实验一提取方法及原理幻灯片.ppt

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1、实验一提取方法及原理第1页，共28页，编辑于2022年，星期五一、研究背景二、方法及原理第2页，共28页，编辑于2022年，星期五一、研究背景1.RNA研究的重要性DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。第3页，共28页，编辑于2022年，星期五2RNA分布不同丰度不同丰度组织名称组织名称样品样品量量总总RNARNA

2、含量含量高丰度高丰度肝脏肝脏1mg1mg2-4g2-4g脾脏脾脏1mg1mg心脏心脏1mg1mg中丰度中丰度大脑大脑1mg1mg0.05-2g0.05-2g胚胎胚胎1mg1mg肾脏肾脏1mg1mg肺肺1mg1mg低丰度低丰度膀胱膀胱1mg1mg0-0.05g0-0.05g骨骨1mg1mg脂肪脂肪1mg1mg高丰度高丰度成纤细胞成纤细胞10105 50.5-1g0.5-1g人白细胞人白细胞10105 5中丰度中丰度酵母酵母10105 50.5-1.5g0.5-1.5g拟南芥叶片拟南芥叶片1mg1mg0.2-0.5g0.2-0.5g低丰度低丰度烟草叶片烟草叶片1mg1mg0.05-0.1g0.05

3、-0.1g玉米叶片玉米叶片1mg1mg第4页，共28页，编辑于2022年，星期五二、方法及原理1、RNA的提取流程（1）样本前处理（2）细胞裂解（3）RNA的纯化及获得第5页，共28页，编辑于2022年，星期五RNA提取流程 样品前处理注意点 选择新鲜血液，不得超过选择新鲜血液，不得超过4 4小时小时选择新鲜的幼嫩组织选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择处于生长旺盛的时期收集细胞选择新鲜组织，生长旺盛的组织选择新鲜组织，生长旺盛的组织第6页，共28页，编辑于2022年，星期五可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的然后

4、加入一定量的TRNzolTRNzol，-70-70保存较长时间保存较长时间去掉培养基，加入一定量去掉培养基，加入一定量TRNzolTRNzol-70-70 保存较长时间保存较长时间推荐使用推荐使用专门的专门的RNARNA样品样品储存液储存液进行储存进行储存液氮或加入液氮或加入RNaseRNase抑制剂中保存，抑制剂中保存，避免反复冻融避免反复冻融RNA提取流程 样品前处理中如何保存样本第7页，共28页，编辑于2022年，星期五RNA提取流程细胞裂解，以释放RNA异硫氰酸胍异硫氰酸胍/酚酚TRNzol总总RNA提取试剂提取试剂独特配方独特配方-RNAplant植物植物RNA提取试剂提取试剂胍盐胍

5、盐/-巯基乙醇巯基乙醇RNAprep系列系列RNA提取试剂提取试剂盒盒第8页，共28页，编辑于2022年，星期五RNA提取流程RNA的纯化及获得RNA纯化要求1 1 纯化后不应存在对酶纯化后不应存在对酶(如逆转录酶如逆转录酶)有抑制作用物质有抑制作用物质2 2 排除有机溶剂和金属离子的污染排除有机溶剂和金属离子的污染3 3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4 4 排除排除DNADNA分子的污染分子的污染第9页，共28页，编辑于2022年，星期五2.RNA提取的注意事项杜绝外源酶的污染a.严格戴好口罩，手套。b.实验所涉及的离心管，Tip头

6、，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。c.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。第10页，共28页，编辑于2022年，星期五阻止内源酶的活性a.选择合适的匀浆方法。b.选择合适的裂解液。c.控制好样品的起始量。第11页，共28页，编辑于2022年，星期五明确自己的抽提目的a.任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。b.RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。第12页，共28页，编辑于2022年，星期五Rnase 污染的污染的10大来源大来源1：手指头2：枪头3：水/缓冲液4：实验台面5：内源Rnase6：RNA样品7：质粒

7、抽提8：RNA保存9：阳离子(Ca,Mg)10：后续实验所用的酶第13页，共28页，编辑于2022年，星期五复习核酸的提取方法lRNA的提取l苯酚水溶液提取l细胞破碎匀浆等体积90苯酚水溶液振荡RNA、Pro分开RNA、多糖（水层）；DNA、Pro（苯酚层）l冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂第14页，共28页，编辑于2022年，星期五复习核酸的提取方法lDNA提取l浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质l或：先用稀盐除去RNAPro，再用浓盐提取l也可用苯酚法，苯酚层得到DNA、Pro第15页，共28页，编辑于2022年，星期五复习核酸的提取方法l核酸的沉淀l

8、DNA的等电点4-4.5，RNA的等电点2-2.5.l收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀。l在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。第16页，共28页，编辑于2022年，星期五Trizol试剂提RNA的原理lTrizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂。Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。lTrizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离

9、,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。第17页，共28页，编辑于2022年，星期五TRIzol法提取流程1.样品处理：组织：取100mg组织（新鲜或-70及液氮中保存的组织均可）置匀浆器中，加入1mlTrizol充分匀浆，匀浆液转1.5ml离心管中,室温静置min。2.加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3.4离心，13000g15min，取上清。4.加入与上清1:1的异丙醇(约0

