教学ppt课件：课题2.3土壤中尿素细菌的分离---分解纤维素的微生物的分离.ppt

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1、尿素分子的立体结构（一）筛选菌株（一）筛选菌株水生耐热细菌Taq(Thermus aquaticus)耐高温的Taq DNA聚合酶美国微生物学科布鲁克（T.Brock)1966年发现耐热细菌选择培养基选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目统计菌落数目的理论依据：统计菌落数目的理论依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进

2、行计数。说说明明设设置置重重复复组组的的重重要要性性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。（二）设置对照（二）设置对照一一是是由由于于土土样样不不同同，二二是是由由于于培培养养基基污污染染或或操操

3、作作失失误误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一一种种方方案案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另另一一种种方方案案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。一一 土壤取样土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。二二 样品的稀释样品的稀释为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量

4、和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。三三 微生物的培养与观察微生物的培养与观察 一一 无菌操作无菌操作1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。二二 做好标记做好标记注明培养基

5、种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。三三 规划时间规划时间1、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30300的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？（一）空气中微生物总数的检测（二）水中细菌总数的检测（三）牛奶中细菌的分离与计数（四）土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数专题专题2:2:微生物的培养与应用微生物的培养与应用课题目标课题目标1 1、简述纤维素酶的种类和作用；、简述纤维素酶的种类和

6、作用；2 2、从土壤中分离出分解纤维素的微生物；、从土壤中分离出分解纤维素的微生物；3 3、讨论这类微生物的应用价值；、讨论这类微生物的应用价值；研究对象：研究对象：分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物课题重点、难点课题重点、难点 重点：重点：从土壤中分离出分解纤维素的微生物；从土壤中分离出分解纤维素的微生物；难点：难点：从土壤中分离出分解纤维素的微生物；从土壤中分离出分解纤维素的微生物；一、基础知识一、基础知识（一）纤维素与纤维素酶（一）纤维素与纤维素酶（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选（一）纤维素与纤维素酶（一）纤维素与纤维素酶:1 1、纤维素：一种由、纤维素：一种由葡萄糖葡

7、萄糖首尾相连而成的首尾相连而成的高分高分子化合物子化合物，是地球上含量最丰富的多糖。，是地球上含量最丰富的多糖。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物、木材、秸秆也富含纤维素，许多商品纤维物、木材、秸秆也富含纤维素，许多商品纤维素都是由天然纤维素制得：如水溶性的羧甲基素都是由天然纤维素制得：如水溶性的羧甲基纤维素钠（纤维素钠（a a）、不溶于水的微晶纤）、不溶于水的微晶纤维素等维素等（一）纤维素与纤维素酶（一）纤维素与纤维素酶:2 2、纤维素酶：、纤维素酶：一种复合酶，至少包括三种组分一种复合酶，至少包括三种组分一种复合酶，至少包括三种组分一种复合酶，至少包

8、括三种组分C1C1C1C1酶（外切酶）：酶（外切酶）：酶（外切酶）：酶（外切酶）：又称纤维二糖水解酶，作用于纤维又称纤维二糖水解酶，作用于纤维又称纤维二糖水解酶，作用于纤维又称纤维二糖水解酶，作用于纤维 素的结晶区或小片段纤维素，从末端切掉素的结晶区或小片段纤维素，从末端切掉素的结晶区或小片段纤维素，从末端切掉素的结晶区或小片段纤维素，从末端切掉 两个分子葡萄糖产生纤维二糖；两个分子葡萄糖产生纤维二糖；两个分子葡萄糖产生纤维二糖；两个分子葡萄糖产生纤维二糖；CxCxCxCx酶（内切酶）：酶（内切酶）：酶（内切酶）：酶（内切酶）：作用于无定型的纤维素区域，使纤作用于无定型的纤维素区域，使纤作用于

9、无定型的纤维素区域，使纤作用于无定型的纤维素区域，使纤 维素断裂成片段；维素断裂成片段；维素断裂成片段；维素断裂成片段；葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：葡萄糖苷酶：将纤维二糖水解成葡萄糖将纤维二糖水解成葡萄糖将纤维二糖水解成葡萄糖将纤维二糖水解成葡萄糖纤维素纤维素纤维素纤维素C1C1C1C1酶、酶、酶、酶、CxCxCxCx酶酶酶酶纤维二糖纤维二糖纤维二糖纤维二糖纤维二糖纤维二糖纤维二糖纤维二糖葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖（终产物）葡萄糖（终产物）葡萄糖（终产物）葡萄糖（终产物）小实验：体会纤维素酶的作用小实验：体会纤维素酶的作用滤纸滤纸被分被分解解不加不加10ml滤纸滤纸

