微生物限度检查解读幻灯片.ppt

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1、微生物限度检查解读微生物限度检查解读第1页，共31页，编辑于2022年，星期六一、前言一、前言1.规定了微生物限度检查的定义及检查内容。规定了微生物限度检查的定义及检查内容。2.实验的环境设施及操作的无菌要求。实验的环境设施及操作的无菌要求。3.对检查中使用的助溶剂、中和剂、灭活剂的作对检查中使用的助溶剂、中和剂、灭活剂的作用及对微生物生长和存活的影响应进行验证用及对微生物生长和存活的影响应进行验证4.霉菌培养温度改为霉菌培养温度改为2328，控制菌培养温度，控制菌培养温度改为以改为以3537表示，细菌不变。表示，细菌不变。5.增加检验结果的单位：增加检验结果的单位：10g，10ml。第2页，

2、共31页，编辑于2022年，星期六二、具体内容1.检验量：检验量：指明了检验量是一次试验所用的量；对贵重药、微量包装药可酌减，但不规定3g或5g；因沙门菌检查的报告单位为10g或10ml，所以检验量应另增10g或10ml（不含阳性对照用量）。第3页，共31页，编辑于2022年，星期六2.供试液制备（供试液制备（与2000年版药典相比的不同点）2000年版药典年版药典2005年版药典年版药典（1）使用0.9%无菌NaCl溶液使用pH7.0无菌NaCl-蛋白胨缓冲液（2）供试液制备以加一定体积表示供试液制备以加至一定体积表示（3）供试液分三类六种供试液分三类七种，但分类更合理，函盖面更全（4）制备

3、方法有限增加了新的制备方法，对培养基稀释作了进一步详细规定第4页，共31页，编辑于2022年，星期六3.细菌、霉菌、酵母菌计数细菌、霉菌、酵母菌计数3.1平皿法：平皿法：3.1.1平皿法两版药典比较平皿法两版药典比较3.1.2平皿法菌数报告规则平皿法菌数报告规则 3.1.3平皿法其他内容，如阴性对照平皿法其他内容，如阴性对照试验等等与试验等等与2000年版相同年版相同第5页，共31页，编辑于2022年，星期六3.细菌、霉菌、酵母菌计数细菌、霉菌、酵母菌计数（续）（续）3.2薄膜过滤法薄膜过滤法(为2005年版药典新增内容)3.2.1操作操作3.2.2阴性对照试验阴性对照试验3.2.3培养和计数

4、培养和计数3.2.4菌数报告规则菌数报告规则 第6页，共31页，编辑于2022年，星期六3.1.1平皿法两版药典比较平皿法两版药典比较2000年版药典年版药典2005年版药典年版药典（1）连续3个稀释级连续23个稀释级（2）培养基约15ml培养基约1520ml（3）每稀释级应作 23个平皿每稀释级每种培养基至少制备2个平皿（4）无培养和计数栏增加对同级的两个平板，当菌落数大于等于15个时，则两个平板的菌落数不能相差1倍或1倍以上第7页，共31页，编辑于2022年，星期六3.1.1平皿法两版药典比较平皿法两版药典比较（续）（续）2000年版药年版药典典2005年版药典年版药典（5）培养基的适用范

5、围，规定比较乱，表达不清，不易理解营养琼脂培养基用于进行细菌计数；玫瑰红琼脂培养基用于进行霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于进行酵母菌计数,或用于特殊品种（含蜂蜜、王浆的液体制剂）进行酵母菌计数第8页，共31页，编辑于2022年，星期六3.1.2平皿法菌数报告规则平皿法菌数报告规则 2000年版药典存在许多不足，2005年版作了较大改动1)规定取两位有效数字报告。在计数及中间计算过程中可多保留一位。2)2005年版中：（1）与2000版相同 第9页，共31页，编辑于2022年，星期六3.1.2平皿法菌数报告规则平皿法菌数报告规则(续)（2）当比值2时，与2000年版相同，以两级

6、均数报告当比值2时，规则与2000年版不同，如比值为25时，说明两级之间存在较大差别，应以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数 增加了比值大于5，或出现高稀释级菌数大于或等于低稀释级，应查明原因。如试液有较强的抑菌作用，就不能象上述一样忽略，必须调整方法 第10页，共31页，编辑于2022年，星期六3.1.2平皿法菌数报告规则平皿法菌数报告规则(续续)（3）与2000年版相同（4）与2000年版相同第11页，共31页，编辑于2022年，星期六3.1.2平皿法菌数报告规则平皿法菌数报告规则(续续)3)还删除了2000年版中不合理的3条;把培养基稀释列为具抑菌活性供试品在任何情况下通用的方法，

7、不仅仅局限于某种情况,而且方法也进行了合理的调整，取样改为2ml，每1 ml所注平皿多个(不定)第12页，共31页，编辑于2022年，星期六3.2薄膜过滤法薄膜过滤法(为2005年版药典新增内容)3.2.1操作：操作：1）取相当于供试品）取相当于供试品1g（ml）的供试液）的供试液如如取供试品取供试品1g（ml）或）或1：10供试液供试液10 ml或或1：100供试液供试液100 ml，加至适量稀释，加至适量稀释剂剂，混匀，过滤，混匀，过滤2）冲洗方法、冲洗液、冲洗量（应验证）冲洗方法、冲洗液、冲洗量（应验证）3）每种培养基至少制备一张膜）每种培养基至少制备一张膜 第13页，共31页，编辑于2