10、.5ml)，将管中液体轻轻混匀，室温静置20min(-20，时间长效果更好)。取取200-300ul从从5步往下做。步往下做。第18页，共28页，编辑于2022年，星期五TRIzol法提取流程5.4离心，13000g10min，弃上清。6.加入1ml75%乙醇，洗涤沉淀,将沉淀打碎。4，13000g5min，弃上清。7.100%乙醇,轻轻洗涤沉淀.(不用将沉淀打碎)8.晾干，加入适量的H2O溶解（100ul）（65促溶10-15min）。9.定量。第19页，共28页，编辑于2022年，星期五细胞细胞基因组基因组DNA水相有机相RNA氯仿氯仿纯化纯化pH5.7离心离心加入裂解液加入裂解液(TRN

11、zol-A+)实验流程图实验流程图细胞选择细胞选择 贴壁细胞贴壁细胞 悬浮细胞悬浮细胞第20页，共28页，编辑于2022年，星期五RNA提取常见问题q RNA RNA 的降解的降解 q OD OD260260/OD/OD280280 比值偏低比值偏低q 电泳带型异常电泳带型异常q 下游实验效果不佳下游实验效果不佳第21页，共28页，编辑于2022年，星期五RNA降解q 新鲜细胞或组织：新鲜细胞或组织：裂解液的质量裂解液的质量外源外源RNaseRNase的污染的污染裂解液的用量不足裂解液的用量不足组织裂解不充分组织裂解不充分另另外外某某些些富富含含内内源源酶酶的的样样品品 (如如脾脾脏脏，胸胸腺

12、腺等等)，很很难难避免避免 RNA RNA 的降解。的降解。建建议议在在液液氮氮条条件件下下将将组组织织碾碾碎碎，并并且且匀匀浆浆时时使使用用更更多多裂解液裂解液。第22页，共28页，编辑于2022年，星期五RNA降解q 冷冻样品：冷冻样品：样样品品取取材材后后应应立立即即置置于于液液氮氮中中速速冻冻，然然后后可可以以移移至至-7070冰箱保存。样品要相对小一点；冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样样品品与与裂裂解解液液充充分分接接触触前前避避免免融融化化，研研磨磨用用具具必必须须预预冷冷，碾碾磨过程中及时补充液氮。磨过程中及时补充液氮。第

13、23页，共28页，编辑于2022年，星期五OD260/OD280 比值偏低q 蛋白质污染：蛋白质污染：不不要要吸吸入入中中间间层层及及有有机机相相，加加入入氯氯仿仿后后首首先先混混匀匀，并并且且离离心心分分层层的离心力和时间要足够。的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚残留：苯酚残留：不不要要吸吸入入中中间间层层及及有有机机相相，加加入入氯氯仿仿后后首首先先混混匀匀，并并且且离离心心分分层层的的离离心心力力和时间要足够。和时间要足够。解决办法解决办法:重新抽提一

14、次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。第24页，共28页，编辑于2022年，星期五OD260/OD280 比值偏低q 抽提试剂残留：抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮确保洗涤时要彻底悬浮 RNA RNA，并且彻底去掉，并且彻底去掉 75%75%乙醇。乙醇。解决办法解决办法:再沉淀一次后，溶解。再沉淀一次后，溶解。q 设备限制：设备限制：测测定定OD260 OD260 及及OD280 OD280 数数值值时时，要要使使OD260 OD260 读读数数在在 0.10 0.10-0.50 0.50 之之间间。此范围线性最好。此范围线性最好。q 用水稀释样品：用水稀释样品：测测 OD OD 时

15、时，对对照照及及样样品品稀稀释释液液请请使使用用 10 10 mM mM TrisTris，pH pH 7.57.5。用用水水作作为为稀稀释释液液将将导致比值的降低。导致比值的降低。第25页，共28页，编辑于2022年，星期五电泳带型异常q 非变性电泳：非变性电泳：上样量超过上样量超过 3ug，电压超过，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，电泳缓冲液陈旧，均可能导致均可能导致 28S 和和 18S 条带分不开。条带分不开。q 变性电泳条带变淡：变性电泳条带变淡：EB 与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；性电泳比非

16、变性电泳要淡一些；甲醛的质量不高甲醛的质量不高。第26页，共28页，编辑于2022年，星期五下游实验效果不佳q RNA RNA 降解降解 q 抽提试剂的残留抽提试剂的残留 75%75%乙醇洗涤乙醇洗涤 q 样品中杂质的残留样品中杂质的残留 多糖等杂质，再次沉淀多糖等杂质，再次沉淀 q DNA DNA 污染污染 使用使用RNase-Free RNase-Free 的的 DNase I DNase I 消化抽提消化抽提RNA RNA 第27页，共28页，编辑于2022年，星期五RNA的保存l短期保存：可将RNA溶解于TE缓冲液(10mmolLTris，1mmolLEDTA)或无：RNA酶水(0.1

17、mmolLEDTA)中，保存于一20。在保存RNA样品时，通常使用EDTA来螯合RNA酶以防止其降解RNA。值得注意的是，许多实验室配制EDTA后常使用很长时间甚至数年，这种长期使用的EDTA溶液常有微生物存在，反而会造成RNA酶的污染。l中长期保存：相对于一20，一80可进一步防止RNA降解。可将RNA溶解于TE缓冲液或无RNA酶水中，保存于一80，通常可保存6个月左右。l长期保存：保存RNA最为稳定的方法是经乙醇沉淀后，直接保存于一80(在纯化RNA的清洗步骤中，离心后不要弃上清，将RNA保存于乙酸铵乙醇溶液中)。对于已经纯化好的RNA，如果为离心后的RNA沉淀，可加入70乙醇，保存于-80。如果为溶解于TE缓冲液或无RNA酶水中的RNA样品，可加入2倍体积的无水乙醇，保存于-80。第28页，共28页，编辑于2022年，星期五