10、条条2号号试试管管滤纸滤纸未被未被分解分解2支支试试管固定在管固定在50ml的的锥锥形瓶中，形瓶中，140 r/min转转速振速振荡荡反反应应 1h（如无（如无摇摇床可以采用定床可以采用定时时人工振人工振荡荡的方的方法）法）1ml11ml滤纸滤纸条条1号号试试管管观观察察记录记录结结果果纤维纤维素素酶酶：（70-80U）醋酸醋酸醋酸醋酸钠缓钠缓冲液：冲液：0.1mol/l滤纸滤纸条：条：1cm m6cm6cm试试管管编编号号小实验：体会纤维素酶的作用小实验：体会纤维素酶的作用 1U 1U表示表示1 1个酶个酶活力单位，是指活力单位，是指在在2525，其他反，其他反应条件均最适宜应条件均最适宜情

11、况下（如情况下（如PH等）等），1min内转化内转化1mmol底物所需底物所需的酶的量。的酶的量。刚果红染色法刚果红染色法;:;:刚果红刚果红（Congo Red,Congo Red,简简称称CR)CR)染料可以与像染料可以与像纤维素这样的多糖形成纤维素这样的多糖形成红色复合物红色复合物，但，但并不和并不和水解后的水解后的纤维二糖和纤维二糖和葡萄糖葡萄糖发生这种发生这种反应反应。在含纤维素的培养基。在含纤维素的培养基中加入刚果红时便形成了红色复合物。当中加入刚果红时便形成了红色复合物。当纤纤维素被维素被纤维素分解酶纤维素分解酶分解分解后，后，刚果红刚果红 纤纤维素复合物就无法形成维素复合物就无

12、法形成，培养基上会出现，培养基上会出现以以纤维素分解菌为中心的透明圆圈纤维素分解菌为中心的透明圆圈，通过透明，通过透明圆圈来圆圈来筛选纤维素分解菌筛选纤维素分解菌。（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选二、实验设计二、实验设计土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释取样涂布：将样品取样涂布：将样品涂布到鉴别纤维素涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上分解菌的培养基上挑选产生透挑选产生透明圈的菌落明圈的菌落1 1 1 1、培养基类型：、培养基类型：、培养基类型：、培养基类型：选择培养基选择培养基选择培养基选择培养基2 2、培养基特点：、

13、培养基特点：纤维素作为碳源纤维素作为碳源。3 3、培养基配方：、培养基配方：制备培养基：制备培养基：选择培养基选择培养基纤维素粉纤维素粉5g5gNaNONaNONaNONaNO3 3 3 31g1gNaNaNaNa2 2 2 2HPOHPOHPOHPO4 4 4 47H7H7H7H2 2 2 2OOOO1.2g1.2gKHKHKHKH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 4 0.9g0.9gMgSOMgSOMgSOMgSO44447H7H7H7H2 2 2 2OOOO0.5g0.5gKClKClKClKCl0.5g0.5g酵母膏酵母膏0.5g0.5g水解酪素水解酪素0.5g0.5g上述物质

14、溶解后加上述物质溶解后加蒸馏蒸馏水定容至水定容至1000ml1000ml4 4 4 4、培养基的制备：、培养基的制备：、培养基的制备：、培养基的制备：（1 1 1 1）计算、称量：）计算、称量：）计算、称量：）计算、称量：按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取纤维素粉纤维素粉、NaNO3NaNO3NaNO3NaNO3、Na2HPO4Na2HPO4Na2HPO4Na2HPO47H2O7H2O7H2O7H2O、KHKHKHKH2 2 2 2PO4PO4PO4PO4、KClKClKClKCl、MgSO47H2OMgSO47H2OMgSO47H2OMgSO47

