生物大分子的色谱分离和纯化.ppt

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1、复复 习习浓差极化浓差极化浓差极化是指在超滤过程中，由于水透过膜，因浓差极化是指在超滤过程中，由于水透过膜，因而在膜表面的溶质浓度增高，形成梯度，在浓度而在膜表面的溶质浓度增高，形成梯度，在浓度梯度的作用下，溶质与水以相反方向扩散，在达梯度的作用下，溶质与水以相反方向扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用层，它对水的透过起着阻碍作用.复复 习习膜的污染膜的污染膜分离过程中随着操作时间的增加，膜透过流膜分离过程中随着操作时间的增加，膜透过流速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这速的迅速下降，溶质的截留率也明显下

2、降，这被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物(附生附生)污垢所引起的。污垢所引起的。复复 习习防止膜污染的方法防止膜污染的方法（1）预处理法）预处理法调整供给液的调整供给液的pH值或添加阻氧化剂来防止化学值或添加阻氧化剂来防止化学劣化；预先清除供给液中的微生物，以防止生劣化；预先清除供给液中的微生物，以防止生物性劣质等。物性劣质等。（2）开发抗污染的膜）开发抗污染的膜（3）加大供给液的流速）加大供给液的流速第七章第七章 生物大分子的色谱分离与纯化生物大分子的色谱分离与纯化 第一节第一节 色谱概论色谱概论一、色谱的概念一、色谱的概念色谱（层析）是一个建立

3、在吸附、分配、离子交换、色谱（层析）是一个建立在吸附、分配、离子交换、亲和力和分子大小等基础上的分离过程。又称色亲和力和分子大小等基础上的分离过程。又称色层分离。层分离。二、色谱的特点二、色谱的特点1.能够把各个有关的组成成分从复杂的混合物中分能够把各个有关的组成成分从复杂的混合物中分离并检测出来。离并检测出来。2.它是利用不同组分在相对运动、相互不相溶的两相中（其中静止它是利用不同组分在相对运动、相互不相溶的两相中（其中静止的一相为固定相，相对运动的一相为流动相），吸附能力、分配的一相为固定相，相对运动的一相为流动相），吸附能力、分配系数、离子交换能力、亲和力和分子大小等性质的系数、离子交换

4、能力、亲和力和分子大小等性质的微小差别微小差别。经。经过连续过连续多次在两相中的质量交换多次在两相中的质量交换，从而使不同组分得以分离，这，从而使不同组分得以分离，这就是色谱法所依据的基本原理。就是色谱法所依据的基本原理。必要条件必要条件充分条件充分条件2.色谱具有高效、快速和灵敏的特点色谱具有高效、快速和灵敏的特点色谱分离图示色谱分离图示 根据混合物中，溶质在根据混合物中，溶质在互不相溶的两相之间分互不相溶的两相之间分配行为的差别，引起溶配行为的差别，引起溶质移动速度的不同而进质移动速度的不同而进行分离的方法。行分离的方法。互不相溶的两相分别称互不相溶的两相分别称为：固定相和流动相。为：固定

5、相和流动相。色谱分离图示 三三、层析的分类、层析的分类根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类 根据实验技术的分类根据实验技术的分类操作压力在操作压力在0.5MPa-5MPa之间之间操作压力在操作压力在5Mpa-40MPa之间之间操作压力小于操作压力小于0.5MPa靠溶质分子在电场中的移动速度靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离不同而分离 根据固定相的形状不同的分类：根据固定相的形状不同的分类：根据流动相的物态不同的分类根据流动相的物态不同的分类 操作方式不同的分类操作方式不同的分类层析分类 分类原则分类原则类型类型特征特征据溶质分子与固定据

6、溶质分子与固定相相互作用的机理相相互作用的机理不同不同吸附色谱吸附色谱离子交换色谱离子交换色谱疏水作用层疏水作用层金属螯合色谱金属螯合色谱共价作用色谱共价作用色谱分配色谱分配色谱凝胶过滤凝胶过滤亲和色谱亲和色谱吸附力不同吸附力不同各物质与固定相之间的离子交换能力的不同各物质与固定相之间的离子交换能力的不同各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同各物质在两液相间的分配系数不同各物质在两液

7、相间的分配系数不同各物质的分子大小或形状不同各物质的分子大小或形状不同利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同据实验技术据实验技术 低压色谱低压色谱中压色谱中压色谱高压色谱高压色谱电泳电泳操作压力小于操作压力小于0.5 0.5 MPaMPa操作压力在操作压力在0.50.55 5 MPaMPa之间之间操作压力在操作压力在5 540 40 MPaMPa之间之间溶质分子在电场中的移动速度不同溶质分子在电场中的移动速度不同据据固固定定相相的的形形状状不不同同柱色谱柱色谱纸色谱纸色谱薄层色谱薄层色谱固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中固定相装在玻璃、不锈钢或有

