第三章-微生物工业菌种的选育与扩大培养课件.ppt

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1、1 1、写出生产以下产品的主要菌种：、写出生产以下产品的主要菌种：啤酒、黄酒、味精、柠檬酸、食醋、酸奶啤酒、黄酒、味精、柠檬酸、食醋、酸奶2 2、发酵工艺控制中，主要应监控、发酵工艺控制中，主要应监控 、泡沫、氧化还原电位等。泡沫、氧化还原电位等。温故知新温故知新第三章第三章 微生物工业菌种的选育与扩大培养微生物工业菌种的选育与扩大培养 o第一节第一节 微生物工业菌种微生物工业菌种 o第二节第二节 微生物工业菌种的选育与保藏微生物工业菌种的选育与保藏o第三节第三节 微生物工业种子扩大培养微生物工业种子扩大培养 第一节第一节 微生物工业菌种微生物工业菌种 野生菌野生菌 变异菌变异菌自然选育自然选

2、育 代谢控制育种代谢控制育种诱变育种诱变育种 基因重组定向育种基因重组定向育种 一、发展总趋势一、发展总趋势 生长能力强、对原料要求低、原料转化率高；生长能力强、对原料要求低、原料转化率高；选择抗噬菌体能力强的菌株；选择抗噬菌体能力强的菌株；菌种纯，不易变异退化；菌种纯，不易变异退化；菌种不是病原菌，不产生任何有害物质；菌种不是病原菌，不产生任何有害物质；发酵副产物少，产物容易分离；发酵副产物少，产物容易分离；选择单产高的选择单产高的营养缺陷型营养缺陷型突变株、突变株、调节突变株调节突变株或野生菌株或野生菌株 二、选择原则二、选择原则 天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸甲

3、硫氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸苏氨酸高丝氨酸高丝氨酸高丝氨酸高丝氨酸不能合成可以大可以大量积累量积累赖赖 氨氨 酸酸人工诱变的人工诱变的人工诱变的人工诱变的菌种不能产生菌种不能产生菌种不能产生菌种不能产生生产苏氨酸菌株转变成生产赖氨酸：生产苏氨酸菌株转变成生产赖氨酸：高丝氨酸缺陷型高丝氨酸缺陷型天冬氨酸磷酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛 四四大大类类微微生生物物:细细菌菌、酵酵母母菌菌、霉霉菌菌和和放放线线菌菌都都可可以以用用来来生生产产工业产品。工业产品。(见见P8-9P8-9表表1-1)1-1)微生物的开发潜力很大。微生物的开发潜力很大。目目

4、前前人人们们已已知知的的微微生生物物只只占占自自然然界界微微生生物物总总数数的的不不到到10%10%。而而微微生生物物代代谢谢产产物物据据统统计计已已超超过过13001300多多种种，但但进进行行工工业业规规模模生生产的还不到产的还不到100100种。种。三、工业上常用微生物三、工业上常用微生物 第二节第二节 菌种的选育与保藏菌种的选育与保藏 1 1、菌种来源、菌种来源根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门部门索取或购买索取或购买；通过通过菌种选育菌种选育获得新的微生物菌种。获得新的微生物菌种。一、工业菌种选育一、工业菌种选

5、育 第二节第二节 菌种的选育与保藏菌种的选育与保藏 2 2、菌种选育定义、菌种选育定义(p11)(p11)按照生产要求，根据微生物遗传变异理论，利用按照生产要求，根据微生物遗传变异理论，利用自然菌自然菌 种种筛筛选选、人人工工诱诱变变育育种种、代代谢谢控控制制育育种种或或基基因因重重组组定定向向育育种种等等方法方法得到优良菌种得到优良菌种的工作。的工作。一、工业菌种选育一、工业菌种选育 菌种购买指南视频菌种购买指南视频3、方法、方法(1)自然选育自然选育定义定义从自然界土壤、水、从自然界土壤、水、空气、动物、植物、空气、动物、植物、矿物等样品中分离筛矿物等样品中分离筛选得到菌种的方法。选得到菌