15、H2O、酵母膏、水解酪素酵母膏、水解酪素备用；备用；备用；备用；（2 2 2 2）溶化：溶化：蒸馏水中加入蒸馏水中加入上述药品后上述药品后上述药品后上述药品后搅拌使溶解，完全搅拌使溶解，完全溶解后补加蒸馏水至溶解后补加蒸馏水至1000ml1000ml；调；调pHpH。（3 3）灭菌：）灭菌：将将50ml50ml培养基用玻棒转移至三角瓶中，塞培养基用玻棒转移至三角瓶中，塞上棉塞，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为上棉塞，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa100kPa、温度为温度为121121，灭菌，灭菌151530min30min。将培养皿用旧报纸包。将培养皿用旧报纸包裹（裹（5-85-8套

16、为一包），放入干热灭菌箱内，在套为一包），放入干热灭菌箱内，在160160170 170 下灭菌下灭菌2h2h。（液体培养基不用倒平板）（液体培养基不用倒平板）制备培养基：制备培养基：选择培养基选择培养基1 1 1 1、培养基类型：、培养基类型：、培养基类型：、培养基类型：鉴别培养基鉴别培养基鉴别培养基鉴别培养基2 2、培养基特点：、培养基特点：加入刚果红加入刚果红。3 3、培养基配方：、培养基配方：制备培养基：制备培养基：鉴别培养基鉴别培养基CMCCMCCMCCMCNaNaNaNa5-10g5-10g酵母膏酵母膏1g1gKHKHKHKH2 2 2 2POPOPOPO4 4 4 4 0.25g

17、0.25g琼脂琼脂15g15g土豆汁土豆汁100ml100ml上述物质溶解后加蒸馏水定容至上述物质溶解后加蒸馏水定容至1000ml1000ml4 4 4 4、培养基的制备：、培养基的制备：、培养基的制备：、培养基的制备：（1 1 1 1）计算、称量：）计算、称量：）计算、称量：）计算、称量：按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取按比例和用量准确称取酵母膏、酵母膏、CMCCMCCMCCMCNaNaNaNa、KH2PO4KH2PO4KH2PO4KH2PO4、琼脂、土豆汁琼脂、土豆汁 备用；备用；备用；备用；（2 2 2 2）溶化：溶化：蒸馏水中加入酵母膏、蒸馏水中加入酵母膏、

18、CMCCMCCMCCMCNaNaNaNa、KH2PO4KH2PO4KH2PO4KH2PO4、土豆汁土豆汁后后后后搅拌使溶解充分加入搅拌使溶解充分加入15g15g琼脂琼脂加热熔化，并不断搅拌防，琼脂完全融化后补加蒸加热熔化，并不断搅拌防，琼脂完全融化后补加蒸馏水至馏水至1000ml1000ml；调；调pHpH制备培养基：制备培养基：鉴别培养基鉴别培养基（3 3）灭菌：）灭菌：将适量培养基用玻棒转移至三角瓶将适量培养基用玻棒转移至三角瓶中，塞上棉塞，高压蒸气灭菌，在压力中，塞上棉塞，高压蒸气灭菌，在压力100kPa100kPa、温度为温度为121121，灭菌，灭菌151530min30min。将培

19、养皿干热。将培养皿干热灭菌，在灭菌，在160160170 170 下灭菌下灭菌2h2h。（4 4）加入刚果红）加入刚果红(CR):(CR):配制配制10mg/ml10mg/ml的的CRCR溶液，溶液，灭菌后，按照每灭菌后，按照每200 ml200 ml培养基加培养基加1 ml1 ml的比例加的比例加入入CRCR溶液，混匀。溶液，混匀。（4 4）倒平板：）倒平板：待培养基冷却到待培养基冷却到50 50 左右时在酒左右时在酒精灯火焰附近倒平板。（倒平板操作同上节）精灯火焰附近倒平板。（倒平板操作同上节）制备培养基：制备培养基：鉴别培养基鉴别培养基（一）土壤取样：资料一（一）土壤取样：资料一1 1、

