嗜酸氧化亚铁硫杆菌中锌离子转运基因的鉴定与分析.pdf

《嗜酸氧化亚铁硫杆菌中锌离子转运基因的鉴定与分析.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《嗜酸氧化亚铁硫杆菌中锌离子转运基因的鉴定与分析.pdf（8页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、第2 2 卷第5 期、，o I 2 2N o 5中国有色金属学报T h eC h i n e s e J o u r n a lo fN o n f e r r o u sM e t a i s2 0 1 2 年5 月M a y 2 0 1 2文章编号：1 0 0 4 0 6 0 9(2 0 1 2)0 5 1 4 9 7 0 6嗜酸氧化亚铁硫杆菌中锌离子转运基因的鉴定与分析侯冬梅，苗博1，王洋洋1，张云静1，刘代刚1，吴学玲2(1 中南大学资源加工与生物工程学院，长沙4 1 0 0 8 3；2 中南大学教育部生物冶金重点实验室，长沙4 1 0 0 8 3)摘要：鉴定了A c i d i t

2、h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sD C 似ff e r r o o x i d a n sD e)C O 与锌离子转运相关的4 个A T P b i n d i n gc a s s e t t e(A B c)t r a n s p o r t e r 基因，并采用R e v e r s eT r a n s c r i p t i o nq u a n t i t a t i v er e a l-t i m eP C R(R T-q P C R)技术分析在不同浓度的锌离子胁迫下这4 个A，r P b i n d i n gc a s

3、 s e t t e(A B C)t r a n s p o r t e r 基因在转录尔平上的差异表达情况。然后利用V e a o r N T I、c l u s t e r x、B L A S T，O R FF i n d e r 等生物信息学软件对各基因做进一步的生物信息学分析。结果表明：在锌离子胁迫下，4 个A B Ct r a n s p o r t e r 基因(A R E、的表达量均有所上调，_ 2 4 3 5A r E2 4 3 6A F E2 4 3 7A F E2 4 3 8)说明这4 个基因对于锌离子的胁迫具有很强的敏感性。经生物信息学分析可知，基因A F E2 4 3

4、5 和A r E2 4 3 6 编码位于细胞质膜上的透性酶，A F E2 4 3 7 编码位于细胞质膜上的A T P 结合蛋白，A F E2 4 3 8 编码位于周质空间的锌离子结合蛋白，这4 个基因共同组成了一个与锌离子转运有关的A B C 转运子。这些结果都表明这4 个A B Ct r a n s p o r t e r 基因与D c 菌中锌离子的转运有着密切的关系。关键词：嗜酸氧化亚铁硫杆菌；A B Ct r a n s p o r t e r；R T-q P C R 锌离子胁迫；生物信息学分析中图分类号：Q 8 1 9文献标志码：AI d e n t i f i c a t i o n

5、a n da n a l y s i so fz i n ct r a n s p o r tg e n e si nA c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n sH O UD o n e m e i l，M I A OB 0 1，W A N GY a n g-y a n 9 1，Z H A N GY u n-j m 9 1，L I UD a i g a n 9 1，W UX u e l i n 9 2(1 S c h o o lo f M i n e r a l sP r o c e s s i n ga n dB i o

6、e n g i n e e r i n g，C h a n g s h a 4 1 0 0 8 3，C h i n a；2 K e yL a b o r a t o r yo f B i o m e t a l l u r g y,M i n i s t r yo f E d u c a t i o n,C e n t r a lS o u t hU n i v e r s i t y，C h a n g s h a4 1 0 0 8 3，C h i n a)A b s t r a c t：I nt h i ss t l l d y f o u rA T P-b i n d i n gc a

7、s s e t t e(A B C)t r a n s p o r t e rg e n e so fA c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n sD Ca tf e r r o o x i d a n sD C lw e i ei d e n t i f i e d,a n dd i f f e r e n t i a lt r a n s c d p f i o no f t h e s eg e n e sd u r i n gz i n ci o ns t r e s sw e r ei n v e s t i g a

8、t e db yR e v e r s eT r a n s e r i p t i o nq u a n t i t a t i v er e a l-t i m eP C Rr R T-q P C R)A n dt h e n,t h eg e n e si n v o l v e di nz i n ci o nt r a n s p o r tw 雠a n a l y z e db yb i o i n f o r m a t i c ss o R w a r e T h e 溺u I t ss h o wt h a tt h ee x p r e s s i o n so ft h

