实验一醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白幻灯片.ppt

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1、实验一 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白第1页，共16页，编辑于2022年，星期五原理原理-电泳电泳:带电颗粒在电场中泳动的现象带电颗粒在电场中泳动的现象各各种种蛋蛋白白质质在在同同一一pH条条件件下下，因因分分子子量量和和电电荷荷数数量量等等不不同同而而在在电电场场中的迁移率不同而得以分开。中的迁移率不同而得以分开。n不用支持物的不用支持物的n利用支持物利用支持物1）纸电泳）纸电泳2)淀粉凝胶电泳淀粉凝胶电泳3)琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳4）醋酸纤维薄膜电泳）醋酸纤维薄膜电泳5）聚丙烯酰胺凝胶电泳（）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第2页，共16页，编辑于2022年，星期五影响泳动速度的主要因素

2、影响泳动速度的主要因素1）电场强度：（越大，移动速度越快）电场强度：（越大，移动速度越快）常压电泳：常压电泳：100-500V，2-10V/cm 高压电泳：高压电泳：500-10000V，20-200V/cm2）溶液的）溶液的pH值：值：buffer。8.603）溶液的离子强度：）溶液的离子强度：（I越大，速度越慢；缓冲越大，速度越慢；缓冲 效果越好）效果越好），0.02-0.2之间。之间。0.073）电渗现象：）电渗现象：液体在电场中相对于固体支持物的相对移动。尽液体在电场中相对于固体支持物的相对移动。尽量避免有高电渗作用的支持物。量避免有高电渗作用的支持物。第3页，共16页，编辑于2022

3、年，星期五聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）nDavis 和和Ornstein 1959年年-人血清蛋白人血清蛋白n聚丙烯酰胺凝胶：由丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶：由丙烯酰胺（Acr，单体），单体）和和N,N-甲甲叉双丙烯酰胺叉双丙烯酰胺（Bis，交联剂），交联剂）共聚合而成共聚合而成（由过硫酸铵（由过硫酸铵-四乙四乙基乙二胺基乙二胺TEMED系统或核黄素系统或核黄素-TEMED系统激发）系统激发）。n分子筛，可通过调节单体浓度或与交联剂的比例分子筛，可通过调节单体浓度或与交联剂的比例来控制孔径大小，达到不同的分离目的。来控制孔径大小，达到不同的分离目的。n凝胶可以是平板（垂直板型）或柱子（盘状）凝胶可

4、以是平板（垂直板型）或柱子（盘状）第4页，共16页，编辑于2022年，星期五第5页，共16页，编辑于2022年，星期五第6页，共16页，编辑于2022年，星期五SDS：十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠CH3（CH2）11OSO3Na，阴阴离离子子去去污污剂剂，与与蛋蛋白白质质结结合合，能能破破裂裂蛋蛋白白质质分分子子中中的的氢氢键键和和疏疏水水作作用用，破破坏坏蛋蛋白质的二级、三级、四级结构。白质的二级、三级、四级结构。n1）先加还原剂如巯基乙醇打开）先加还原剂如巯基乙醇打开-S-S-；n2）SDS破破坏坏蛋蛋白白质质构构象象，与与氨氨基基酸酸侧侧链链充充分分结结合合，形形成成蛋蛋白白质质亚亚基基

5、-SDS胶胶束束。SDS是是阴阴离离子子，使使多多肽肽链链带带上上负负电电荷荷，该该电电荷荷量量远远远远超超过过蛋蛋白白质质分分子子原原有有电电荷荷量量，掩掩盖盖了了不不同同蛋蛋白白质质之之间间的的电电荷荷差差别别。电电泳泳迁迁移移率率主主要要取取决决于于蛋蛋白白质质或或亚亚基基分分子量的大小。子量的大小。SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第7页，共16页，编辑于2022年，星期五作作 用用n使蛋白质成为亚基物质，形成蛋白质使蛋白质成为亚基物质，形成蛋白质-SDS胶束，消除蛋白质胶束，消除蛋白质分子之间的电荷、形状差异；椭圆棒状，短轴均为分子之

6、间的电荷、形状差异；椭圆棒状，短轴均为1.8nm，长，长轴正比于蛋白质分子量。轴正比于蛋白质分子量。nMW在在15 200kDa，电泳迁移率与分子量对数呈线性关系。，电泳迁移率与分子量对数呈线性关系。nlogM=a-bRf，Rf为迁移率为迁移率第8页，共16页，编辑于2022年，星期五第9页，共16页，编辑于2022年，星期五醋酸纤维薄膜电泳(CAME)n以醋酸纤维薄膜以醋酸纤维薄膜(CAM)作支持物的一种区带电泳技术，将血作支持物的一种区带电泳技术，将血清样品点样于醋纤膜上，在清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳，血清蛋的缓冲液中电泳，血清蛋白质均带负电荷移向正极。白质均带负电荷

