实验叶绿素的提取理化性质和含量测定幻灯片.ppt

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1、实验叶绿素的提取理实验叶绿素的提取理化性质和含量测定化性质和含量测定第1页，共23页，编辑于2022年，星期五1.实验目的实验目的1）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法2）了解叶绿素的理化性质）了解叶绿素的理化性质第2页，共23页，编辑于2022年，星期五2.实验原理实验原理2.1用含水的有机溶剂提取叶绿素用含水的有机溶剂提取叶绿素2.2叶绿素的物理性质叶绿素的物理性质吸收光谱吸收光谱荧光现象荧光现象2.3叶绿素的化学性质叶绿素的化学性质取代反应取代反应皂化反应皂化反应第3页，共23页，编辑于2022年，星期五2.1用用含水的含水的有机溶剂有机溶剂提取叶绿素

2、提取叶绿素亲水的亲水的卟啉环的卟啉环的“头部头部”:镁原子居于卟啉环的中央，带正镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。的，可以与蛋白质结合。亲脂的亲脂的叶绿醇的叶绿醇的“尾巴尾巴”:叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。素的脂溶性。第4页，共23页，编辑于2022年，星期五2.2叶绿素的物理性质叶绿素的物理性质2.2.1吸收光谱吸收光谱2.2.2荧

3、光现象荧光现象2.2.3含量测定含量测定第5页，共23页，编辑于2022年，星期五2.2.1 叶绿素的吸收光谱叶绿素的吸收光谱红光区：红光区：640660 nm篮紫光区：篮紫光区：430450 nm胡胡 萝萝 卜卜 素素 和和 叶叶 黄黄 素素：400500 nm不用蓝光区测叶不用蓝光区测叶绿素含量。绿素含量。第6页，共23页，编辑于2022年，星期五2.2.22.2.2荧光现象荧光现象荧光现象荧光现象透射光下透射光下反射光下反射光下叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。第7页，共23页，编辑于2022年，星期五分子吸收的光能有

4、一部分消耗于分子分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部的振动上，发射的荧光的波长总内部的振动上，发射的荧光的波长总是比被吸收光的波长要长是比被吸收光的波长要长叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从第一单线叶绿素吸收红光后处于第一单线态，叶绿素分子要从第一单线态返回基态所发射的光称为荧光。态返回基态所发射的光称为荧光。第8页，共23页，编辑于2022年，星期五2.2.32.2.3含量测定含量测定含量测定含量测定叶绿素叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于在红光区的最大吸收峰分别位于663nm和和645nm；叶绿素叶绿素a、b在在652nm处有相同的比吸收系数（处有相同的比吸收系数（34.

5、5），测），测OD652求出叶绿素求出叶绿素a、b总量。总量。故叶绿素浓度故叶绿素浓度COD652/34.5(mg/ml)叶绿素的含量（叶绿素的含量（mg/g）=叶绿素的浓度叶绿素的浓度提取液体积提取液体积稀释倍稀释倍数数/样品鲜重样品鲜重第9页，共23页，编辑于2022年，星期五2.3叶绿素的化学性质叶绿素的化学性质2.3.1叶绿素的结构叶绿素的结构2.3.2取代反应取代反应2.3.3皂化反应皂化反应第10页，共23页，编辑于2022年，星期五2.3.12.3.1叶绿素叶绿素叶绿素叶绿素的结构的结构的结构的结构叶绿素叶绿素a与与b很相很相似，不同之处仅似，不同之处仅在于在于Chla第二个第二

6、个吡咯环上的一个吡咯环上的一个甲基甲基(-CH3)被醛被醛基基(-CHO)所取所取代即代即Chlb。第11页，共23页，编辑于2022年，星期五2.3.22.3.2取代反应取代反应取代反应取代反应2.3.2.1稀酸稀酸去镁去镁铜代铜代2.3.2.2浓酸浓酸去镁去镁水解水解卟啉环中的卟啉环中的MgMg处于不稳定的状态，可被处于不稳定的状态，可被H H+、CuCu2+2+、ZnZn2+2+等离子取代。等离子取代。第12页，共23页，编辑于2022年，星期五2.3.2.1稀酸稀酸叶绿素溶液与稀酸叶绿素溶液与稀酸(如如:草酸草酸)作用，作用，H+取代取代Mg后的产物为后的产物为褐色的去镁叶绿素；褐色的

7、去镁叶绿素；去镁叶绿素与去镁叶绿素与Cu2+或或Zn2+作用，作用，Cu2+等离子取代后的产物等离子取代后的产物为深绿色的铜代叶绿素等；为深绿色的铜代叶绿素等；2.3.2.2浓酸浓酸叶绿素溶液与浓酸叶绿素溶液与浓酸(如如:盐酸盐酸)作用，除了代换作用，除了代换Mg外，可外，可使去镁叶绿素迅速使去镁叶绿素迅速分解分解出叶绿醇，并形成褐绿色的去镁叶绿出叶绿醇，并形成褐绿色的去镁叶绿酸。酸。第13页，共23页，编辑于2022年，星期五叶绿素叶绿素去镁叶绿素去镁叶绿素铜代铜代叶绿素叶绿素（稳定而不易降解，（稳定而不易降解，常用醋酸铜处理来保存绿色常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）植物标本）第14页，共

8、23页，编辑于2022年，星期五2.3.32.3.3皂化反应皂化反应皂化反应皂化反应叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化甲醇酯化，另一个被，另一个被叶绿叶绿醇酯化醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。第15页，共23页，编辑于2022年，星期五皂化分层皂化分层叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，稀酒精溶液中，不能进入苯层不能进入苯层；而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在