9、ef o u rA B Ct r a n s p o r t e rg e n e sa r ei n c r e a s e dd i f f e r e n t l yu n d e rz i n ci o ns t r e s s i n d i c a t i n gt h a tt h e s eg e n e sa r cs e n s i t i v et oz i n cl e v e l s。B i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i ss h o w st h a tt h ep r o t e i n se n c o d eb yA

10、 F E _ 2 4 3 5，A F E 一2 4 3 6a 玛p r e d i c t e dt ob ep e r m e a s ep r o t e i n s，w h e r e a st h ep r o t e i ne n c o d eb yA F E _ 2 4 3 7i sap u t a t i v eA T P b i n d i n dp r o W i na n dA F E 一2 4 3 8e n c o d e dap u m t i v ep e r i p l a s m i cc a t i o n b i n d i n gp r o t e i n

11、 T h ef o u rg e n e st o g e t h e rf o r ma l lA B Ct r a n s p o r t e rf o rz i n ci o nt r a n s p o r t T h e s er e s u l t ss t r o n g l ys u g g e s tt h a tt h ef o u rA B Ct r a n s p o r t e rg e n e sm i g h tb ed i r e c t l yi n v o l v e di nz i n ct r a n s p o r tmA c i d i t h i

12、o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n sD C K e yw o r d s：A c i d i t h i o b a c i l l u s 知m o x i d a n s；A B Ct r a n s p o r t e r；R T-q P C R；z i n ci o ns t r e s s；b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i s嗜酸氧化亚铁硫杆菌(A c i d i t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s)1 1 是一种重要的浸矿菌种，在工

13、业上经常被用作还原金、银、铜、铀等重金属【科。在这些菌种生活的环境中，通常都含有较高浓度的重金属，因此，像大部分的浸矿菌一样，A c i d i t h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s“t 力舢瓤砒脚)对很多重金属都具有很高的耐受能基金项目；国家重点基础研究发展计划资助项目(2 0 1 0 C B 6 3 0 9 0 1)收稿日期：2 0 1 1-0 2 1 7；修订日期：2 0 1 1-0 5 0 9通信作者：吴学玲，副教授，博士；电话：0 7 3 1-8 8 8 3 6 9 4 4；传真：0 7 3 1-8 8 7 1 0 8 0 4

14、：E-m a i l：x u e l i n 9 0 7 1 4 y a h o o n e n万方数据1 4 9 8中国有色金属学报2 0 1 2 年5 月力【3】o 近年来，A t f e r r o o x i d a n s 对重金属的这种高耐受能力越来越引起人们的关注【4】。尽管A t f e r r o o x i d a n s标准菌A T C C 2 3 2 7 0 的全基因组序列己在2 0 0 7 年被全部测出，但是却很少有基因1 5-8 1 被证明与这种高抗性能的体现有直接关系。锌对于生物体来说是一种必须的微量元素，许多重要的功能蛋白和酶都需要锌作为其结构或者是辅助因子1

15、9-1 0 1。但是，一旦体内的锌离子浓度过高，将会对呼吸链产生抑制从而对细胞造成毒害作用 1 1-1 2】。因此，细胞需要调节其体内的锌离子含量在一个合适的水平。近年来有研究报道A t f e r r o o x i d a n s 对锌离子具有很高的耐受能力，它可以在3 0g，L 的锌离子环境中生存【”1。然而，什么机制使A t f e r r o o x i d a n s 具有如此高的抗锌能力，至今仍不清楚。关于锌离子的转运机制，研究较多的是一种存在于大肠杆菌中的依赖于A T P a s e 的A B C 转运子Z n u A B C t m l 5】，它主要负责从外界环境中摄取锌离子

16、。通常来说，这种A B C 转运子【1 4】主要由绑定在周质空间上的锌离子结合蛋白Z n u A、两个透性酶Z n u B 以及为此过程提供能量的触四结合蛋白Z n u C 组成。锌离子的这种转运机制在其他的菌种中也普遍存在【峥m，例如：肺炎链球菌(S t r e p t o c o c c u s p n e u m o n i a e)，格氏链球菌(S t r e p t o c o c c u sg o r d o n i O。肠道沙门氏杆菌(S a l m o n e l l ae n t e r i c a)。2 0 0 7 年C H I 等【1 8 1 对可能存在于A t f e

