜像对带，还是更高电子态的吸收带。根据镜像对称规则，如不是吸收光谱镜像对称的荧光峰称规则，如不是吸收光谱镜像对称的荧光峰出现，表示有散射光或杂质荧光存在。出现，表示有散射光或杂质荧光存在。诚然，也存在少数偏离镜像对称规则的诚然，也存在少数偏离镜像对称

17、规则的现象，究其原因，或是由于激发态时核的几现象，究其原因，或是由于激发态时核的几何构型与基态时不同，或是由于在激发态时何构型与基态时不同，或是由于在激发态时发生了质子转移反应或形成激发态二聚体发生了质子转移反应或形成激发态二聚体（或激发态复合物）等原因而引起的。（或激发态复合物）等原因而引起的。2023/1/615200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱2023/1/616三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence a

18、nd molecular structure 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（荧光量子产率（）：）：荧荧光光量量子子产产率率与与激激发发态态能能量量释释放放各各过过程程的的速速率率常常数数有有关关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。如外转换过程速度快，不出现荧光发射。2023/1/6172.2.化合物的结构与荧光化合物的结构与荧光（1）跃跃迁迁类类型型：*的的荧荧光光效效率率高高，系系间间跨跨越越过过程程的的速速率常数小，有利于荧光的产生；率常数小，有利于

19、荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚刚性性平平面面结结构构：可可降降低低分分子子振振动动，减减少少与与溶溶剂剂的的相相互互作作用用，故故具具有有很很强强的的荧荧光光。如如荧荧光光素素和和酚酚酞酞有有相相似似结结构构，荧荧光光素有很强的荧光，酚酞却没有。素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强，如有供电基，使荧光增强，如-OH、-NH2、-OCH3、-NR2等；吸电子基团如等；吸电子基团如-NO2、-COOH等减弱荧光，程等减弱荧光，程度高时，无荧光。度高时

20、，无荧光。2023/1/6182023/1/619（5）取代基的空间障碍对荧光也有影响（一般空）取代基的空间障碍对荧光也有影响（一般空间阻碍导致荧光减弱），立体异构现象对荧光强间阻碍导致荧光减弱），立体异构现象对荧光强度有显著的影响（一般反式荧光强，顺式弱或无度有显著的影响（一般反式荧光强，顺式弱或无荧光）。荧光）。（6）金属螯合物的荧光）金属螯合物的荧光 除过渡元素的顺磁性原除过渡元素的顺磁性原子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属子会发生线状荧光光谱外，大多数无机盐类金属离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不能离子，在溶液中只能发生无辐射跃迁，因而不能产生荧光。但是，在某些情况下，金

21、属螯合物却产生荧光。但是，在某些情况下，金属螯合物却能产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的测能产生很强的荧光，并可用于痕量金属离子的测定，主要是由于螯合物中配位体的发光。一般来定，主要是由于螯合物中配位体的发光。一般来说，能产生这类荧光的金属离子具有硬酸型结构，说，能产生这类荧光的金属离子具有硬酸型结构，如如Be、Mg、Al、Zr、Th等。等。2023/1/620 四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素 factors affecting fluorescence intensity 影响荧光强度的外部因素影响荧光强度的外部因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除除一一般般溶溶剂剂效效应应

22、外外，溶溶剂剂的的极极性性、氢氢键键、配配位位键键的的形形成成都将使化合物的荧光发生变化（极性大，荧光强）；都将使化合物的荧光发生变化（极性大，荧光强）；2.2.温度的影响温度的影响 荧荧光光强强度度对对温温度度变变化化敏敏感感，温温度度增增加加，外外转转换换去去活活的的几几率增加。率增加。3.溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；2023/1/6214.4.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 自自吸吸现现象象：化化合合物物的的荧荧光光发发射射光光谱谱的的短短波波长长端端与与其其吸吸收收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如