8、机玻璃柱中固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水固定相在玻璃平板上铺成薄层固定相在玻璃平板上铺成薄层据流动相的物态不据流动相的物态不同同 气相色谱气相色谱液相色谱液相色谱超临界流体色谱超临界流体色谱流动相为气体流动相为气体流动相为液态流动相为液态流动相为液态流动相为液态按操作方式不同按操作方式不同 迎头法迎头法顶替法顶替法洗脱法洗脱法将将混混合合物物溶溶液液连连续续通通过过固固定定相相，只只有有化化学学亲亲和和力力最最弱弱的的组组分分以以纯纯粹粹状状态态最最先先流流出，但其它各组分都不能达到分离。出，但其它各组分都不能达到分离。利利用用一一种种化化学学亲亲和和力力

9、比比各各被被结结合合组组分分都都强强的的物物质质来来洗洗脱脱，这这种种物物质质称称为为顶顶替替剂剂。此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。将将混混合合液液尽尽量量浓浓缩缩，使使体体积积缩缩小小，引引入入固固定定相相的的一一端端，然然后后用用溶溶剂剂洗洗脱脱，洗洗脱脱溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。吸附色谱与其它色谱法的异同点 类型类型机理机理优点优点缺点缺点适用范围适用范围吸附色谱吸附色谱化学、物理吸附化学、物理吸附操作简便操

10、作简便易易受受离离子子干干扰扰各各种种生生物物大大分分子子的的分分离离、脱脱色、和去热源色、和去热源凝胶过滤凝胶过滤分子筛的排阻效应分子筛的排阻效应分分辨辨力力高高，不不会引起变性会引起变性各各种种凝凝胶胶介介质质昂昂贵贵，处处理量有限制理量有限制分分子子量量有有明明显显差差别别的的可可溶溶性性生物大分子生物大分子分配色谱分配色谱溶溶质质在在固固定定相相和和流流动动相相中中分分配配系系数数的的差异差异分分辨辨力力高高，重重复复性性较较好好，能能分离微量物质分离微量物质影影响响因因子子多多，上样量太小上样量太小用用于于各各种种生生物物大大分分子子的的分分析析鉴定鉴定亲和色谱亲和色谱亲亲和和色色谱

11、谱生生物物大大分分子子与与配配体体之之间间有有特特殊亲和力殊亲和力分辨力很高分辨力很高 一一种种配配体体只只能能用用于于一一种种生生物物大大分分子子，局限性大局限性大各各种种生生物物大大分分子子聚焦色谱聚焦色谱等等电电点点和和离离子子交交换换作用作用分辨力高分辨力高进进口口试试制制昂昂贵贵蛋白质和酶蛋白质和酶三、色谱的分类三、色谱的分类两两 相相 物物 理理 状状 态态作作 用用 机机 理理固定相的物理特性固定相的物理特性流动相流动相固定相固定相名名 称称原原 理理名名 称称物理特性物理特性名名 称称液相液相气体气体液相液相固相固相液体液体固体固体液相色谱液相色谱液液色谱液液色谱液固色谱液固色

12、谱气相色谱气相色谱气液色谱气液色谱气固色谱气固色谱分配系数分配系数吸附能力吸附能力分子大小分子大小离子交换离子交换能力能力亲和力亲和力分配系数分配系数吸附能力吸附能力液液分配色谱液液分配色谱液固吸附色谱液固吸附色谱凝胶渗透色谱凝胶渗透色谱离子交换色谱离子交换色谱亲和力色谱亲和力色谱气液分配色谱气液分配色谱气体吸附色谱气体吸附色谱 板状板状 纸纸 一薄层一薄层 根柱子根柱子填充紧密填充紧密空心管壁空心管壁流动相高流动相高压压 根柱子根柱子填充紧密填充紧密空心管壁空心管壁平板色谱平板色谱 纸色谱纸色谱薄层色谱薄层色谱柱色谱柱色谱(液相液相)填充柱色谱填充柱色谱空心柱色谱空心柱色谱高效液相色谱高效液

13、相色谱柱色谱柱色谱(气相气相)填充柱色谱填充柱色谱空心柱色谱空心柱色谱1.5 层析剂种类层析剂种类氧化铝氧化铝硅胶硅胶活性炭活性炭琼脂糖琼脂糖 纤维素纤维素 现代色谱技术中除了分配色谱、吸附色谱外，生物现代色谱技术中除了分配色谱、吸附色谱外，生物制药中广泛使用的还有离子交换色谱、凝胶色谱和亲制药中广泛使用的还有离子交换色谱、凝胶色谱和亲和色谱等。选择的原则：和色谱等。选择的原则：1.易溶于有机溶剂而难溶于水的样品，选择吸附色谱；易溶于有机溶剂而难溶于水的样品，选择吸附色谱；2.水溶液中可解离成离子的水溶性样品，可选用离子交水溶液中可解离成离子的水溶性样品，可选用离子交换色谱；换色谱；3.样品既