20、取样环境：、取样环境：富含纤维素的环境中富含纤维素的环境中，如多年落叶形成的，如多年落叶形成的腐殖土腐殖土、多年积累的多年积累的枯枝败叶枯枝败叶等环境，滤纸埋入图土壤（深等环境，滤纸埋入图土壤（深10cm10cm左右）左右）30 d30 d左右，从左右，从已腐烂的滤纸已腐烂的滤纸上筛选。上筛选。2 2、原因：、原因：由于生物与环境的相互依存，在富含纤维素的环由于生物与环境的相互依存，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的境中，纤维素分解菌的含量相对提高含量相对提高，因此从这种，因此从这种土样中获得目的微生物的土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境几率要高于普通环境。滤纸埋入土壤是人工设置纤维素

21、分解菌的事宜环滤纸埋入土壤是人工设置纤维素分解菌的事宜环境，使境，使纤维素分解菌相对密集含量提高纤维素分解菌相对密集含量提高；埋入；埋入深深度度约约为为10cm左右。左右。旁栏思考旁栏思考:如果找不到合适的环境，可将滤纸埋在土如果找不到合适的环境，可将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应埋进土壤中多深？应埋进土壤中多深？将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约般应将滤纸埋于深约1

22、0cm10cm左右的土壤中。左右的土壤中。旁栏思考旁栏思考:为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌素分解菌 由于生物与环境的相互依存，在富含纤维素的环由于生物与环境的相互依存，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。（二）选择培养：资料二（二）选择培养：资料二资料二：在将样品稀释涂布资料二：在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养到鉴别纤维素分解菌的培养基上之前，通过选择培养增基上之前，通过选择培养增加纤维

23、素分解菌的浓度，以加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所确保能够从样品中分离到所需微生物。请分析旁栏培养需微生物。请分析旁栏培养基配方，回答问题：基配方，回答问题：（二）选择培养：资料二（二）选择培养：资料二1.1.选择培养的目的：选择培养的目的：增加增加纤维素分解菌的纤维素分解菌的浓度浓度，以，以确保确保能够从样品能够从样品中中分离到所需要的微生物。分离到所需要的微生物。2.2.选择培养基：选择培养基：（1 1）特点：以纤维素作为主要碳源（唯一碳源）特点：以纤维素作为主要碳源（唯一碳源）（2 2）作用：）作用：增加增加纤维素分解菌的纤维素分解菌的浓度浓度，以，以确保确保能够从能够从

24、样品中样品中分离到所需要的微生物。分离到所需要的微生物。适合于纤维素分解菌的生存并适合于纤维素分解菌的生存并选择增殖提高浓度选择增殖提高浓度；抑制其他微生物的增殖抑制其他微生物的增殖使其浓度降低或不能增殖使其浓度降低或不能增殖参照选择培养基的比例配置，回答下列问题参照选择培养基的比例配置，回答下列问题（1 1）旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？）旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？为什么？是是液体培养基液体培养基；原因是配方中；原因是配方中无凝固剂无凝固剂，液体，液体培养基有培养基有利于微生物与营养物质充分接触利于微生物与营养物质充分接触，有利于有利于培养增殖培养增殖（此处目

25、的不是为了形成菌落，而是（此处目的不是为了形成菌落，而是侧重侧重于培养增殖于培养增殖浓度提高浓度提高）2.2.选择培养基：选择培养基：（3 3）你能否设计一个对照实验，说明选择培养基）你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？的作用？用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照预期结果：预期结果：牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基：多种微生物可以增殖，：多种微生物可以增殖，纤维素分解菌的纤维素分解菌的浓度不会提高浓度不会提高；选择培养基：选择培养基：其他微生物浓度降低，纤维素分其他微生物浓度降低，纤维素分 解菌解菌浓度提高浓度提高，得到较好的实验效果，得到较好的实验效果（2

26、2）这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果）这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？具有，是如何进行选择的？有；碳源是纤维素，能分解纤维素的微生物可以大有；碳源是纤维素，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖量繁殖3.3.选择培养的操作方法：选择培养的操作方法：在腐殖土、枯枝败叶、腐烂滤纸取土样加入装有在腐殖土、枯枝败叶、腐烂滤纸取土样加入装有30ml30ml选择培养基选择培养基的的锥形瓶锥形瓶中，将锥形瓶固定在中，将锥形瓶固定在摇床摇床上上（如无摇床，可用定时人工摇晃锥形瓶的办法），在（如无摇床，可用定时人工摇晃锥形瓶的办法），在一定温度下一定温度下振荡培养振荡培养1 1