17、r r o o x i d a n sA T C C 2 3 2 7 周质空间上的蛋白进行了鉴定，推测A F E2 4 3 8 所编码的蛋白是一种位于周质空间上的锌离子转运蛋白，它的功能可能类似与Z n u A B C 中的锌离子绑定蛋白Z n u A。而位于其下游的基因A F E2 4 3 7、A F E2 4 3 6、A F E2 4 3 5 与其一起共同组成一个A B C转运子，完成锌离子的转运。尽管如此，至今仍没有任何实验数据证明这4 个基因与A t f e r r o o x i d a n 中的锌离子转运有关。本文作者以这4 个基因(A F E2 4 3 5、A F E2 4 3

18、6、A F E2 4 3 7、A F E2 4 3 8)作为研究对象，利用实时荧光定量P C R 技术【1 9 嶝证在不同浓度的锌离子刺激下它们在基因转录水平上差异表达情况，并通过生物信息学手段对这4 个基因及其编码的蛋白进行结构和功能的预测。I 实验I I 材料1 1 1 菌种与培养基A t f e r r o o x i d a n sD C 由中南大学生物冶金教育部重点实验室从取自广西大厂铜矿的酸性矿坑废水中分离得到。A t f e r r o o x i d a n sD C 生长于9 K 基础培养基2 0 1，3 0，1 7 0r m i n 摇床无菌培养。能源物质为单质硫：1 0以

19、。1 1 2 其他试剂D N A 提取试剂为E Z 一1 0s p i nc o l u m ng c n o m i cD N Ai s o l u t i o nk i t(B i o B a s i cI n c)，D N A 凝胶回收试剂盒为(E Z N A m G e lE x t r a c t i o nK i t P r o m e g a)，R N A 提取试剂为T r i z o l(I n v i t r o g e n)，R N A 纯化试剂盒为S VT o t a lR N AI s o l a t i o nS y s m m(P r o m e g a)R N A

20、 反转录试剂为S u p e r S c r i p t T MI I 反转录酶(I n v i t r o g e n)1 2 实验方法1 2 1 菌种收集前期预实验表明A t f e r r o o x i d a n ss t r a i nD C 能够耐受较高浓度的锌离子，但是其生长繁殖情况会受到一定的抑制，本实验中选用1、l O 和1 0 0m m o l LZ n 2+作为锌离子刺激环境。首先将A t f e r r o o x i d a n ss w a i nD C 接种至不含锌离子的标准培养基，培养至对数期时离心收集菌种(4，1 0r a i n，1 20 0 0r r a

21、 i n)，再将所收集的菌种等量接种于含有0、l、1 0 和1 0 0m m o l Lz n 2+的9 K 培养基中，分别培养2 4h 后，再次离心收集菌种，马上进行D N A 和R N A 提取步骤。1 2 2D N A 提取及Z n u A j 酆3 的克隆测序细菌基因组提取使用E z 1 0s p i nc o l u m ng e n o m i cD N Ai s o l u t i o nk i t。以提取后的D C 基因组为模板扩增基因A F E2 4 3 5、A F E2 4 3 6、A F E2 4 3 7、A F E2 4 3 8。P C R 扩增条件为：预变性：9 4，

22、3n l i n t 变性：9 4，4 5S，退火：6 0，4 5s，延伸：7 2，9 0s，共3 0个循环；延伸：7 2，1 0m m。P C R 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后切胶，回收，送去上海生物工程公司测序。实验中所用到的引物如表l 所列。l，2 3R N A 提取与c D N A 的合成采用T r i z o l 一步法提取总R N A，用R N A 纯化试剂盒(P r o m e g a)纯化粗R N A，用N a n o D r o p 微量分光光度计(N a n o D r o pT e c h n o l o g i e s)检测R N A 的浓度和纯度。取等量的R N A 进