14、溶于水，又溶于有机溶剂，可选用分配色谱。样品既溶于水，又溶于有机溶剂，可选用分配色谱。除了平板、纸和薄层色谱外，其余色谱都可以在柱子除了平板、纸和薄层色谱外，其余色谱都可以在柱子中进行，因此柱色谱的应用非常广泛。中进行，因此柱色谱的应用非常广泛。为何选择为何选择色谱色谱作为生物分子纯化方法？作为生物分子纯化方法？不产生热不产生热不产生外力不产生外力高回收率高回收率高分辨率高分辨率线性放大，可预期线性放大，可预期可自动化可自动化大量成功例子大量成功例子Principles of Operation for Chromatography TechniquesGelGelFiltrationFilt

15、rationIonExchangeHydrophobic InteractionAffinity Reversed Phase1.色谱分离种类色谱分离种类第七章第七章 生物大分子的生物大分子的色谱分离与纯化色谱分离与纯化2.分离对象分离对象:酶酶、多糖多糖蛋白质蛋白质核酸等核酸等.3.3.分离类型分离类型:分析色谱分析色谱 (10 mg)(10 mg)中等规模制备色谱中等规模制备色谱(10-50mg)(10-50mg)制备色谱制备色谱 (0.1-1g)(0.1-1g)工业生产规模色谱工业生产规模色谱 (20g/d)(20g/d)国产气相色谱仪HP高压液高压液相相色谱仪美国气相色谱仪4.分离设备

16、分离设备4.分离设备分离设备4.分离设备分离设备制备色谱技术制备色谱技术生产规模制备生产规模制备色谱柱直径色谱柱直径100-800mm中试规模制备中试规模制备色谱柱直径色谱柱直径50-150mm小量制备，小量制备，色谱柱直径色谱柱直径10-40mm4.分离设备分离设备制备液相色谱系列半制备液相色谱半制备液相色谱中试规模制备色谱中试规模制备色谱工业规模制备色谱工业规模制备色谱制备液相色谱制备液相色谱分析液相色谱分析液相色谱5.5.5.5.色谱法的分类色谱法的分类色谱法的分类色谱法的分类按物理状态分类按物理状态分类按物理状态分类按物理状态分类根据流动相的物态：气相色谱法根据流动相的物态：气相色谱法

17、根据流动相的物态：气相色谱法根据流动相的物态：气相色谱法(GC)(GC)(GC)(GC)和液相色谱法和液相色谱法和液相色谱法和液相色谱法(LC)(LC)(LC)(LC)根根根根据据据据固固固固定定定定相相相相的的的的物物物物态态态态：气气气气-固固固固色色色色谱谱谱谱法法法法、气气气气-液液液液色色色色谱谱谱谱法法法法、液液液液-固固固固色谱法、液色谱法、液色谱法、液色谱法、液-液色谱法液色谱法液色谱法液色谱法按使用的形式分类按使用的形式分类按使用的形式分类按使用的形式分类(1)(1)(1)(1)柱色谱、柱色谱、柱色谱、柱色谱、(2)(2)(2)(2)纸色谱、纸色谱、纸色谱、纸色谱、(3)(3

18、)(3)(3)薄层色谱薄层色谱薄层色谱薄层色谱按分离机理分类按分离机理分类按分离机理分类按分离机理分类(1)(1)(1)(1)吸吸吸吸附附附附色色色色谱谱谱谱、(2)(2)(2)(2)分分分分配配配配色色色色谱谱谱谱、(3)(3)(3)(3)离离离离子子子子交交交交换换换换色色色色谱谱谱谱、(4)(4)(4)(4)凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱凝胶色谱6.6.6.6.色谱法的特点色谱法的特点色谱法的特点色谱法的特点 (1)(1)(1)(1)高选择性高选择性高选择性高选择性 (2)(2)(2)(2)高效能高效能高效能高效能 (3)(3)(3)(3)高高高高灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度可可可可以以以以分分分

19、分析析析析质质质质量量量量分分分分数数数数为为为为10101010-6-6-6-610101010-9-9-9-9数数数数量量量量级级级级、检出限量低至检出限量低至检出限量低至检出限量低至10101010-1l-1l-1l-1l g g g g的物质，适于微量和痕量分析。的物质，适于微量和痕量分析。的物质，适于微量和痕量分析。的物质，适于微量和痕量分析。7.7.色谱法的应用色谱法的应用色谱法的应用色谱法的应用(1)(1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析；分析；分析；分析；

20、(2)(2)液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、液相色谱法，在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。应用。应用。应用。(3)(3)(3)(3)色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术，常用于制备分离，得到高纯样品。常用于制备分离，得到高纯样品。