27、2 2天天，直至，直至培养液变浑浊培养液变浑浊（分（分解纤维素的微生物比例增大）解纤维素的微生物比例增大）。吸取一定的培养液。吸取一定的培养液（如（如5ml5ml），转移到另外一瓶新鲜的选择培养液中，），转移到另外一瓶新鲜的选择培养液中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。以同样的方法培养到培养液变浑浊。可重复选择培养可重复选择培养增加纤维素分解菌浓度使之更高；如样品中纤维素分增加纤维素分解菌浓度使之更高；如样品中纤维素分解菌浓度较高，选择培养可不进行。解菌浓度较高，选择培养可不进行。旁栏思考：为何选择培养能够旁栏思考：为何选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？1 1、可使能、可使能

28、适应适应选择培养基选择培养基的的微生物得到微生物得到迅速繁殖迅速繁殖；2 2、不适应不适应选择培养基选择培养基的的微生物的微生物的繁殖被抑制繁殖被抑制；因此可以因此可以起到起到“浓缩浓缩”的作用的作用旁栏思考：本实验流程与课题旁栏思考：本实验流程与课题2中实验流程有何异同？中实验流程有何异同？差异差异 课题课题2 2：菌液：菌液直接涂布直接涂布在以尿素为唯一氮源的固体在以尿素为唯一氮源的固体 选择培养基选择培养基上，上，直接分离获得菌落直接分离获得菌落；本课题：本课题：通过通过液体选择培养基液体选择培养基，使，使纤维素分解菌纤维素分解菌 得得到到增殖浓度提高增殖浓度提高后，后，再再将菌液将菌液

29、涂布涂布在纤维素在纤维素 鉴别（刚果红）培养基上获得菌落鉴别（刚果红）培养基上获得菌落。相同：其他步骤两者基本相同相同：其他步骤两者基本相同按照课题按照课题1 1的稀释操作方法，将选择培的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数到到10106 6（三）梯度稀释：（三）梯度稀释：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各取的菌悬液各取0.1ml0.1ml涂布在涂布在CRCR鉴别培养基鉴别培养基上，上，3030倒置培养倒置培养（四）取样涂布：（四）取样涂布：刚果红染色法：含刚果红染色法：含CR的的鉴别培养基鉴别培养基1 1、

30、筛选原理：、筛选原理：2 2、资料二：刚果红染色方法、资料二：刚果红染色方法（1 1）方法一：）方法一：（先培养微生物再加入刚果红进行颜色反应）：在长出菌落的培养基上覆盖质量浓度为：在长出菌落的培养基上覆盖质量浓度为1mg/ml 1mg/ml 的的CRCR溶溶液，液，10-15min10-15min后倒去后倒去CRCR溶液，加入质量浓度为溶液，加入质量浓度为1mol/l1mol/l的的NaClNaCl溶液，溶液，15min15min后倒掉后倒掉NaClNaCl溶液，此时产生纤维素酶溶液，此时产生纤维素酶的菌落周围将出现透明圈；的菌落周围将出现透明圈；（2 2）方法二：（）方法二：（在倒平板时就

31、加入刚果红）：配制：配制10mg/ml10mg/ml的的CRCR溶液，灭菌后，按照每溶液，灭菌后，按照每200 ml200 ml培养基加培养基加1 1 mlml的比例加入的比例加入CRCR溶液，混匀后倒平板，等长出菌落后，产溶液，混匀后倒平板，等长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将出现明显的透明圈。生纤维素酶的菌落周围将出现明显的透明圈。方法一缺点是操作方法一缺点是操作繁琐繁琐，加入刚果红溶液会使，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂菌落之间发生混杂；优点是这样显示出的；优点是这样显示出的颜色反应基颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用本上是纤维素分解菌的作用 方法二优点是方法二优点是操作简便操作简

32、便，不存在菌落混杂问题不存在菌落混杂问题缺点一是由于培养基中还含有淀粉类物质，可以缺点一是由于培养基中还含有淀粉类物质，可以使使能产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应能产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应；缺点二；缺点二有有些微生物些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会程中会降解刚果红降解刚果红，形成明显的透明圈，形成明显的透明圈，与纤维素分与纤维素分解菌解菌不易区分不易区分旁栏思考：想一想这两种方法各有哪些优点与不足？旁栏思考：想一想这两种方法各有哪些优点与不足？你打算选用哪一种？你打算选用哪一种？（五）挑选产生透明圈的菌落（五）挑选产生透明圈的菌