23、行反转录，反转录采用I a v i t r o g e n公司S u p e r S c f i p t T M I I 反转录酶和随机引物，以总R N A 中m R N A 为模板，反转录合成c D N A，反转录后用N a n o D r o p 微量分光光度计测定每一个c D N A 的浓度，然后将e D N A 样品浓度均调至2 0 0m g 几，于-2 0 冷藏备用。1 2 4R e a l-t i m eq P C R1 2 4 1 标准样品的制备万方数据第2 2 卷第5 期侯冬梅。等：嗜酸氧化亚铁硫杆苗中锌离子转运基因的鉴定与分析1 4 9 9分别以目标基因及内参基因为样品，以c

24、 D N A 为模板进行普通P C R 扩增，P C R 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。然后将P C R 产物进行1 0 倍梯度稀释，取1 0-3 1 0-7 做标准品用于制备标准曲线做5 个点。普通P C R 程序如下：预变性：9 4，3m i B t 变性：9 4，3 0S，退火：5 5，3 0S，延伸：7 2，3 0s，共3 5个循环；最后7 2 补平5 r a i n。1 2 4 2 实时定量P C RR e a l t i m eq P C R 反应程序如下：预变性：9 5，3m i n；变性：9 5，3 0s，退火；5 9，2 0s，延伸7 2，2 0s，共4 0 个循环；5 5 9

25、5，1 0s，每循环一次温度增加0 5，共8 0 个循环。每组实验设置3 个平行，选用1 6 Sr R N A 为内参基因【5】，阴性对照不加任何模板。表1 常规P C R 引物T a b l e1P r i m e r su s e di nT a qP C R实验结束后，用2 一“a 法1 7,2 1 1 处理数据，即通过与对照组基因表达量的对比计算出每个基因的相对表达量，且每个基因都以1 6 Sr R N A 作为内参基因进行了校正。实验中所用到的引物如表2 所列。1 2 5 生物信息学分析用V e c t o rN T I(v e r s i o n7 1)做一般序列操作。用c l u

26、 s t e rX 做序列比对。B L A S T(1 l t i p：w w w n c b i n i h g o v b l a s t B l a s t c g i)做相似性搜索。O R FF i n d e r(h t t p：w w w n c b i h i m n i h g o v g o r f g o r f h t m l)寻找基因的开放阅读框。E x P A S yP r o t e o m i c sS e r v e r(h a p：H e x p a s yo r g e g i b i n p i _ t 0 0 1)进行蛋白质等电点以及相对分子量的计算。P

27、 S O R T bv 3 0(h t t p：w w w p s o r t o r g p s o r t b l 做蛋白亚细胞结构定位。T M H M MS e r v e rv 2 0f h t t p：w w w c b s d t u d k s c I v i v e-s F 1a n dR 1a r eT a q P C Rp r i m e r sf o rc l o n i n gA F E _ 2 4 3 5，A F E _ 2 4 3 6A F E _ 2 4 3 7a n dA F E2 4 3 8g e n e sf r o mc h r o m o s o m a

28、 lD N Ap r e p a r a t i o n so f A t f e r r o o x i d a n sD C 表2R T-q P C R 引物T a b l e2P r i m e r su s e di nR T-q P C RA n n o t a t e df u n c t i o nP r i n l e rs e q u e n c e(5 -3)A m p l i e o nl e n g t l l b pA F E2 4 3 5A F E2 4 3 6A F E2 4 3 7A F E2 4 3 7A F E0 2 5 4C a t i o nA B Ct

29、 r a n s p o r t e r,p e r m m s ep r o t e i n,p u t a t i v eC a t i o nA B Ct r a n s p o r t c T,p C l T f l P 2 t S ep r o t e i n，p u t a t i v eC a t i o nA B Ct r a n s p o r t e r,A T P-b i n d i n gp r o t e i n,p u t a t i v eC a t i o nA B Ct r a n s p o r t e r,p e r i p l a s m i ec a

30、t i o n-b i n d i n gp r o t e i n,p u m t i v e1 6 Sr I t N A譬A A G 嗍A G C 姒G A T G A C C C A C A 删A C C A1 2 6R，：F 2：T G A C G A C C A C C A G C A C T A CI，1R 2：G A C C C A C C A G C A A G A A C A CF 2：G I F G T T T G G G A G A T T G A C G C1 0 4R 2：C C A C C A G A T A G A C C A G A C G GF 2：T T G