23、蒽化合物。光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；2023/1/6225.5.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭 碰碰撞撞猝猝灭灭，是是荧荧光光熄熄灭灭的的主主要要原原因因。它它是是指指处处于于单单重重激激发发态态的的荧荧光光分分子子与与熄熄灭灭剂剂发发生生碰碰撞撞后后，使使激激发发态态分分子子以以无无辐辐射射跃跃迁迁方方式式回回到到基基态态，因因而而产产生生熄熄灭灭作作用用。荧荧光光熄熄灭灭的的程程度度主主要要取取决决于于荧荧光光分分子子与

24、与熄熄灭灭剂剂的的反反应应速速度度和和熄熄灭灭剂剂的的浓浓度度，另另外外碰碰撞撞猝猝灭灭还还与与溶溶液液的的黏黏度度有有关关，黏黏度度大大、熄熄灭灭作作用用小小，碰撞熄灭随温度的升高而增加。碰撞熄灭随温度的升高而增加。能量转移使荧光猝灭。能量转移使荧光猝灭。氧氧的的熄熄灭灭作作用用，溶溶液液中中的的溶溶解解氧氧常常对对荧荧光光产产生生熄熄灭灭作作用用。这这可可能能是是由由于于顺顺磁磁性性的的氧氧分分子子与与处处于于单单重重激激发发态态的的荧荧光光物物质质分分子子相相作作用用，促促进进形形成成顺顺磁磁性性的的三三重重态态荧荧光光分分子子，即即加加速速系系间跨越所致间跨越所致。2023/1/623

25、一、一、仪器与结构流程仪器与结构流程instrument and general process 二、二、荧光分析法和应用荧光分析法和应用fluorescence analysis and application三、三、磷光分析法的应用磷光分析法的应用phosphorescence analysis and application第二节 分子荧光与磷光分析法molecular fluorescence and phosphorescence analysis 2023/1/624一、仪器结构流程一、仪器结构流程 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成成：激激发发光光源源

26、、样样品品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：基本流程如图：单单色色器器：选选择择激激发发光光波波长长的的第第一一单单色色器器和和选选择择发发射射光光(测量测量)波长的第二单色器；波长的第二单色器；光光源源：氙氙灯灯和和高高压压汞汞灯灯，染染料激光器料激光器(可见与紫外区可见与紫外区)检测器：光电倍增管检测器：光电倍增管。2023/1/625仪仪器器光光路路图图2023/1/626仪器框图仪器框图该型仪器该型仪器可进行荧可进行荧光、磷光光、磷光和发光分和发光分析；析；202

27、3/1/627同步扫描技术同步扫描技术 根根据据激激发发和和发发射射单单色色器器在在扫扫描描过过程程中中彼彼此此间间所所保保持持的的关关系系，同同步步扫扫描描可可分分为为固固定定波波长长差差()和和固固定定能能量量差差及及可可变波长三种；变波长三种；同同步步扫扫描描技技术术可可简简化化光光谱谱，谱谱带带变变窄窄，减减少少光光谱谱重重叠叠，提提高高分分辨辨率；率；如图如图。合适的合适的可可减少光谱重叠；减少光谱重叠；酪酪氨氨酸酸和和色色氨氨酸酸的的荧荧光光激激发发光光谱谱相相似似，发发 射射 光光 谱谱 严严 重重 重重 叠叠，但但156060nmnm时时，只只显显示示色色氨酸的特征光谱，实现分

28、别测定。氨酸的特征光谱，实现分别测定。2023/1/628可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷磷)光光谱图光光谱图2023/1/629磷光检测磷光检测 荧荧光光计计上上配配上上磷磷光光测测量量附附件件即即可可对对磷磷光光进进行行测测量量。在在有有荧光发射的同时测量磷光。荧光发射的同时测量磷光。测量方法：测量方法：（1 1）通通常常借借助助于于荧荧光光和和磷磷光光寿寿命命的的差差别别，采采用用磷磷光光镜镜的的装置将荧光隔开。装置将荧光隔开。（2 2）采采用用脉脉冲冲光光源源和和可可控控检检测及时间分辨技术。