6、种的方法。如：土壤如：土壤如：如：选择培养基选择培养基如：划线分离法、稀释分离法等如：划线分离法、稀释分离法等饱浸含某种饱浸含某种指示剂指示剂的的滤纸片滤纸片变色圈（如淀变色圈（如淀粉降解菌筛选）粉降解菌筛选）指示剂指示剂直接掺入或喷洒直接掺入或喷洒固体固体培养基培养基，菌落周围形成变色，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液（如淀粉降解菌筛选）碘液（如淀粉降解菌筛选）固体培养基中固体培养基中掺掺入溶解性差、入溶解性差、可被特定菌可被特定菌(如如磷细菌磷细菌筛选筛选)利用的营养成分，造成利用的营养成分，造成不透不透明的培养基背景明的培养基背景。菌落利用。菌落利用此

7、物质形成透明圈。此物质形成透明圈。利用有特别营养要求（如利用有特别营养要求（如营养缺陷型营养缺陷型菌株）作为工菌株）作为工具菌，如待筛选菌具有具菌，如待筛选菌具有合合成该营养物成该营养物能力，工具菌能力，工具菌就能围绕该菌生长。就能围绕该菌生长。待筛选的菌株能待筛选的菌株能分泌产生某些能分泌产生某些能抑制工具菌生长抑制工具菌生长的物质（如的物质（如抗生抗生素产生菌素产生菌筛选）筛选）(2)(2)诱变育种诱变育种 采采用用物物理理、化化学学诱诱变变因因素素处处理理微微生生物物细细胞胞，提提高高基基因因的的随随机机突突变变几几率率，然然后后通通过过定定向向筛筛选选获获得得所所需需优良菌株。优良菌株

8、。3、方法方法 (3)(3)代谢控制育种代谢控制育种 通通过过改改变变微微生生物物菌菌种种的的代代谢谢途途径径或或代代谢谢自自动动调调节节系系统统（如如增增加加特特定定基基因因拷拷贝贝数数来来提提高高限限速速酶酶含含量量）而而使使微微生生物物发发生生异异常常代代谢谢，使使所所需需中中间间代代谢谢产产物物过过量积累。量积累。3 3、方法、方法生物进化过程中微生物形生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制成完善的代谢调节机制 代谢产物不会过量积累代谢产物不会过量积累 解除或控制微生物的代谢调节解除或控制微生物的代谢调节目的产物积累目的产物积累 (4)(4)基因重组定向育种基因重组定向育种 通通过

9、过转转化化、转转导导、杂杂交交和和原原生生质质体体融融合合等等遗遗传传学学方方法法和和技技术术定定向向地地重组微生物重组微生物DNADNA，使微生物的，使微生物的功能发生定向的改变功能发生定向的改变。3、方法、方法让生命永存一让生命永存一37-43微生物学第六章微生物学第六章 4 4、方法、方法基因重组定向育种先进技术能取代基因重组定向育种先进技术能取代传统育种方法吗？传统育种方法吗？先进育种技术需在先进育种技术需在优良原始菌种基础优良原始菌种基础上应用才有效。上应用才有效。基因基因重组重组产品主要还是一些产品主要还是一些较短的多肽和小分子蛋白质较短的多肽和小分子蛋白质。蛋白质类以外的很多发酵

10、产物（如糖类、有机酸及次级代蛋白质类以外的很多发酵产物（如糖类、有机酸及次级代谢产物等）产生往往受到谢产物等）产生往往受到多个基因的控制多个基因的控制，尤其是还有，尤其是还有许许多发酵产物的代谢途径还没有被确证多发酵产物的代谢途径还没有被确证。1 1、菌种衰退的概念、菌种衰退的概念 指指菌菌种种整整体体在在多多次次接接种种传传代代过过程程中中逐逐渐渐造造成成生生产产能能力力降降低低，表表现现为为发发酵酵力力（如如对对培培养养基基的的利利用用）或或繁繁殖殖力力（如如孢孢子子的的产产生生）下下降降或或发发酵酵产产物物得得率率降降低低的的现象。现象。二、工业菌种的衰退与防止二、工业菌种的衰退与防止