21、常用于制备分离，得到高纯样品。常用于制备分离，得到高纯样品。(4)(4)色谱色谱色谱色谱质谱联用仪已成为研究生物大分子结构质谱联用仪已成为研究生物大分子结构质谱联用仪已成为研究生物大分子结构质谱联用仪已成为研究生物大分子结构 的重要手段。的重要手段。的重要手段。的重要手段。第一节第一节 基本理论基本理论一一 计量置换保留理论计量置换保留理论(1)分析色谱与制备色谱分析色谱与制备色谱:分析色谱分析色谱 灵敏度灵敏度 进样量进样量 毛细管柱色谱毛细管柱色谱 制备色谱制备色谱 分离与纯化较多的分离与纯化较多的 产品产品 增加进样量增加进样量(2)(2)(2)(2)溶质计量置换吸附理论溶质计量置换吸附

22、理论溶质计量置换吸附理论溶质计量置换吸附理论:当一个溶质被吸附剂吸附时，在溶质分子和当一个溶质被吸附剂吸附时，在溶质分子和吸附剂接触表面处必然会释放出一定数目的吸附剂接触表面处必然会释放出一定数目的溶剂分子。溶剂分子。用计量置换这一概念和相同的热力学平衡，用计量置换这一概念和相同的热力学平衡，将多年来物理化学家和色谱学家各自独立进将多年来物理化学家和色谱学家各自独立进行研究的液行研究的液-固吸附机理及溶质在液相色谱中固吸附机理及溶质在液相色谱中的保留机理统一起来。的保留机理统一起来。第一节第一节 基本理论基本理论二二 有效柱长和最短柱长有效柱长和最短柱长 在实际应用中，一般认为色谱柱的长径在实

23、际应用中，一般认为色谱柱的长径比为比为10，是色谱柱较为合适的几何比例。，是色谱柱较为合适的几何比例。对于生物大分子而言，它的保留主要是对于生物大分子而言，它的保留主要是由流动相中置换剂的浓度决定的，柱长由流动相中置换剂的浓度决定的，柱长对生物大分子的分离几乎没有影响，有对生物大分子的分离几乎没有影响，有时会出现短柱较长柱的分离效果还好的时会出现短柱较长柱的分离效果还好的情况。情况。二二 有效柱长和最短柱长有效柱长和最短柱长 不同溶质在其迁移速度大于零，但小于不同溶质在其迁移速度大于零，但小于流动相的线速度时，溶质在色谱柱上的流动相的线速度时，溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献，此时溶质迁移所经

24、迁移对分离有贡献，此时溶质迁移所经历的柱长也对分离有贡献；而当不同溶历的柱长也对分离有贡献；而当不同溶质在其迁移速度等于流动相的线速度时，质在其迁移速度等于流动相的线速度时，溶质迁移所经历的柱长对分离无贡献。溶质迁移所经历的柱长对分离无贡献。二二 有效柱长和最短柱长有效柱长和最短柱长 有效柱长（有效柱长（Leff）：溶质从开始迁移至其）：溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时，溶质在色迁移速度等于流动相速度时，溶质在色谱柱上迁移的距离。又叫有效迁移距离。谱柱上迁移的距离。又叫有效迁移距离。最短柱长最短柱长(Lmin)：混合溶质中使一对最：混合溶质中使一对最难分离的溶质难分离的溶质1和溶质和

25、溶质2的分离度的分离度Rs=1时时所需的最短距离。所需的最短距离。分离度分离度第二节第二节 装置和操作技术装置和操作技术装置包括：流动相供给、进样、色谱柱和装置包括：流动相供给、进样、色谱柱和检测器检测器4大部分。大部分。1.柱色谱系统的组成柱色谱系统的组成 色色谱谱介介质质有有各各种种各各样样，但但柱柱式式色色谱谱系系统统的的组组成成基基本本相相似似，一一般般由由蠕蠕动动泵泵、色色谱谱柱柱、检检测测器器、记记录录仪仪以以及及部分收集器等几个部分构成。部分收集器等几个部分构成。柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成：柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成：A 蠕动泵蠕动泵B 层

26、析柱层析柱C 装柱装柱D 加试样加试样E 洗脱洗脱F 检测器检测器G 部分收集器部分收集器柱层析系统的组成柱层析系统的组成柱层析装置图柱层析装置图 缓缓冲冲液液管管柱柱梯梯度度制制造造器器监监视视器器记录记录器分分划划收收集集器器(1)(2)泵泵(3)(4)(5)adaptorreservoir胶胶体体装装填填胶胶体体A 2 2 纸层析法纸层析法2.1 2.1 基本原理基本原理2.2 2.2 操作方法操作方法2.3 2.3 操作步骤操作步骤小实验小实验当滤纸接触到溶剂时，溶液将上当滤纸接触到溶剂时，溶液将上升。升。滤纸上的小圆点是滤纸上的小圆点是4 4种不同的氨种不同的氨基酸的混合物。基酸的混

