乳腺癌基因芯片数据分析.pdf

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1、复 里亏提(医学版)F u d a n Un i v J Me d s c i 1 6 9 乳腺癌基因芯片数据分析 蒋 定 锋 高 峻 赵耐 青 (复旦大学 公共卫生学院卫生统计 与社会医学教研 室 上海2 0 0 0 3 2)【摘要】目的以乳腺癌病人的表达谱芯片数据为基础，探寻乳腺癌复发的相关基因。方法对标化芯片数据 进行缺失值处理后，分别用单因素 C O X回归模型和综合了聚类及多因素 CO X回归的综合法来筛选兴趣基因，然后通过兴趣基因对病人做样品聚类，以灵敏度、特异度、约登指数和 K a p l a n Me ie r 法评价分类效果，最后结合 文献和蛋白质数据库探寻乳腺癌复发的相关基

2、因。结果综合法筛出的 3 O个 P0，0 1的基因对乳腺癌病人复 发状况的预测效果最佳；单因素 CO X回归筛出的 1 0 2个 P0，0 1的基因的预测效果较差；单因素 C 0 X回归筛 出的 1 5个 P0 0 0 1的基因预测效果最差。结论综合法筛选得到的 3 O个基因可用来评价病人的预后状况，为进一步的生物学研究提供待选基因。【关键词】乳腺癌；基因芯片；聚类分析；C O X回归模型 【中国图书馆分类法分类号】R 7 3 7 9，0 2 1 2，1 M i c r o a r r a y Da t a An a l y s i s f o r Br e a s t Ca n c e r

3、J I ANG D i n g f e n g，G AO J u n，Z H AO Na i q i n g (D e p a r t m e n t o fHe a l t h S ta t i s t i c s a n d S o c i a l Me d i c i n e，S d m o l o fP u b l i c He a l t h，F u d a n U n i v e r s i t y S h a n g h a i 2 0 0 0 3 2，C k i n a)【A b s tr a c t】P u r p o s e T o s t u d y t h e r e

4、la p s e-r e la t e d g e n e s b a s e d o n g e n e e x p r e s s io n p r o f il e s f r o m b r e a s t c a n c e r p a t i e n t s wi t h d i f f e r e n t c l i n i c a l o u t c o me s Me t h o d s F i r s t l y，u n i v a r i a t e C OX r e g r e s s i o n mo d e l wa s u s e d t o a n a l y

5、s i s t h e mi c r o a r r a y d a t a t O s e l e c t t h e p o t e n t i al g e n es S e c o n d l y，a n i n t e g r a t ed me t h od c o mp o s e d o f c l u s t e r and mu l t i v a r i a t e O 0X a n aly s i s wa s a l s o c a r r i ed o u t，Th e n K me a n s c l u s t e r me t h od wa s a p p

6、l i e d t O c l a s s i f y t h e r e l a p se s i t u a t i o n o f p a t i e n t s S e n s i t i v i t y，s p e c i f i c i t y，Yo u d e n S i n d e x and Ka p l a n Me i e r a n a l y s i s we r e u s e d t O e v alu a t e t h e g e n es sel e c t ed b y d i f f e r e n t me t h ods，Re s u l t s T

7、h e 3 0 g e n es(P0 0 1)s e l e c t ed b y t h e i n t e g r a t e d me t h od perfo r me d b e s t wh e n p r e d i c t i n g t h e r e l a p se s i t u a t i o n o f p a t i e n t s，Th e 1 0 2 g e n es(P 0 0 1)b y u n i v a r i a t e C O X a n al y s i s perf o r me d w e l l wh i l e t h e 1 5 g

8、e n es(P0 0 0 1)b y u n i v a r i a t e CO X ana l y s i s perf o r med wo r s t，C o n c l u s i o n s Th e 3 0 g e n es s e l e c t ed b y t h e i n t e gra t ed me t h od，e s p e c i al l y t h e g e n es wh i c h we r e al s o p i c k ed o u t b y t h e o t h e r t wo me t h ods，a r e wo r t h y

9、o f f u r t h e r e x p e ri me n t s t o a&s e s 8 t h e r esu l t S o f mi c r o a r r a y 【K e y w o r d s】b r e a s t c a n c e r；m i c r o a r r a y；c lu s t e r a n al y s is；CO x r e g r e s s io n m ode l 乳腺癌是西方女性的高发肿瘤。在我 国发病率 也逐年升高，尤其在京、津、沪等沿海发达地 区，其中 以上海最高，1 9 9 7年发病率 为 4 9 1 0万，居女性恶 性肿瘤 的