33、落 挑取产生挑取产生明显透明明显透明圈圈的菌落，一般即为的菌落，一般即为分解纤维素的菌落分解纤维素的菌落。接种到纤维素分解接种到纤维素分解菌的选择培养基上，菌的选择培养基上，在在30300 0C C 37370 0C C培养，培养，可获得纯培养。可获得纯培养。本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。只是分离纯化的第一步。为确定为确定得到的是得到的是纤维素分解菌纤维素分解菌，还需，还需要进行要进行发酵产纤维素酶的实验发酵产纤维素酶的实验，发酵方法有，发酵方法有液体发酵液体发酵和和固体发固体发酵酵两种。纤维素酶的两种

34、。纤维素酶的测定方法测定方法一般是一般是对纤维素酶分解滤纸等纤对纤维素酶分解滤纸等纤维素维素后所后所产生的葡萄糖产生的葡萄糖进行进行定量的测定定量的测定。三、课题延伸三、课题延伸发酵发酵产纤产纤维素维素酶的酶的实验实验液体发酵液体发酵固体发酵固体发酵（纤维素酶）（纤维素酶）滤纸滤纸等纤等纤维素维素葡萄糖：定量测定葡萄糖：定量测定发酵发酵1 1、你选用了哪种实验用品来分离纤维素分解菌、你选用了哪种实验用品来分离纤维素分解菌?取样环取样环境有什么特点？作出选择的理由是什么？境有什么特点？作出选择的理由是什么？四、结果分析与评价四、结果分析与评价腐殖土、多年积累的枯枝败叶、埋入土壤腐殖土、多年积累的

35、枯枝败叶、埋入土壤10cm10cm经经30d30d左右腐烂的左右腐烂的滤纸；富含纤维素分解微生物；此环境纤维素分解菌浓度高。滤纸；富含纤维素分解微生物；此环境纤维素分解菌浓度高。2 2、培养基有杂菌污染吗？你是否分离到了能够产生透明、培养基有杂菌污染吗？你是否分离到了能够产生透明圈的微生物？它们是纤维素分解菌吗？圈的微生物？它们是纤维素分解菌吗？如空白对照培养基无菌落则说明培养基无污染，否则有污如空白对照培养基无菌落则说明培养基无污染，否则有污染；分离得到的有透明圈的菌落不一定就是，还要进一步进行染；分离得到的有透明圈的菌落不一定就是，还要进一步进行发酵产纤维素的实验以证明其真的分解纤维素产生

36、了葡萄糖，发酵产纤维素的实验以证明其真的分解纤维素产生了葡萄糖，并可对葡萄糖作定量测定。并可对葡萄糖作定量测定。3 3、比较你的分离结果与其他同学有什么不同？分析产生、比较你的分离结果与其他同学有什么不同？分析产生不同结果的原因？不同结果的原因？四、结果分析与评价四、结果分析与评价 由于取样环境的不同，操作过程的差异，不同同学实验结由于取样环境的不同，操作过程的差异，不同同学实验结果可能会有差别；如果与大家的结果不同应分析原因：果可能会有差别；如果与大家的结果不同应分析原因：（1 1）通过对照实验检验）通过对照实验检验培养基是否污染培养基是否污染：（2 2）操作过程是否进行了无菌操作且保证）操

37、作过程是否进行了无菌操作且保证无杂菌污染无杂菌污染（3 3）选择培养是否使纤维素）选择培养是否使纤维素分解菌浓度提高分解菌浓度提高（4 4）梯度稀释的）梯度稀释的稀释度是否合理稀释度是否合理（5 5）产生的有透明圈的菌落）产生的有透明圈的菌落是否就是纤维素分解菌是否就是纤维素分解菌五、操作提示五、操作提示（一）复习微生物技术（一）复习微生物技术（一）复习微生物技术（一）复习微生物技术实验前，请先复习课题实验前，请先复习课题实验前，请先复习课题实验前，请先复习课题1 1、2 2中学习过的方法：主要包括中学习过的方法：主要包括中学习过的方法：主要包括中学习过的方法：主要包括1 1、培养基制备：、培