31、 A C G G C r r C r r r C C T G A G TR 2：T A C C T C C G C C A G C A T C C A AF：A G A A C C T T A C C T G G G C T T G AR：G C T C G T T G C G G G A C 丌AF 2a n dR 2a 碍R T-q P C Rp r i m e 陪f o rc l o n i n go l i g o n u c l e o t i d eo f A F E _ 2 4 3 5 A F E2 4 3 6A F E _ 2 4 3 7a n dA F E _ 2 4 3 8

32、g e n e sf r o mc D N A Fa n dRa l eR T-q P C Rp r i m e r sf o rc l o n i n go l i g o n u e l e o t i d eo f1 6 Sr R N Ag e n ef r o me D N A 万方数据1 5 0 0中国有色金属学报2 0 1 2 年5 月T M H M M-2 0 0 做蛋白质的跨膜分析。N C B Ic o n s e r v e dd o m a i n s(h t t p：w w w n c b i h i m n i h g o v S U u c t u r e c d d

33、 w r p s b c g i)找寻蛋白的保守区域。2 结果2 1Z n u A f 基因的克隆测序以A t f e r r o o x i d a n sD C 基因组为模板扩增得到A F E2 4 3 5、A F E2 4 3 6、A F E2 4 3 7、A F E2 4 3 8 的基因片段，电泳检测结果如图l 所示，扩增产物长度与目标基因长度基本相同，且均无杂带，引物特异性较好。4 个基因的测序结果经B L A S T 进行序列比对，结果与嗜酸氧化亚铁硫杆菌标准菌株A T C C2 3 2 7 0 中的这4 个基因的序列完全相同。15 0 0 b p【0 0 0 b p图1目的基因A

34、 F E2 4 3 5、A F E2 4 3 6、A F E2 4 3 7、A F E2 4 3 8 的P C R 产物电泳图脚1E l e c t r o p h o r o s i sa n a l y s e so fP C Rp r o d u c t so fA F E _ 2 4 3 5，A F E _ 2 4 3 6，A F E _ 2 4 3 7a n dA lE 一2 4 3 82 2 不同浓度Z n 2+刺激下相关基因的差异表达实时荧光定量P C R 后，溶解曲线峰带单一，没有杂峰出现，说明特异性较好；标准曲线癣值均接近于1，说明C t 值与其起始拷贝数的对数值之间的关系性

35、好：内参基因1 6 Sr R N A 在不同环境中的表达量均较为衡定，无显著性差异。经内参基因校正，各基因在转录水平上的相对表达量如图2 所示。在不同浓度的锌离子刺激下，4 个基因(A F E2 4 3 5、A F E2 4 3 6、A F E2 4 3 7、A F E2 4 3 8)的表达量均有所上调，且随着锌离子浓度的增加，各基因上调的倍数也有所增加。A F E2 4 3 5 和A F E2 4 3 6 上调最为明显，1m m o l LZ n 2+刺激时，A F E2 4 3 5 上调了1 6 倍，A F E2 4 3 6 上调了3 3 倍，而此时A F E2 4 3 8 仅上调了9 倍

36、，A F E2 4 3 7仅上调了3 倍。当锌离子浓度增加到1 0m m o l L 时，A F E2 4 3 5 上调的倍数高达2 3 0 倍，A F E2 4 3 6 上调的倍数为2 7 0 倍，A F E2 4 3 8 上调的倍数为7 7 倍，虽然此时A F E2 4 3 7 的表达量也有所增加，但是与其他3个基因相比较，A F E2 4 3 7 的上调幅度较小，当锌离子浓度为1 0m m o i L 时仅上调了5 倍。当锌离子浓度为1 0 0m m o l L 时，4 个基因的表达量与未加锌离子刺激的基因表达量相比较，均呈现出明显的上调趋势，A F E2 4 3 5 上调了4 4 2

37、倍，A F E2 4 3 6 上调了5 1 2 倍，A F E2 4 3 7 上调了2 2 倍，A F E2 4 3 8 上调了3 2 1 倍。图2 不同锌离子刺激条件下A F E2 4 3 5、A F E2 4 3 6、A F E 一2 4 3 7、A F E _ 2 4 3 8 的差异表达F i g 2D i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n so fg e n e s(A F E _ 2 4 3 5，A F E _ 2 4 3 6，A F E 一2 4 3 7a n dA F E _ 2 4 3 8)u n d e rd i f f e r e