10、首位。目前具有相同症状及病理类型的患者经过相同 治疗后，在预后上存 在极大差别。这说 明当前乳腺 癌的分类标准有待提 高，同时提示病人 内在 的基 因 表达对病人的预后具有重要意义。基因芯片能同时 检测数千个基因的表达，了解病人特异的表达谱，为 通讯作者E ma il：n q z h a o s h mu e d u c n 系统研究乳腺癌预后 的相关基 因提 供 了技术保证，从而成为乳腺癌研究领域的一种常规技术。如何对芯片产生 的海量数据进行分析，以获得 有效 的生物学信息来指导后续研究是乳腺癌研究的 重点和难 点。我们利用 C h r i s t o s 等 j 提供 的数据，综合运用聚类

11、和 C O X 回归模型两 种方法来筛选 乳 腺癌复发的相关基因。为 了克服多重 比较导致假阳 性增大的危险，本研究对 P值进 行 了控制。该芯片 数据包 括 9 9个病 人的乳腺癌样 品的 7 6 5 0个探针，维普资讯 http:/ 1 7 0 复旦学报(医学版)2 0 0 5年 3月，3 2(2)其数据矩阵为 9 97 6 5 0，并且 已知 9 9个病 人的其 他信息如复发与否、复发时间和失访时间等。材 料 和 方 法 缺失值的处理 对缺失少于 1 3的标化探针数 据(即至少有 6 6个病人 有该探 针数 据)共 7 4 7 5个 探针进行缺失值处 理。7 4 7 5个探 针中 4 4

12、 0 4个无 任何缺失，而其 他 3 0 7 1个则有 不 同程 度 的缺 失。将3 0 7 1 个探针分 别作为应变量，4 4 0 4个探 针为待 选 自变量，利用 S AS软件用多元逐步 回归法填充缺 失值，采用前进法，人选标准 a=0 0 0 1，控制模型变 量个数。单因素 C O X回归分析 对 7 4 7 5个探针进行 单因素 C OX 回归分析，乳腺 癌 复发定义 为失效事 件，结果有 1 5个探针的 P0 0 0 1，将对数风险函数 的预测值定义为 Y 1=Z (i=1，2 1 5)；同时有 1 0 2个探 针的 P0 0 1，将对数风险 函数 的预测值 定义 Y2，=Z (j-

13、=1，2 1 0 2)。综合法分析 用单 因素 CO X回归分析对 7 4 7 5 个探针进行初筛，乳腺癌复发定义为失效事件，人选 标准 a=0 1，共有 8 1 6个探针入选。对 8 1 6个探针 用层次聚类法 聚类，组间连接 法，P e a r s o n相关 系数 为指标，聚成 2 O类。然后用 多因素 C OX回归模型 对每一类来筛选兴趣探针，采用逐步 回归法，人选标 准 P=0 0 1，移出标准 P=0 0 1 1。结果 2 0类中有 7 类无一个探针符合人选标准，其余 1 3类中共有 3 0 个探针符合标准。将 3 0个探针所在 1 3个类的对数 风险函数预测值定义为 Y 3 女=

14、(k=1，2 1 3)。K Me a n s 聚类 分别 以单因素 C O X 回归分析 得到 的线 性 预 测值 y1 (i=1，2 1 5)、y2，(j _=1，2 1 0 2)和综合法得到 的线性 预测值(是=1，2 1 3)为应变量，用 K Me a n s聚类法对 9 9个病 人 进行聚类，分成 2类。效果评价对 3个聚类结果分别与病人的实际 复发状况比较，计算灵敏度、特异度 和约登指数，然 后以预测分类结果为分组变量；用 Ka p l a n Me i e r 法 对病人的复发时间作生存 分析，评 价不同方 法得 到 的 1 5、1 0 2和3 0 个兴趣探针的分类效果，结合文献

15、报道探寻乳腺癌复发的相关基因。结 果 以 Yl 、Y 2 j 和 y3 女 为 指标 做样 品聚类后，分类 和实际复发情况见表 1 3。由表 1 3可见以 3 女 为指标作分类，其预测效 果最佳、2，次之，y1 最差。表 1 Y 1 为指标聚类后结果 Ta b 1 Cl u s t e r r e s u l t s b y Yl i Th epredi c te dstatusofthe p a ti e nts Th e r e a l s t a t u s o f pa t ie n ts N o t r e l a p s e：Re la p s e：,S r n r 1 l 1 t

16、 P r 1 r 11 ls t P r 2 No t r da p s e：0 Re l a p s e：1 S e n s i t i v i t y(9 5 c o n f i d enc e in t e r v a 1)S p e c i f i c i t y(9 5 c o nfid enc e i n t e r v a 1)Y o u d en Sin d e x 4 3 1 1 5 4 1 9 2 6 4 5 6 2 3 7 9 9 2 6 4 5=0 5 7 8(0 4 2 2 0 7 2 3)4 3 5 4：0 7 9 6(0 6 6 5 0 8 9 4)0 5 7 8