7、移向正极。n由于血清中各蛋白组分等电点不同而使表面净电荷量不由于血清中各蛋白组分等电点不同而使表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。彼此得以分离。n电泳后，电泳后，CAM经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、经染色和漂洗，可清晰呈现清蛋白、1、2、球蛋白球蛋白5条区带。条区带。第10页，共16页，编辑于2022年，星期五人血清中常见蛋白质的等电点和分子量人血清中常见蛋白质的等电点和分子量蛋白质 等电点 分子量 正常参考值（%）清蛋白 4.88 69000 57-681-球蛋白 5.06 200000 1.0-5.7

8、2-球蛋白 5.06 300000 4.9-11.2-球蛋白 5.12 90000-150000 7-13-球蛋白 6.85-7.2 156000-300000 9.8-18.2 负极 正极球蛋白球蛋白/-球蛋白球蛋白/2-球蛋白球蛋白/1-球蛋白球蛋白/清蛋白清蛋白第11页，共16页，编辑于2022年，星期五器 材n 1醋酸纤维薄膜(8X2mm)2点样器 3染色皿，漂洗器，镊子 4电泳仪：电泳仪电源，水平电泳槽第12页，共16页，编辑于2022年，星期五试剂1巴比妥缓冲液(pH8.6 )：取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，加蒸馏水加热溶解后稀释至1升。2氨基黑10B染色液：取氨基黑1

9、0B 0.5g，甲醇50ml，冰醋酸l0ml，加水至100ml。3漂洗液：95乙醇45ml、冰醋酸5ml、蒸馏水50ml第13页，共16页，编辑于2022年，星期五操作操作-准备准备l醋酸纤维薄膜醋酸纤维薄膜(CAM)的准备：薄膜放进缓冲液中，自然浸润，的准备：薄膜放进缓冲液中，自然浸润，约约20分钟。分钟。2电泳槽的准备：水平放置，将缓冲液注入电泳槽中，两边电泳槽的准备：水平放置，将缓冲液注入电泳槽中，两边的缓冲液高度要一致，架上滤纸桥，盖上电泳槽盖的缓冲液高度要一致，架上滤纸桥，盖上电泳槽盖3点样：将充分浸透点样：将充分浸透(指膜上无白色斑痕指膜上无白色斑痕)的薄膜取出，用滤纸的薄膜取出，

10、用滤纸吸去膜上过多缓冲液，粗糙面吸去膜上过多缓冲液，粗糙面(无光泽面无光泽面)用于点样，载玻片用于点样，载玻片蘸取血清，垂直印在蘸取血清，垂直印在CAM粗糙面上。粗糙面上。第14页，共16页，编辑于2022年，星期五操作-电泳4加样后，将薄膜条架于支架两端，加样后，将薄膜条架于支架两端，点样面朝下，点样侧置于负极端点样面朝下，点样侧置于负极端。薄膜应平直无弯曲，加上槽盖平衡薄膜应平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电。分钟后通电。5连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压连接电泳槽与电泳仪对应的正负极，开启电源通电。电压160V。电。电泳泳50分钟，断电。分钟，断电。6染色染色：用镊子

11、取出薄膜条投入染液用镊子取出薄膜条投入染液8分钟，染色过程中不时轻轻晃动分钟，染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。染色皿，使染色充分。7.漂洗漂洗:从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂从染液中取出薄膜条并尽量沥去染液，投入漂洗皿中反复漂洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见洗，直至背景漂净为止。此时清晰可见5条色带，待干。条色带，待干。第15页，共16页，编辑于2022年，星期五实验报告实验报告将将薄膜条粘贴于实验报告，并标明各带所代表薄膜条粘贴于实验报告，并标明各带所代表的蛋白质，完成实验报告。的蛋白质，完成实验报告。(本实验结束后，本实验结束后，电泳槽内的缓冲液不要倒掉；染色液电泳槽内的缓冲液不要倒掉；染色液需要回收，漂洗液请倒入废水缸需要回收，漂洗液请倒入废水缸)。本周值日本周值日:第一大组第一大组第16页，共16页，编辑于2022年，星期五