38、 n tZ n 2+c o n c e n t r a t i o n s2 3 生物信息学分析本研究对实验中涉及到的4 个基因(A R E、_2435A F E _ 2 4 3 6、A F E2 4 3 7、A F E2 4 3 8)以及其编码的蛋白进行了相关的生物信息学分析。在此将它们所编码的蛋白分别命名为：历z t 口b、Z n u B 2 A f、Z n u G：和Z n U A A f 通过对4 个基因进行开放阅读框的找寻以及等电点和分子量的计算可知：基因A F E2 4 3 5 的开放阅读框的长8 1 0b p；它所编码的蛋白Z n u B l A s 的相对分子质量为2 85 7

39、 2 2 7D a，等电点为1 0 1。基因A F E _ 2 4 3 6 含有一个长为8 9 1b p 开放阅读框；它所编码的蛋白Z n U B 2 A f 的相对分子质量为3 07 0 4 7 2D a，等电点为9 0 4。基因A F E2 4 3 7 的开放阅读框长8 2 5b p，历甜a，的相对分子质量为2 90 6 8 6 0D a，等电点为6 6 6。而基因A F E2 4 3 8 的开放阅读框的长度为5 1 3b p，其编码的蛋白z，l l f 4 r 的相对分子质量为3 17 3 9 2 1D a。等电点为8 5 1。为了更进一步了解这4 个蛋白所行使的功能，还对Z n u B

40、 l A f 等4 个蛋白进行了亚细胞结构定位、跨膜结构域分析以及保守区域的分析。结果表明：Z n u B l A r与Z n u B 2 A f 均位于质膜上，其中Z n U B l A 有6 次跨膜，Z n u B 2 x 有7 次跨膜。保守区域分析表明Z n u B l a f 与万方数据第2 2 卷第5 期侯冬梅，等：嗜酸氧化亚铁硫杆菌中锌离子转运基因的鉴定与分析1 5 0 1z n u s 含有相同的保守区域c d 0 6 5 5 0，该保守区域是T MA B Ci r o n s i d e r o p h o r e s所特有1 i k es u p e rf a m i l y

41、的；历“a，也位于细胞质膜上，但是它并不存在跨膜结构域，经比对发现z 订u c 的保守区域与P 1 0 0 pN T P a s es u r p e rf a m i L y 家族中的蛋白高度相似，而且Z n u C J：还具有与该家族蛋白相同的保守基序(-L S G G Q)tZ n u A A y 是4 个蛋白中唯一一个位于周质空间上的蛋白，它也不存在跨膜结构域，它的保守区域与T r o A-l i k ef a m i l y 中的保守区e d o l 0 2 0 高度相似。3 讨论与分析本实验中，对A t f e r r o o x i d a n sD C 中4 个与锌离子转运相关

42、的基因(A F E2 4 3 5、A F E2 4 3 6、A F E2 4 3 7、A F E2 4 3 8)进行了克隆、测序，并应用实时荧光定量P C R(R T-q P C R)t 2 2-2 4 j 技术来检测不同浓度锌离子刺激下这4 个基因的相对表达量。实验中所选用的内参基因为1 6 Sr R N A。虽然近年来有研究认为，在某些情况下以1 6 Sr R N A 作为内参基因校正基因的相对表达量时可能存在误差【矧，但是在本实验中1 6 Sr R N A 在不同锌离子环境中的表达量均相对稳定，因此可以作为内参基因。R T-q P C R 结果表明，对于锌离子的胁迫，这4 个基因都具有很

43、强的敏感性，在较低浓度(1r e t o o l L)刺激时。A F E2 4 3 5 和A F E2 4 3 6 的反应较大，分别上调了1 6 倍和3 3 倍数；随着锌离子浓度的升高，其它两个基因的表达量也出现了明显的上调趋势，当锌离子刺激浓度达到1 0 0r n m o l L 时，A F E2 4 3 7 上调了2 2倍，A F E2 4 3 8 上调了3 2 1 倍，而此时A f E2 4 3 5 和A F E2 4 3 6 的上调倍数分别达到了4 4 2 倍和5 1 2 倍。此实验数据表明，A t f e r r o o x i d a n sD C 中的这4 个基因(A F E _