17、+0 7 9 61=0 3 7 4 No t e：C l u s t e r r e s u l ts o f 1 5 p r o b e s t h r o u g h u n i v a r i a t e C O X a n a l y s is(P 0 0 01)表 2 Y 2 为指标聚类后结果 Ta b 2 Cl u s t e r r e s u l t s b y Y2 The predi c t edsta，tus ofthepa ti ents Th e r eal s tat us o f pa t i ents No t r e l a p s e：Re l a p s

18、e：,S r n dust e r1 c l ust e r 2 NO t r d a pae：0 Re l a p s e：1 S u m Sensi t ivit y(9 5 c o n f id e n c e i n t e r v a 1)S p e c i f ic i t y(9 5 c o n f i d e n c e in t e r v a 1)Yo u d e F l S i n d e X 3 8 1 6 5 4 6 3 9 4 5 4 4 5 5 9 9 3 9 5=0 8 6 7(0 7 3 20 9 4 9)3 8 54=0 7 0 4(0 5 6 4 0 8

19、2 0)0 8 6 7+0 7 0 41=0 5 7 1 No t e：C l ust e r r e s u l ts o f 1 0 2 p r o b e s t h r o u g h u n i v a r ia t e C O X a n a l y s is(P 0 0 1)表 3 Y 为指标聚类后结果 Ta b 3 Cl u s t e r r e s u l t s b y Ya k Th e p r ed icted sta tu。sof th epatients Th e r eal S taS o f pa t i e n ts No t r d a pae：Re l

20、a p s e：,S r n c l ust e r 1 c l u s t e r 2 NO t r e l a p s e：0 Re la p s e：1 S u m S e n s i t i v i t y(9 5 c o n f i d e n c e in t e r c a t)S p e c f c i t v(9 5 c o n f id e n c e i n t e r v a 1)Yo u d e n S i n d e x 4 6 8 5 4 6 3 9 4 5 5 2 4 7 9 9 3 9 4 5=0 8 6 7(0 7 3 2 0 9 4 9)4 6，4=0 8

21、 5 2(0 7 2 9 0 9 3 4)0 8 6 7I0 8 5 2 1=0 7 1 9 C lust e r r esu l ts o f 3 0 p r o b ea t h r o ugh t h e i n t e g r a t e a n a l y s i s(P0 0 1)对各 分 类结 果 作 Ka p l an Me i e r分 析发 现，以 y1 y2，、y3 女 为变量分类后，每个 分类结果 的两类 病人其复发状况均有统计学意义，P 1 3 的探针数据，这可能是造成本研究单 因素 o 0 X回 归分析只有 1 5个探针(P0 0 0 1)，而 C h r i s

22、t o s等 报道有 1 6个探针(P0 0 0 1)的原因。两者有 6个探 针不相符，这可能是 由于对缺失值做 r处理 引起，但 也可能是假阳性(理论上在 a=0 0 0 1 水平，假 阳性探 针数=7 4 7 5 0 0 0 1 7个)。比较两者发现，9个探 维普资讯 http:/ 1 7 2 复旦学报(医学版)2 0 0 5年 3月，3 2(2)针跟 C h r is t o s 等 2 报道吻合的探针代表 7 个基因，分别 是 腺 嘌 呤 核 苷 酸 转 移 子 2(a d e n i n e n u c l e o t i d e t r a n s l c t o r 2，S L

23、C 2 5 A 5)、T细胞 Q受体(T-c e l l r e c e p t o r a l p h a)、丝氨酸甲基化酶 r e fi n e me t h y l a s e，S H MT 2)、精 细胞核周 R NA结合蛋 白(s p e r ma t i d p e r i n u c l e a r t L N A-b i n d i n g p r o t e i n，S T R B P)、类维生素 A及甲状腺激素沉 寂 因子(s i l e n c i n g me d i a t o r o f r e t i n o i d a n d t h y r o i d h o

24、 r I T I o n e a c t i o n，N OD R 2)、D p-1转 录因子(t r p t i o n f a c t o t D p-1，T F D P 1)、p R B 结 合 转 录 因子(p R B-b i n d i n g t r a n s c r i p t i o n f a ct o r，F 4)，其 中 3个探针代表 同一基 因：腺 嘌 呤核 苷 酸转 移 子 2。其 他 6个 与 C h r i s t o s 等_ 2 一 报道 不符 的探针 分别是 磷酸甘 油 3醛 脱氢酶(g l y c e r al d e h y d e-3 一 p h o