9、醇溶液中而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中一部分苯分散在水中形成一部分苯分散在水中形成乳胶体乳胶体，出现一层乳白色的，出现一层乳白色的溶液溶液低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。第16页，共23页，编辑于2022年，星期五3材料、试剂与配备材料、试剂与配备1 1 材料材料 菠菜叶片菠菜叶片2 2 仪器设备仪器设备 研钵，漏斗，剪刀，试管，研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，容量瓶试管夹，容量瓶(25ml,50ml)(25ml,50ml)，分光光度计，分光光度计，水浴锅等

10、水浴锅等3 3 试剂试剂 95%95%乙醇，苯，浓盐酸，乙醇，苯，浓盐酸，36%36%乙酸，乙酸，CuSO CuSO4 4，MgCOMgCO3 3，石英砂石英砂第17页，共23页，编辑于2022年，星期五1.叶绿体色素提取叶绿体色素提取 称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片3g，剪碎放入研钵中，剪碎放入研钵中，加少量石英砂和加少量石英砂和碳酸镁碳酸镁及及5ml 95乙醇，研成均浆，过滤入乙醇，研成均浆，过滤入25ml 容量瓶，分别用容量瓶，分别用5ml 95乙醇冲洗研钵乙醇冲洗研钵3次，次，冲洗液同样过滤，收集滤液，倒入容量瓶中，最后用冲洗液同样过滤，收集滤液，倒入容量瓶中，最

11、后用95乙醇定容至乙醇定容至25ml，放入暗处备用。放入暗处备用。2.叶绿素的荧光现象叶绿素的荧光现象 取叶绿素提取液取叶绿素提取液2ml放入试管中，在直射光下观察溶液的透射光及反射光的颜色有何不同？放入试管中，在直射光下观察溶液的透射光及反射光的颜色有何不同？3.光对叶绿体色素的破坏作用光对叶绿体色素的破坏作用 取取两两支支试试管管，各各加加入入叶叶绿绿体体色色素素提提取取液液2ml，一一管管放放在在直直射射光光下下，另另一一管管放放在在黑黑暗处，暗处，12 h后观察两管溶液颜色有何变化？后观察两管溶液颜色有何变化？4.实验步骤实验步骤第18页，共23页，编辑于2022年，星期五4.叶绿素的

12、皂化作用叶绿素的皂化作用 3ml提取液提取液+1ml 20%NaOH-甲醇（摇匀）甲醇（摇匀）冷却冷却 +3ml苯（摇匀）苯（摇匀）+3ml蒸馏水（逐滴加，摇匀）蒸馏水（逐滴加，摇匀）静置，观察分层现象。静置，观察分层现象。下下层层是是稀稀的的乙乙醇醇溶溶液液，其其中中溶溶有有皂皂化化的的叶叶绿绿素素a和和b（以以及及少少量量的的叶叶黄黄素素）；上上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。对照：对照：另取另取3ml 叶绿体色素提取液，加入叶绿体色素提取液，加入2ml 苯和苯和2ml 蒸馏水观察与皂化的叶绿蒸馏水观察与皂化的叶绿素有何不同？素有何不

13、同？60水浴水浴 3min第19页，共23页，编辑于2022年，星期五5.H+和和Cu2+对叶绿素分子中对叶绿素分子中Mg2+的取代作用的取代作用1）吸吸取取叶叶绿绿体体色色素素提提取取液液2ml放放入入试试管管中中，逐逐滴滴加加入入36%乙乙酸酸数数滴滴，摇摇匀匀，观观察察溶液颜色的变化。溶液颜色的变化。2）当当溶溶液液变变褐褐色色后后，倾倾出出一一半半于于另另一一试试管管中中，投投入入几几粒粒醋醋酸酸铜铜粉粉，水水浴浴加加热热，观观察察溶液颜色变化，与未加醋酸铜（同时加热）的一管相比较。溶液颜色变化，与未加醋酸铜（同时加热）的一管相比较。3）吸取叶绿体色素提取液）吸取叶绿体色素提取液2ml

14、放入试管中，逐滴加入浓盐酸，观察颜色变化。放入试管中，逐滴加入浓盐酸，观察颜色变化。第20页，共23页，编辑于2022年，星期五6.叶绿体色素含量测定叶绿体色素含量测定吸吸取取叶叶绿绿体体色色素素提提取取液液5ml，用用95%乙乙醇醇定定容容至至50ml。以以95%乙乙醇醇为为空空白白对对照照，在在波波长长652nm下测定吸光度，并计算总叶绿素的浓度。下测定吸光度，并计算总叶绿素的浓度。最后，根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：最后，根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量（叶绿素的含量（mg/g）=叶绿素的浓度叶绿素的浓度稀释倍数稀释倍数提取液体积提取液体积 /样品鲜

15、重样品鲜重 第21页，共23页，编辑于2022年，星期五6.注意事项注意事项1）为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研）为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些，以不超过磨时间应尽量短些，以不超过2分钟为宜。分钟为宜。2）叶绿体色素提取液不能浑浊，否则应重新过滤。）叶绿体色素提取液不能浑浊，否则应重新过滤。3）分光光度计的正确使用。）分光光度计的正确使用。第22页，共23页，编辑于2022年，星期五1）用不含水的有机溶剂提取植物材料特别是干材料的叶绿体色素往）用不含水的有机溶剂提取植物材料特别是干材料的叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？往效果不佳，原因何在？2）研磨提取叶绿素时加入）研磨提取叶绿素时加入MgCO3，有什么作用？，有什么作用？3）叶绿素）叶绿素a、叶绿素、叶绿素b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素长进行叶绿素a、叶绿素、叶绿素b的定量分析？为什么？的定量分析？为什么？7.思考题思考题第23页，共23页，编辑于2022年，星期五