29、测及时间分辨技术。室室温温测测量量时时，不不需需要要杜杜瓦瓦瓶瓶（英英国国化化学学家家、物物理理学学家杜瓦发明的瓶子）。家杜瓦发明的瓶子）。2023/1/630二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用1.1.特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级；为什么？个数量级；为什么？（光光度度法法 ，检检测测大大信信号号的的微微小小差差别别，荧荧光光法法小小背背景下的荧光强度）景下的荧光强度）检测下限：检测下限：0.10.10.10.1 g/cmg/cm-3-3 相对灵敏度：相对灵敏度：0.050.05mol/L mol/L 奎宁硫酸

30、氢盐的硫酸溶液奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点：应用范围小缺点：应用范围小。为什么？为什么？2023/1/6312.2.定量依据与方法定量依据与方法(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ：If=Ia 由朗由朗-比耳定律：比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)If=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.3 l c)浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理

31、后：If=2.3 I0 l c =Kc2023/1/632（2 2）定量方法）定量方法标准曲线法：标准曲线法：配配制制一一系系列列标标准准浓浓度度试试样样测测定定荧荧光光强强度度，绘绘制制标标准准曲曲线线，再再在在相相同同条条件件下下测测量量未未知知试试样样的的荧荧光光强度，在标准曲线上求出浓度。强度，在标准曲线上求出浓度。比较法：比较法：在在线线性性范范围围内内，测测定定标标样样和和试试样样的的荧荧光光强强度度，比较。比较。2023/1/633例、还原态的例、还原态的NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型或辅酶型或辅酶I还原型）是一种具有高荧光的重要的辅酵还原型）是一

32、种具有高荧光的重要的辅酵素。它在素。它在340 nm有最大吸收，在有最大吸收，在465 nm有最大发有最大发射。由标准射。由标准NADH溶液得到下列荧光强度数据：溶液得到下列荧光强度数据：浓度浓度NADH,M相对强度相对强度浓度浓度NADH,M相对强度相对强度0.10013.00.50059.70.20024.60.60071.20.30037.90.70083.50.40049.00.80095.12023/1/634请建立一个校正曲线，并用以估计某未请建立一个校正曲线，并用以估计某未知溶液中的知溶液中的NADH浓度，此溶液的荧光浓度，此溶液的荧光相对强度为相对强度为42.3。解：以荧光相对

33、强度为纵坐标，以解：以荧光相对强度为纵坐标，以NADH之浓度为横坐标，标出以上八个之浓度为横坐标，标出以上八个数据点，以直线相连，即可得到校正曲数据点，以直线相连，即可得到校正曲线如下：线如下：2023/1/635相相对对荧荧光光强强度度NADH浓度浓度/M2023/1/636该曲线的回归方程为：该曲线的回归方程为：Y=1.76071+116.64286X(r=0.99978)将未知溶液的相对强度标于校正曲线上，可将未知溶液的相对强度标于校正曲线上，可得其对应浓度为得其对应浓度为0.34 M。或代入回归方程：。或代入回归方程：2023/1/6373.3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)(

34、1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂形成配合物后测量；可测量约与有机试剂形成配合物后测量；可测量约6060多种元素。多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物

35、的分析 见表见表 2023/1/6382023/1/6392023/1/640三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用1.1.稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采采取取固固体体表表面面室室温温磷磷光光分分析析法法快快速速灵灵敏敏测测定定稠稠环环芳芳烃烃和和杂环化合物（致癌物质）；见表杂环化合物（致癌物质）；见表2.2.农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟烟碱碱、降降烟烟碱碱、新新烟烟碱碱、2 2，4-4-D D（一一种种植植物物生生长长激激素素）、萘乙酸等分析萘乙酸等分析 检测限检测限0.01 0.01 g/cmg/cm-3-3 3.3.药物分析和临床分析药物分析和临床