27、合物。看看接下来会发生什么事情看看接下来会发生什么事情可以看出可以看出1 1号氨基酸上升的最号氨基酸上升的最高，在滤纸上跑得最快。高，在滤纸上跑得最快。而而4 4号氨基酸与滤纸的结合最号氨基酸与滤纸的结合最紧，因此跑的速度比其他的氨紧，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。基酸慢。1234这就是纸层析法。这就是纸层析法。对照上图，可知道对照上图，可知道1-41-4号的各号的各代表什么氨基酸。代表什么氨基酸。纸层析法是分离鉴定蛋白质的纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。氨基酸组成的重要工具。1234甘氨酸半胱氨酸组氨酸缬氨酸纸层析小实验动画演示纸层析小实验动画演示凝胶装置图色谱峰和分离结果第

28、二节第二节 装置和操作技术装置和操作技术柱层析法的一般技术柱层析法的一般技术 1 1层析柱层析柱 层析柱通常是玻璃的。总的说来，层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨好。但大量物质的处理长柱分辨好。但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。层析柱的则用粗的柱比较适宜。层析柱的基本装置如图。基本装置如图。2 2层析材料的准备层析材料的准备 许多材料都可在层析法中使用。在装许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如，凝胶层析材料需要溶一些预处理。例如，凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化，离胀，吸附剂需要加热或酸

29、处理来活化，离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。电离形式。在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾在用溶剂平衡时，先使材料沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。的堵塞，溶剂的流速将显著降低。3 3 3 3装柱装柱装柱装柱 层析柱的填装是先关闭出层析柱的填装是先关闭出层析柱的填装是先关闭出层析柱的填装是先关闭出口，用溶剂灌注至口，用溶剂灌注至口，用溶剂灌注至口，用溶剂灌注至1 1 1 13 3 3 3体积，体积，体积，体积，并使支持板下的并使支持板下的并使支持板下的并使支持板下的“

30、死体积死体积死体积死体积”不不不不存有气泡，再慢慢地向溶剂中存有气泡，再慢慢地向溶剂中存有气泡，再慢慢地向溶剂中存有气泡，再慢慢地向溶剂中加浆状物，要小心地沿着玻棒加浆状物，要小心地沿着玻棒加浆状物，要小心地沿着玻棒加浆状物，要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。倾注以防止气泡存留在柱内。倾注以防止气泡存留在柱内。倾注以防止气泡存留在柱内。让悬浮液沉淀，并放出过多的让悬浮液沉淀，并放出过多的让悬浮液沉淀，并放出过多的让悬浮液沉淀，并放出过多的溶剂，为了避免分层。最好一溶剂，为了避免分层。最好一溶剂，为了避免分层。最好一溶剂，为了避免分层。最好一次装完，如需分几次填装，则次装完，如需分几次填

31、装，则次装完，如需分几次填装，则次装完，如需分几次填装，则在二次填装前应先在已经沉淀在二次填装前应先在已经沉淀在二次填装前应先在已经沉淀在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注，的表面用玻棒搅拌后再倾注，的表面用玻棒搅拌后再倾注，的表面用玻棒搅拌后再倾注，重复这个过程，直至装到需要重复这个过程，直至装到需要重复这个过程，直至装到需要重复这个过程，直至装到需要的高度。用溶剂彻底洗涤层析的高度。用溶剂彻底洗涤层析的高度。用溶剂彻底洗涤层析的高度。用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面柱后使液面降到比层析床表面柱后使液面降到比层析床表面柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张

32、圆形略高一点。最后覆盖一张圆形略高一点。最后覆盖一张圆形略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布，以免加样时扰滤纸或尼龙布，以免加样时扰滤纸或尼龙布，以免加样时扰滤纸或尼龙布，以免加样时扰乱床表面。乱床表面。乱床表面。乱床表面。4 4加样加样 上柱前，先上柱前，先将样品溶解在溶剂里将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析，样或对洗脱液透析，样品溶液的浓度应该尽品溶液的浓度应该尽可能高些，以减少样可能高些，以减少样品溶液体积，使区带品溶液体积，使区带狭窄。将样品仔细加狭窄。将样品仔细加到层析床的表面，打到层析床的表面，打开旋塞至液面与床面开旋塞至液面与床面齐，然后连接溶剂池，齐，然后连接溶剂池，保持一定高

33、度的液面保持一定高度的液面。4）上样）上样 样品浓度越高越好；上样体积越小，分样品浓度越高越好；上样体积越小，分辨率越高；辨率越高；上样体积一般为床体积的上样体积一般为床体积的15%；例外：例外：G-25脱盐脱盐30%亲和层析亲和层析为床体积的几倍为床体积的几倍 5 5洗脱洗脱 用适当的洗脱液把各组分依次从用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。柱上洗脱下来。3 3）洗脱）洗脱 影响分离效果的主要因素之一：影响分离效果的主要因素之一：洗脱流速。洗脱流速。要求流速合适而恒定。要求流速合适而恒定。洗脱方式洗脱方式 连续洗脱（连续洗脱（continual elution）：）：同一种洗脱液洗脱同一