11、2 2、菌种衰退的常见现象、菌种衰退的常见现象 !菌落和细胞形态的改变菌落和细胞形态的改变 !生长速度缓慢，产孢子越来越少生长速度缓慢，产孢子越来越少 !抵抗力、抗不良环境能力减弱等抵抗力、抗不良环境能力减弱等!代谢产物生产能力或其对宿主寄代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降生能力下降 二、工业菌种的衰退与防止二、工业菌种的衰退与防止 3 3、菌种衰退产生的原因、菌种衰退产生的原因 保藏不恰当保藏不恰当传代次数过多传代次数过多 发生回复突变发生回复突变 培养条件不适合培养条件不适合 二、工业菌种的衰退与防止二、工业菌种的衰退与防止 4 4、防止菌种衰退的方法防止菌种衰退的方法 作好菌种作好菌

12、种保藏保藏工作工作尽可能使每次尽可能使每次培养条件适合而一致培养条件适合而一致尽量尽量减少传代减少传代次数次数 应使用应使用幼龄菌幼龄菌培养培养 二、工业菌种的衰退与防止二、工业菌种的衰退与防止 三、菌种的复壮三、菌种的复壮 概念概念狭义：狭义：狭义：狭义：在菌种在菌种已衰退已衰退情况下情况下，通过纯种分离和生产性，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退群体中找出少数未衰退的个体，能测定等方法，从衰退群体中找出少数未衰退的个体，以以恢复原有典型性状恢复原有典型性状的措施。的措施。广义：广义：广义：广义：在菌种在菌种未衰退未衰退前经常有意识地进行纯种分离和前经常有意识地进行纯种分离和生产性状测

13、定工作，以期从中生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正变个体选择到自发的正变个体。衰退菌种复壮的方法衰退菌种复壮的方法 单细胞菌株分离法单细胞菌株分离法 沸水筛选法沸水筛选法 菌液用沸水处理后进行单细胞菌株分离，从而挑选出优良菌体。菌液用沸水处理后进行单细胞菌株分离，从而挑选出优良菌体。改变培养条件法改变培养条件法 采用有利于高产菌株而不利于低产菌株的条件来选出高产菌株。采用有利于高产菌株而不利于低产菌株的条件来选出高产菌株。通过宿主体复壮通过宿主体复壮 如如Bacillus Bacillus thuringiensisthuringiensis的复壮的复壮诱变处理法诱变处理法 对发生回复突

14、变进行重新诱变育种。对发生回复突变进行重新诱变育种。三、菌种的复壮三、菌种的复壮 1 1、原理、原理 根根据据菌菌种种的的生生理理、生生化化特特点点，人人为为地地创创造造条条件件，使使菌菌种种的的代代谢活动处于不活泼状态谢活动处于不活泼状态(最好是休眠状态最好是休眠状态)。四、工业菌种的保藏四、工业菌种的保藏 2 2、原则、原则 挑挑选选优优良良纯纯种种，最最好好是是休休眠眠体体（如如孢孢子子、芽芽孢孢等等），创创造造一一个个最最有有利利于于休休眠眠的的环环境境条条件件（如如低低温温、干干燥燥、缺缺氧氧、营营养养物物质质缺缺乏乏等等），就就可可以以达达到到菌菌种种保保藏藏的的目目的的。同同时时