36、分析 见表见表2023/1/6412023/1/642重原子效应：重原子效应：I、Br、Pb等称为重原子。在等称为重原子。在重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加由因此容易发生自旋轨道的相互作用，增加由单重态转化为三重态的速度，即加快了系间单重态转化为三重态的速度，即加快了系间跨越的速度。跨越的速度。这就是卤素取代基随原子序数增加而荧光下这就是卤素取代基随原子序数增加而荧光下降的原因。不难理解，由于重原子效应增加降的原因。不难理解，由于重原子效应增加系间跨越的速度，使荧光减弱，磷光则相应系间跨越的速度，使荧光减弱，磷光则

37、相应增强。增强。2023/1/6432023/1/644一、一、基本原理基本原理principle 二、化学发光分析的特点二、化学发光分析的特点characteristics三三 装置与技术装置与技术instrument and technology第三节 化学发光分析法chemiluminescenceanalysis2023/1/645一、一、基本原理基本原理 principle1.1.化学发光反应化学发光反应 化化学学发发光光不不是是由由光光、热热、电电能能所所产产生生的的光光辐辐射射。在在化化学学反反应应过过程程中中，某某些些化化合合物物接接受受能能量量而而被被激激发发，从从激激发发态

38、态返返回回基态时，发射出一定波长的光。基态时，发射出一定波长的光。A +B =C +D*D*D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，反应持续进行；化化学学发发光光反反应应存存在在于于生生物物体体(萤萤火火虫虫、海海洋洋发发光光生生物物)中中，称生物发光称生物发光(bioluminescence)。2023/1

39、/6462.2.化学发光效率化学发光效率激发态产物分子激发态产物分子的化学效率：的化学效率：激发态分子的发激发态分子的发光效率：光效率：时刻时刻t t 的化学发光强度的化学发光强度(单位时间发射的光量子数单位时间发射的光量子数)：d dc c/d dt t 分析物参加反应的速率；分析物参加反应的速率；2023/1/6473.3.化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：对于一级动力学反应：dc/dt=Kc；K 为反应速率常数。为反应速率常数。定量依据：定量

40、依据：（1 1）在一定条件下，峰值光在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，在一定条件下，曲线下面积为发光总强度曲线下面积为发光总强度(S)，其其与被与被测物浓度成线性：测物浓度成线性：2023/1/6484.4.化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1 1）气相化学发光反应）气相化学发光反应a.一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO +O3 NO2*NO2*NO2+h 发射的光谱范围：发射的光谱范围：600875nm，灵敏度灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与氧原子与SO2、NO、CO的发光反应的发光反应 O3 O2+O（1000

41、C石英管中进行石英管中进行）SO2 +O+O SO2*+O2 SO2*SO2 +h 最大发射波长：最大发射波长：200nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3；2023/1/649 O3 O2+O（1000 C石英管中进行石英管中进行）NO +O NO2*NO2*NO2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：4001400nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与CO的发光反应：的发光反应：CO +O CO2*CO2*CO2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：300500nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与NO的发光反应：的发光反应：2023/1/650c.乙烯与乙烯与O3的发

42、光反应的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：反应，生成激发态乙醛：CH2O*CH2O+h 最大发射波长：最大发射波长：435nm；对对O3的特效反应；线性响应的特效反应；线性响应范围范围1 ng/cm-3 1 g/cm-3；2023/1/651（2 2）火焰中的化学发光反应）火焰中的化学发光反应 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮一氧化氮 NO +H HNO*HNO*HNO +h 发射光谱范围：发射光谱范围：660770nm；最大发射波长：最大发射波长：690nm；在在富氢火焰中：富氢火焰中：NO2 +2H NO+H2O