34、种洗脱液洗脱 分步洗脱分步洗脱（stepwise elution）：）：用两种或两种以上用两种或两种以上不同洗脱液分段洗脱不同洗脱液分段洗脱 梯度洗脱梯度洗脱（gradient elution）：）：梯度改变洗脱液的梯度改变洗脱液的pH值、离子强度或极性值、离子强度或极性 梯度洗脱液的制备装置：梯度混合器、梯度三通梯度洗脱液的制备装置：梯度混合器、梯度三通阀或简易梯度形成装置阀或简易梯度形成装置 梯度形式：直线梯度、阶梯式梯度、凹指数梯度、梯度形式：直线梯度、阶梯式梯度、凹指数梯度、凸指数梯度以及复合梯度凸指数梯度以及复合梯度 浓度梯度制造器浓度梯度制造器 6.6.部分收集及分析部分收集及分析

35、 柱的流出液可以用人工的方法收集到一系柱的流出液可以用人工的方法收集到一系列试管中或使用部分收集器。这种装置能使列试管中或使用部分收集器。这种装置能使每一管按照预定的时间或滴数收集流出液，每一管按照预定的时间或滴数收集流出液，然后自动移位，下一管再继续收集。洗脱完然后自动移位，下一管再继续收集。洗脱完毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多毕后可选用各种适宜的方法将已收集的许多部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的部分流出液进行定量分析，并画出洗脱物的量对流出液体积的洗脱曲线。每一部分的蛋量对流出液体积的洗脱曲线。每一部分的蛋白质或核酸的含量可以让流出液通过一个流白质或核酸的含量可以让流出液通过

36、一个流动小室测定其动小室测定其280 nm280 nm或或260 nm260 nm的光吸收来进的光吸收来进行连续监测。行连续监测。6 洗脱液的分部收集洗脱液的分部收集 收集的办法：用小试管每管收集一定的体积，直到洗脱收集的办法：用小试管每管收集一定的体积，直到洗脱完毕为止。完毕为止。收集的体积（或时间）：随样品的性质、填料、柱子的收集的体积（或时间）：随样品的性质、填料、柱子的直径和流动相而变化。一般每管收集的体积直径和流动相而变化。一般每管收集的体积 为为35mL（实实验室）。验室）。收集的总体积：离子交换层析为床体积的收集的总体积：离子交换层析为床体积的3倍；倍；凝胶层析为凝胶层析为1个床

37、体积个床体积 6）洗脱液的检测和合并）洗脱液的检测和合并 分部收集的试管内的化合物需要进行定性或分部收集的试管内的化合物需要进行定性或/和定量鉴定。和定量鉴定。鉴定的方法根据目的物的性质而确定。鉴定的方法根据目的物的性质而确定。小分子化合物：脂类、糖类和氨基酸小分子化合物：脂类、糖类和氨基酸薄层层析或纸层析薄层层析或纸层析显色反应。显色反应。大分子化合物：蛋白质和核酸大分子化合物：蛋白质和核酸分光光度法测定光吸收值。分光光度法测定光吸收值。蛋白质：蛋白质：280nm；DNA和和RNA：254nm。洗脱液可通过紫外检测器进行连续监测，并将结果由记录洗脱液可通过紫外检测器进行连续监测，并将结果由记

38、录仪描绘出来；根据吸收曲线收集、合并相关试管的洗脱液，以仪描绘出来；根据吸收曲线收集、合并相关试管的洗脱液，以进一步处理。进一步处理。第三节第三节 色谱条件及色谱分离纯化色谱条件及色谱分离纯化工艺的最优化工艺的最优化色谱条件及色谱分离纯化工艺的优化非色谱条件及色谱分离纯化工艺的优化非常关键，即使是相同的仪器和色谱柱，常关键，即使是相同的仪器和色谱柱，用不同的工艺，所分离和纯化的效果也用不同的工艺，所分离和纯化的效果也不一样。不一样。第三节第三节 色谱条件及色谱分离色谱条件及色谱分离纯化工艺的最优化纯化工艺的最优化用色谱法来解决预分用色谱法来解决预分离和复姓便成为色谱离和复姓便成为色谱工作者当今

39、快速分离工作者当今快速分离和纯化及降低治疗蛋和纯化及降低治疗蛋白或诊断蛋白的一个白或诊断蛋白的一个热门研究课题。热门研究课题。需要优化条件需要优化条件固定相固定相固定相固定相:种类种类种类种类 颗粒颗粒颗粒颗粒 孔径孔径孔径孔径流动相流动相流动相流动相:组分恒定组分恒定组分恒定组分恒定 组分变化组分变化组分变化组分变化柱尺寸柱尺寸柱尺寸柱尺寸流速流速流速流速洗脱方式洗脱方式洗脱方式洗脱方式质量回收率质量回收率质量回收率质量回收率活性回收率活性回收率活性回收率活性回收率发酵工艺对纯化工艺影响很大。发酵工艺对纯化工艺影响很大。发酵工艺对纯化工艺影响很大。发酵工艺对纯化工艺影响很大。例如例如例如例如