38、养基制备：计算、称量、溶化（调并分装）、灭菌、计算、称量、溶化（调并分装）、灭菌、倒平板（液体培养基不用倒平板）；倒平板（液体培养基不用倒平板）；2 2、无菌操作技术：、无菌操作技术：环境、操作台、衣服消毒；培养皿、试管、环境、操作台、衣服消毒；培养皿、试管、吸管等玻璃仪器、金属用具干热灭菌；接种环、试管口等灼烧吸管等玻璃仪器、金属用具干热灭菌；接种环、试管口等灼烧灭菌；培养基等高压蒸汽灭菌；操作过程在酒精灯火焰周围；灭菌；培养基等高压蒸汽灭菌；操作过程在酒精灯火焰周围；3 3 3 3、稀释涂布平板法：、稀释涂布平板法：、稀释涂布平板法：、稀释涂布平板法：按微生物浓度梯度稀释，用涂布器涂布；按

39、微生物浓度梯度稀释，用涂布器涂布；按微生物浓度梯度稀释，用涂布器涂布；按微生物浓度梯度稀释，用涂布器涂布；4 4 4 4、选择培养基的作用：、选择培养基的作用：、选择培养基的作用：、选择培养基的作用：选择培养目的微生物，抑制其他微生物选择培养目的微生物，抑制其他微生物选择培养目的微生物，抑制其他微生物选择培养目的微生物，抑制其他微生物5 5 5 5、土壤取样：、土壤取样：、土壤取样：、土壤取样：用铁铲取土样装入信封，操作在酒精灯火焰周围，用铁铲取土样装入信封，操作在酒精灯火焰周围，用铁铲取土样装入信封，操作在酒精灯火焰周围，用铁铲取土样装入信封，操作在酒精灯火焰周围，（铁铲和信封已灭菌）（铁铲

40、和信封已灭菌）（铁铲和信封已灭菌）（铁铲和信封已灭菌）五、操作提示五、操作提示（二）选择培养的操作方法（二）选择培养的操作方法（二）选择培养的操作方法（二）选择培养的操作方法土样土样如样品中纤维素分解菌浓度较高，选择培养可不进行如样品中纤维素分解菌浓度较高，选择培养可不进行锥形瓶：锥形瓶：30ml选择培养基选择培养基固定在固定在摇床摇床上上一定温度下一定温度下振荡培养振荡培养1 12 2天天培养液变浑浊培养液变浑浊转移到另外一转移到另外一瓶新鲜的选择瓶新鲜的选择培养液中培养液中培养液培养液变浑浊变浑浊同以上条件同以上条件吸取一定培养吸取一定培养液（如液（如5ml5ml）可多次循环选择培养提高纤

41、维素分解菌浓度可多次循环选择培养提高纤维素分解菌浓度P30P30练习：练习：练习：练习：2 2：学完这个专题后，你能否总结出分学完这个专题后，你能否总结出分离培养微生物的一般方法？请用流程图表示。离培养微生物的一般方法？请用流程图表示。课后练习课后练习土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释取样涂布：将样品取样涂布：将样品涂布到鉴别纤维素涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上分解菌的培养基上挑选单挑选单菌落菌落发酵培养发酵培养1.在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？菌，符合下列哪一生物学观点？A.生物结构与功能相适应的观点生物结构与

42、功能相适应的观点B.生物结构与功能整体性观点生物结构与功能整体性观点C.生物与环境相适应的观点生物与环境相适应的观点D.生物发展进化的观点生物发展进化的观点练一练：练一练：2.从土壤中分离获得某种微生物的步骤是从土壤中分离获得某种微生物的步骤是土壤取样土壤取样梯度稀释梯度稀释选择培养选择培养 菌悬液涂布平板菌悬液涂布平板挑选出单个菌落挑选出单个菌落A.B.C.D.3.有关选择培养正确的叙述是有关选择培养正确的叙述是A.可以增加纤维素分解菌的浓度可以增加纤维素分解菌的浓度B.可以减少纤维素分解菌的浓度可以减少纤维素分解菌的浓度C.所用培养基是固体培养基所用培养基是固体培养基D.所用培养基是平板培养基所用培养基是平板培养基