43、 该反应十分迅速；可用于测定空气中该反应十分迅速；可用于测定空气中NOx的总量。的总量。2023/1/652b.硫化物硫化物 挥发性硫化物挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等等在富在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2 +2H2 S +2H2O S +S 2S2*S2*S2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：350460nm；最大发射波长：最大发射波长：394nm；灵敏度：灵敏度：0.2 ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。2023/1/653（3 3）液相中的化学发

44、光反应）液相中的化学发光反应 机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：化学发光反应效率：0.150.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应,使发出使发出的光大大增强的光大大增强；利用这一现象可测定这些金属离子。如利用这一现象可测定这些金属离子。如 C

45、o(II)、Cu(II)、Ni(II)、Au(III)、Os(III、IV、V)等。等。2023/1/6545.5.化学与生物发光分析的应用化学与生物发光分析的应用（1）鲁米诺发光。鲁米诺发光。该发光反应速度慢，某些金属离子可催化该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等（2）可检测低至可检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2；（3）间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样 氨基酸氨基酸 +O2

46、 酮酸酮酸 +NH3 +H2O2 氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶 葡萄糖葡萄糖 +O2+H2O 葡萄糖酸葡萄糖酸 +H2O2 通过测定生成的通过测定生成的H2O2，确定，确定氨基酸、葡萄糖氨基酸、葡萄糖含量。含量。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶2023/1/655 草酸二酯草酸二酯(能量提供体能量提供体)+高浓度双氧水高浓度双氧水+稠环芳烃稠环芳烃(能量接能量接受体受体)+金属离子金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光。发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光。2023/1/656生物发光分析应

47、用生物发光分析应用 1 1 在在pH 78；荧光素酶荧光素酶(E)和和Mg2+的存在下，的存在下，荧光素荧光素(LH2)与磷酸三腺甙与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：ATP +LH2+E+Mg2+AMP LH2 E+Mg ppi+2H+pH7-8复合物与氧反应，产生化学发光：复合物与氧反应，产生化学发光：AMP LH2 E+O2 氧化氧化荧光素荧光素*+AMP+CO2+H2O氧化氧化荧光素荧光素*氧化氧化荧光素荧光素 +h 最大发射波长最大发射波长562nm；2023/

48、1/657生物发光分析应用生物发光分析应用 2 2 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应存在下，发生发光反应：NADH+FMA+H+NAD+FMNH2NADH脱氢酶脱氢酶FMNH2+RCHO+O2 FMN+RCOOH+H2O+h 黄素酶黄素酶最大发射波长最大发射波长495 nm；2023/1/658二、二、特点特点 characteristics1.1.灵敏度极高灵敏度极高 例例：荧荧光光素素酶酶和和磷磷酸酸三三腺腺甙甙(ATP)的的化化学学发发光光分分析析，可

49、可测测定定2 10-17mol/L的的ATP，即可检测出一个细菌中的，即可检测出一个细菌中的ATP含量含量2 2.仪器设备简单仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；不需要光源、单色器和背景校正；3.3.发射光强度测量无干扰发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰；无背景光、散射光等干扰；4.4.线性范围宽线性范围宽5.5.分析速度快分析速度快缺缺点点：可可供供发发光光用用的的试试剂剂少少；发发光光反反应应效效率率低低（大大大大低低于于生生物物体中的发光）；机理研究少。体中的发光）；机理研究少。2023/1/6592023/1/6602023/1/661三、三、装置与技术装置与技术 i

50、nstrument and technology 装置流程：发光反应室发光反应室发光反应室发光反应室光检测器光检测器光检测器光检测器信号放大器信号放大器显示与记录显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静静态态方方式式：用用注注射射器器分分别别将将试试剂剂加加入入到到反反应应器器中中混混合合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；流流动动注注射射方方式式：用用蠕蠕动动泵泵分分别别将将试试剂剂连连续续送送入入混混合合器器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；定时通过测量室，连续发光，