40、:白细胞介素白细胞介素白细胞介素白细胞介素-2-2的发酵过程中的发酵过程中的发酵过程中的发酵过程中,用正亮氨酸替代蛋氨酸用正亮氨酸替代蛋氨酸用正亮氨酸替代蛋氨酸用正亮氨酸替代蛋氨酸,可使产物发生可使产物发生可使产物发生可使产物发生不可预计免疫遗失不可预计免疫遗失不可预计免疫遗失不可预计免疫遗失,从而得到非均一性产品从而得到非均一性产品从而得到非均一性产品从而得到非均一性产品.如在发酵如在发酵如在发酵如在发酵介质中加入低浓度的异亮氨酸或蛋氨酸，这种馋和作介质中加入低浓度的异亮氨酸或蛋氨酸，这种馋和作介质中加入低浓度的异亮氨酸或蛋氨酸，这种馋和作介质中加入低浓度的异亮氨酸或蛋氨酸，这种馋和作用可以

41、去除。用可以去除。用可以去除。用可以去除。如何优化色谱条件如何优化色谱条件首先选择色谱柱类型首先选择色谱柱类型然后选择色谱柱的填料（颗粒和尺寸）然后选择色谱柱的填料（颗粒和尺寸）接着确定柱尺寸的大小接着确定柱尺寸的大小接着选择流动相（组成、流速和洗脱方式）接着选择流动相（组成、流速和洗脱方式）最后一旦选定了几种不同色谱的最优化条最后一旦选定了几种不同色谱的最优化条件，接着便是如何将这些单元进行组合以件，接着便是如何将这些单元进行组合以得到最佳分离和纯化工艺了。得到最佳分离和纯化工艺了。最优化要以产品质量和经济效益为目的。最优化要以产品质量和经济效益为目的。线性放大线性放大固定以下条件1.相同线

42、行流速2.相同缓冲液3.相同填料4.相同柱高5.相同样品浓度和pH6.相同样品体积和柱床体积比例7.相同梯度体积和柱床体积比例放大1.柱直径2.体积流速3.上样体积开发纯化工艺的注意点开发纯化工艺的注意点开发纯化工艺的注意点开发纯化工艺的注意点 建立检测方法建立检测方法建立检测方法建立检测方法确立目标确立目标确立目标确立目标 (纯度和产量纯度和产量纯度和产量纯度和产量)目标蛋白的性质目标蛋白的性质目标蛋白的性质目标蛋白的性质使用不同原理的纯化方法使用不同原理的纯化方法使用不同原理的纯化方法使用不同原理的纯化方法减少步骤减少步骤减少步骤减少步骤尽量减少每步之间样品条件的改变尽量减少每步之间样品条

43、件的改变尽量减少每步之间样品条件的改变尽量减少每步之间样品条件的改变选用高选择性的方法选用高选择性的方法选用高选择性的方法选用高选择性的方法 -提高效率提高效率提高效率提高效率快速去除蛋白水解酶快速去除蛋白水解酶快速去除蛋白水解酶快速去除蛋白水解酶在早期步骤中缩小样品体积在早期步骤中缩小样品体积在早期步骤中缩小样品体积在早期步骤中缩小样品体积工艺方法尽量简单工艺方法尽量简单工艺方法尽量简单工艺方法尽量简单!第四节第四节 蛋白质的色谱复性与纯化蛋白质的色谱复性与纯化一一 各种液相色谱的蛋白质复性法优点：各种液相色谱的蛋白质复性法优点：1.1.快速去除变性剂；快速去除变性剂；2.2.由于色谱固定相

44、变性蛋白质的吸附，可明显由于色谱固定相变性蛋白质的吸附，可明显地减少甚至完全地消除变性蛋白质分子在脱离变地减少甚至完全地消除变性蛋白质分子在脱离变性剂的环境后的分子聚集；性剂的环境后的分子聚集；3.3.在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的，分离以达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；使复性和纯化同时进行；4.4.便于回收变性剂。便于回收变性剂。目前用于蛋白质复性的目前用于蛋白质复性的LCLC方法包括方法包括HICHIC、IECIEC、SECSEC、AFC4AFC4种。种。1.IEC1.IEC2.AFC2.AFCAFC（亲和层析法）