44、 2 4 3 5，A F E2 4 3 6，A F E _ 2 4 3 7，A F E _ 2 4 3 8)对于锌离子的胁迫非常敏感。这4 个基因可能与其能够耐受较高浓度的锌离子有着密切的关系。生物信息学的分析结果表明：基因A F E2 4 3 5 和A F E2 4 3 6 所编码的蛋白Z n u B I A 与Z n u B 2 A f 与位于质膜上的铁载体蛋白有着相同的保守区域，这个家族中的蛋白通常是作为A B C 转运子f 2 6】的一个组件而存在。砌甜a，的保守区域属于P 1 0 0 pN T P a s es u r p e rf a m i l y，该家族中的蛋白含有A T P

45、或者G T P 的结合位点，它们与i r o n s i d e r o p h o r e su p t a k ef a m i l y 拥有共同的祖先，这两个家族中的蛋白都与锌离子、锰离子、铁离子的转运密切相关。Z n u A 属于T r o A 1 i k ef a m i l y。这个家族中的蛋白在A B C 转运子转运金属离子的过程中担当金属离子的受体。综上所述，可以推断在一tf e r r o o M d a n sD C 转运锌离子的过程中，Z n u B I A：、Z n u B 2 A pZ n u C p 洳“，共同组成了一个转运Z n 2+的A B C 转运子，其中z

46、m d，主要负责在周质空间中绑定锌离子，Z n u B l，和Z n u B 2 作为透性酶负责锌离子向细胞内的运输，z n u G：作为A T P 结合蛋白为此过程提供能量。4 结论1)首次鉴定了4 f e r r o o x i d a n sD C 中与z n 2+转运相关的4 个A T P-b i n d i n gc a s s e t t e(A B C)t r a n s p o r t e r 基因。2)在不同浓度锌离子刺激下，A t f e r r o o x i d a n sD C中的这4 个A B Ct r a n s p o r t e r 基因(A F E2 4 3

47、 5 A F E2 4 3 6，A F E2 4 3 7，A F E2 4 3 8)的相对表达量均呈上调趋势，说明这4 个A B Ct r a n s p o r t e r 基因对于锌离子的胁迫非常敏感。3)经生物信息学分析可知基因A F E2 4 3 5 和A F E2 4 3 6 所编码的蛋白是位于细胞质膜上的透性酶，基因A F E2 4 3 7 编码的蛋白也位于细胞质膜上，是一种A T P 结合蛋白，而基因A F E2 4 3 8 编码位于周质空间的锌离子结合蛋白，这4 个基因共同组成了一个与锌离子转运有关的A B C 转运子。4)推断A t f e r r o o x i d a n

48、 sD C 中的这4 个A B Ct r a n s p o t t e r 基因(A F E2 4 3 5、A F E2 4 3 6、A F E2 4 3 7、A F E2 4 3 8)对于其能够耐受较高浓度的锌离孑刺激有着密切的关系。R E F E R E N C E S1 1】I N G L E D E WWJ T h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n s：T h eb i o e n e r g e f i c so f i d o p h i l i cc h e m o l i t l a o t r o p h 四B i o e

49、h i mB i o p h y sA e t a,1 9 8 2 6 8 3(2)：8 卜11 7【2】R A W L I N G SDE C h a r a c t e r i s t i c sa n da d a p t a b i l i t yo fi r o n-a n ds u l f u r-o x i d i z i n gm i c r o o r g a n i s m su s e df o rt h er e c o v e r yo fm e t a l sf r o mm i n e r a l sa n dt h e i rc o n c e n r a t

50、e s J M i c r o b i a lC e l lF a e t o r i m，2 0 0 5 4：1 3【3】3D O P S O NM，B A j(E R-A u s T l NC K O P P 陇E D lP B O N DPL G r o w t hi ns u l f i d i em i n e r a le n v i r o n m e n t s：M e t a lr e s i s t a r t e em e c h a n i s m si na c i d o p h i l i cm i c r o o r g a n i s m s J M i c