15、，作作为为可可行行的的方方法法，还还要要考考虑虑方方法法的的经经济济和和简便简便。三、工业菌种的保藏三、工业菌种的保藏 u斜面低温保藏法斜面低温保藏法 菌菌种种在在斜斜面面培培养养基基上上培培养养，生生长长旺旺盛盛后后存存放放在在4-84-8的的冰冰箱箱中中，一一般般半半年年要移植一次。适合保藏实验室要移植一次。适合保藏实验室常用菌种常用菌种。u低温冰箱保藏法低温冰箱保藏法 菌菌种种经经液液体体培培养养后后，加加入入无无菌菌甘甘油油，使使甘甘油油含含量量为为30-40%，置置于于-80低温冰箱中保存，低温冰箱中保存，保存期为保存期为1-10年年。适用于保存。适用于保存各类微生物菌体各类微生物菌

16、体。u石蜡油封保藏法石蜡油封保藏法 医医用用石石蜡蜡油油灭灭菌菌冷冷却却后后加加在在斜斜面面菌菌种种上上,超超过过斜斜面面顶顶部部1cm1cm，在在室室温温下下或冰箱或冰箱里可保存里可保存1-101-10年。年。几乎所有微生物几乎所有微生物都适用。都适用。三、工业菌种的保藏三、工业菌种的保藏3 3、方法、方法 砂土保藏法砂土保藏法 将干的孢子、芽孢与将干的孢子、芽孢与彻底灭菌彻底灭菌的砂土混合后装入砂土管，放入装有吸湿剂的干的砂土混合后装入砂土管，放入装有吸湿剂的干燥器或大试管中，加橡皮塞用蜡封严，置燥器或大试管中，加橡皮塞用蜡封严，置阴凉干燥处阴凉干燥处或或冰箱冰箱中可保藏中可保藏1-10年

17、。适合年。适合于于孢子、芽孢孢子、芽孢等的保存。等的保存。冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法 瓶瓶中中加加入入菌菌体体或或孢孢子子悬悬液液，-40-40低低温温冰冰箱箱冷冷冻冻1h1h，室室温温真真空空干干燥燥固固封封，可保存可保存10-10-数数1010年年。适用于保存。适用于保存各类微生物菌体各类微生物菌体。保存运输方便。保存运输方便。液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 菌种密封于安踣瓶中菌种密封于安踣瓶中,慢速冻结器中以每分慢速冻结器中以每分钟下降钟下降11的速度下降到的速度下降到-35-35，再迅速降温至，再迅速降温至-196196，并，并在该温度下的在该温度下的液氮超低温罐液氮超低温罐中保存

18、，中保存，保存期为保存期为3-9年年。适用于保存。适用于保存各类微生物菌体各类微生物菌体。第三节 微生物工业种子扩大培养 获得获得活力旺盛的、接种数量足够、纯而壮活力旺盛的、接种数量足够、纯而壮的培养物的培养物。一、目的与任务一、目的与任务 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的态的生产菌种生产菌种接入接入试管斜面活化试管斜面活化后，再经过后，再经过扁瓶或摇瓶及种子扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的最终获得一定数量和质量的纯种纯种过程。过程。斜面斜面摇瓶摇瓶种子罐种子罐发酵罐发酵罐 二、工

19、艺二、工艺 斜斜面面菌菌种种一一级级种种子子摇摇瓶瓶培培养养二二级级种种子子罐罐培培养养发发酵酵罐罐 （二级）（二级）斜斜面面菌菌种种一一级级种种子子摇摇瓶瓶培培养养二二级级种种子子罐罐培培养养三三级级种子罐培养种子罐培养发酵罐发酵罐 （三级）（三级）尽量采用二级发酵尽量采用二级发酵 三、级数的确定三、级数的确定 菌种发展总趋势，如何理解菌种发展总趋势，如何理解工业菌种选育的定义、方法工业菌种选育的定义、方法工业菌种衰退的定义、防止方法工业菌种衰退的定义、防止方法菌种复壮的概念与方法菌种复壮的概念与方法工业菌种保藏原则与方法工业菌种保藏原则与方法工业菌种扩大培养工艺与级数工业菌种扩大培养工艺与级数 课后思考题课后思考题