45、亲和层析法）利用配体与目标蛋白质间的特异性的亲利用配体与目标蛋白质间的特异性的亲和作用，使变性蛋白质保留在柱内的顶和作用，使变性蛋白质保留在柱内的顶端从而与变性剂分离。然后再使变性蛋端从而与变性剂分离。然后再使变性蛋白质在洗脱过程中进行复性。白质在洗脱过程中进行复性。依依AFC柱端基不同，可将其分为固定化柱端基不同，可将其分为固定化 金属亲和色谱（金属亲和色谱（IMAC），），脂质体亲和脂质体亲和 色谱和分子伴侣亲和色谱。色谱和分子伴侣亲和色谱。3.SEC3.SECSEC(SEC(空间排阻色谱）空间排阻色谱）复性复性复性复性机理机理机理机理：在变性蛋白质进入柱顶端时，：在变性蛋白质进入柱顶端时

46、，：在变性蛋白质进入柱顶端时，：在变性蛋白质进入柱顶端时，因有高浓度变性剂的存在，变性蛋白质因有高浓度变性剂的存在，变性蛋白质因有高浓度变性剂的存在，变性蛋白质因有高浓度变性剂的存在，变性蛋白质分子有一个随机的构象状态和大的动力学分子有一个随机的构象状态和大的动力学分子有一个随机的构象状态和大的动力学分子有一个随机的构象状态和大的动力学水合半径，不能进入柱的空隙，蛋白质水合半径，不能进入柱的空隙，蛋白质水合半径，不能进入柱的空隙，蛋白质水合半径，不能进入柱的空隙，蛋白质在在在在SECSECSECSEC柱上不保留。当使用复性缓冲液时柱上不保留。当使用复性缓冲液时柱上不保留。当使用复性缓冲液时柱上

47、不保留。当使用复性缓冲液时，因其逐步取代变性剂并使蛋白质降低，因其逐步取代变性剂并使蛋白质降低，因其逐步取代变性剂并使蛋白质降低，因其逐步取代变性剂并使蛋白质降低，使变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高使变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高使变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高使变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高能状态，这些蛋白质就自发地向热力学稳能状态，这些蛋白质就自发地向热力学稳能状态，这些蛋白质就自发地向热力学稳能状态，这些蛋白质就自发地向热力学稳定的低能态定的低能态定的低能态定的低能态-即蛋白质的天然状态转化，从即蛋白质的天然状态转化，从即蛋白质的天然状态转化，从即蛋白质的天然状态转化，从而

48、使蛋白质开始复性。随着时间推移，当而使蛋白质开始复性。随着时间推移，当而使蛋白质开始复性。随着时间推移，当而使蛋白质开始复性。随着时间推移，当蛋白质分子结构变得更加紧密时，蛋白质蛋白质分子结构变得更加紧密时，蛋白质蛋白质分子结构变得更加紧密时，蛋白质蛋白质分子结构变得更加紧密时，蛋白质在两相间分配逐渐增加。当蛋白质进入填在两相间分配逐渐增加。当蛋白质进入填在两相间分配逐渐增加。当蛋白质进入填在两相间分配逐渐增加。当蛋白质进入填料的空隙后，其扩散速度减缓，从而限制料的空隙后，其扩散速度减缓，从而限制料的空隙后，其扩散速度减缓，从而限制料的空隙后，其扩散速度减缓，从而限制了蛋白质的聚合，这样就减少

49、了沉淀产生。了蛋白质的聚合，这样就减少了沉淀产生。了蛋白质的聚合，这样就减少了沉淀产生。了蛋白质的聚合，这样就减少了沉淀产生。4.4.高效疏水色谱（高效疏水色谱（HICHIC）原理：在高离子强度的盐水溶液淋原理：在高离子强度的盐水溶液淋洗条件下，蛋白质的疏水部分与填料表洗条件下，蛋白质的疏水部分与填料表面的疏水基团相互作用而被吸附。淋洗面的疏水基团相互作用而被吸附。淋洗液的离子强度降低，蛋白质依疏水性特液的离子强度降低，蛋白质依疏水性特征依次被洗脱。即高盐浓度吸附，低盐征依次被洗脱。即高盐浓度吸附，低盐浓度洗脱。浓度洗脱。HICHIC的特征的特征 对基质没有特殊要求，基质表面具有较弱的疏水基团

50、，对基质没有特殊要求，基质表面具有较弱的疏水基团，对基质没有特殊要求，基质表面具有较弱的疏水基团，对基质没有特殊要求，基质表面具有较弱的疏水基团，孔径在孔径在孔径在孔径在25100um25100um25100um25100um 避免使用了大量有机溶剂的淋洗，有效保护了被分离避免使用了大量有机溶剂的淋洗，有效保护了被分离避免使用了大量有机溶剂的淋洗，有效保护了被分离避免使用了大量有机溶剂的淋洗，有效保护了被分离物质的生物活性。物质的生物活性。物质的生物活性。物质的生物活性。具有具有具有具有“一石四鸟一石四鸟一石四鸟一石四鸟”的作用，尤其是纯化大肠杆菌表达的作用，尤其是纯化大肠杆菌表达的作用，尤其