8、022年，星期六3.2薄膜过滤法薄膜过滤法(续续)3.2.2阴性对照试验阴性对照试验:等同于“空白试验”，即不加供试品，按同法操作所得结果，每种培养基均需做。第14页，共31页，编辑于2022年，星期六3.2薄膜过滤法薄膜过滤法(续续)3.2.3培养和计数培养和计数:与平皿法相同。但每张滤膜上菌数应不得过100个，如果超过100个，也就是每1g（ml）供试品含菌量较多，可取适宜稀释级供试品1ml检查，例如，1：10取10ml检查，菌落150个（150个/g），则改用1：10取1ml检查，菌落为15个（150个/g）第15页，共31页，编辑于2022年，星期六3.2薄膜过滤法薄膜过滤法(续续)3

9、.2.4菌数报告规则菌数报告规则:1)报告每1g（ml）供试品菌落数；2)若膜上无菌落生长时，如果（每张膜过滤1g(ml)供试品或1：1010ml供试液，如每张膜过滤1：1010ml供试液，则报告10个，依此类推，为1乘以稀释倍数第16页，共31页，编辑于2022年，星期六4.控制菌检查控制菌检查1)大肠菌基本相同，主要修改是：当MUG和靛基质两项中有一项为阳性时，大肠菌的进一步确认通过大肠菌菌落形态特征比较进行鉴别排除，增加大肠菌形态特征，对进一步确认做什么生化试验不作硬性规定（是否妥？），所以原有的生化试验结果判断删除了。第17页，共31页，编辑于2022年，星期六4.控制菌检查控制菌检查

10、(续续)2)增加大肠菌群检查。3)沙门、金葡、绿脓也和大肠菌一样作了调整，大同小异。沙门菌规定取供试品1 0 g（ml），另加阳性对照10 g（ml）。4)增加了梭菌检查（无论试管或平皿都要注意厌氧条件培养）。第18页，共31页，编辑于2022年，星期六5.微生物限度标准微生物限度标准（略）（略）主要变化是由按剂型控制主要变化是由按剂型控制改为按给药途径控制。改为按给药途径控制。第19页，共31页，编辑于2022年，星期六6.方法验证方法验证6.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：1)菌液制备（略）2)验证方法：主要分四组，测得四组数据。供试品对照组：按拟定的

11、菌落计数方法，准确测定规定量(与试验组的相同)的供试液中的菌落数，得供试品的已知含菌数-相当于已知供试品的含量。菌液组：测定所加的试验菌的菌数-相当于精密称定对照品，得对照品的已知加入量。第20页，共31页，编辑于2022年，星期六6.方法验证方法验证(续续)试验组（操作略）：取已知含菌数的供试液（试验可能用的最低稀释级供试液1ml）和一定量的试验菌，进行测定。测得试验组的总菌量，测定两份（两个平皿），求平均值 计算试验组的回收率：试验组-供试品对照组（加入试验菌的测定值）菌液组（加入试验菌的已知值）（应70%）第21页，共31页，编辑于2022年，星期六6.方法验证方法验证(续续)稀释剂对照

12、组：以相应稀释液替代供试品，按试验组同法测定 计算稀释剂对照组的回收率：稀释剂对照组（加入试验菌的测定值）菌液组（加入试验菌的已知值）（应70%）第22页，共31页，编辑于2022年，星期六 上述整个试验应至少进行3次独立的平行试验，即分别平行取来自同一批样品的三份供试品，平行操作，作三次验证测定。每次验证试验的试验组和稀释对照组回收率必须两项同时70%，所被验证的检查法成立，否则 第23页，共31页，编辑于2022年，星期六6.2控制菌的验证控制菌的验证 根据各品种项下微生物限度检查标准中规定检查的控制菌，进行相应的验证；根据检查的控制菌选择对应的验证菌，大肠菌群选大肠埃希菌。试验分二组 第

13、24页，共31页，编辑于2022年，星期六 试验组（操作略）：规定量一般为1：10供试液10ml（相当于1g或1ml供试品），沙门菌除外。取供试液、试验菌加入增菌培养基中。按拟定方法检查。第25页，共31页，编辑于2022年，星期六 阴性菌对照组：检查大肠、大肠菌群、沙门-金葡为阴性检查绿脓、金葡、梭菌-大肠为阴性 进行阴性试验时，取供试液及阴性对照菌，然后按控制菌检查的方法进行试验，例如，验证控制菌大肠菌的检查方法时，应取供试液及金葡菌，按大肠菌检查方法进行增菌检查，应不得检出金葡菌。本阴性菌对照组试验的目的是为了验证大肠菌检查方法的专属性 第26页，共31页，编辑于2022年，星期六7.总

14、结总结 作为研发者，需要做的工作是：(1)建立方法；(2)验证方法；(3)制订质量标准 作为检验者，应该做的工作是：-按制订的方法（质量标准）检验 第27页，共31页，编辑于2022年，星期六10号资料（质量标准研究资料）(1)实验仪器、试药（包括培养基、稀释液、冲洗液、菌液，包括培养基的相关试验）(2)根据什么原因、理由、依据 拟定的方法第28页，共31页，编辑于2022年，星期六(3)按药典要求进行验证，主要实验操作(4)验证数据、结果，列表表示(5)得出结论第29页，共31页，编辑于2022年，星期六 总而言之，无菌检查、微生物限度检查，目的是检查药品中是否污染了微生物，污染的程度怎样？为了要能准确地检测其结果，必须排除实验环境、实验仪器设备、实验用试药材料、实验操作以及药品本身等等，对所污染微生物的生存、生长，产生任何不良影响的因素。上面所涉及的内容，就是为了达到这个目的 第30页，共31页，编辑于2022年，星期六 谢谢大家第31页，共31页，编辑于2022年，星期六