25、 s p hat e d e h y d r o g e n a s e，G A P D)、乳 酸脱氢酶 A(1 a c t a t e d e h y d r o g e n a s e A，L DHA)、硫酸 乙 酰肝 素 3 0 磺 基 转移 酶 1 h e p a r a n s u lf a t e(g lu 一 mjn e)3 一 O s u lf o t r a n s f e r a re 1，H S 3 S T 1)、同系染色 体 隔 离 基 因(c h r o n K)ff m e s e g r e g a t i o n g e n e h o r n o l o g，

26、C S E 1 L)、d o l i c h y l d i p h c s p h o o l i g o s a c c h a r i d e-p rot e i n g l y cos y l t r a n s f e r a s e(D U3 S T)，以及一个 尚未定义序列 的 克 隆(H o mo s a p i e n s，c l o n e MG C：1 2 4 0 1 I MA G E：3 9 3 3 9 9 8，mR N A，comp l e t e c d s)。本研究提示综合法得到的 3 0个探针对乳腺癌 复发的影响较大。这 3 0个探针代表了 3 0个基因，其中

27、5个同时 出现在单 因素 C OX 回归 P0 0 0 1 的探 针集 中，分别是 腺嘌呤 核苷酸转 移子 2、h o mo s a p i e n s，c l o n e M GC：1 2 4 0 1 I M AGE：3 9 3 3 9 9 8，mR NA，c o mp l e t e c d s、类维生素 A及甲状腺激素沉寂因 子、硫酸乙酰肝素 3 0 磺基转移酶 1和 p R B结合转 录因子。其 中的 3个基 因：腺嘌呤核苷酸转移子 2、类维生素 A及 甲状 腺激素沉寂因子、p R B结合转 录 因子也同时出现在 C h r i s t o s 等_ 2 的报道中。查阅蛋 白质数据库发

28、现这 3个 基因都有转录因子活性，调 控细胞增殖过程。其 中类 维生 素 A及 甲状腺激 素 沉寂因子通过提高染色体的密度来降低某些核受体 的转录抑制活性(S w is s P r o t)，已有文献 3，4 报道 跟乳腺癌、子宫内膜恶变密切 相关。p R B结合转 录 因子则 通过 E 2识 别位点 与 D NA和 D P蛋 白结合(S wi s s P r o t)，调 控 细 胞 进 入 S期 的 基 因 表 达(Ge n a t l a s)，已有文献l 5 J 报道跟乳腺癌密切相关。虽 然腺 嘌呤核苷酸转移 子 2在线粒 体内膜 AT P A D P 交换过程中发挥重要作 用(S w

29、i s s-P r o t)，但与乳腺癌 尚缺乏相关 的研究，而 C h r i s t o s等 j 和本研 究都发 现代表该基 因的 3个 探针 都 出现在我们 的探 针集 中，提示该基 因可 能在乳腺癌 复发过程 中扮演重要 角色。此外，本研究得到的 3 0个兴趣基因并不包含 He r 一 2 n e u、9 5 3等传统认 为与乳腺癌预后相关 的基 因，这与 C h r i s t o等、Va n t 等 和 Mi k e等l 研究 结果相符。腺嘌呤核苷酸转移子 2、类维生 素 A及 甲状腺 激素沉寂 因子、p R B结合 转录 因子同时 在 3 0个探 针集、1 5个探针集(P0 0

30、 0 1)和 C h r i s t o s 等 报道 中出现，提 示与乳腺癌关 系密切。硫酸 乙酰肝 素 3 0磺基转移 酶 1和探针 Ho mo s a p i e n s，c l o n e MG C：1 2 4 0 1 I MAG E：3 9 3 3 9 9 8，m RNA，c o mp l e t e c d s同时 在 3 0个探针集和 1 5个探针集(P0 0 0 1)中出现；T细胞 a受体、丝氨酸甲基化酶和精细胞核周 R NA 结合 蛋 白则 同 时在 1 5个 探 针集(P0 0 0 1)和 C h r i s t o s 等 _ 2 J 报道 中出现，这 5个 基 因(探针

31、)与乳 腺癌的关 系也值得进一步探讨。本研究用单 因素 c ox回归分析初筛，减少待研 究变量。聚类算法根据 C h r i s t o s 等L 2 用 P e a r s o n相 关系数作为聚类指标，而在患者分类上 根据张瑞杰 等_ 8 的研 究采用 K Me a n s聚类。乳 腺癌 基 因芯片 研究 的关键是找到数量最少，但对乳腺 癌病人的预 后具有最重要影 响的基 因集合，并借此对 病人 的预 后作 出相对准确的评 价。我们得 到的 3 0个探针集 合能初步对病人 的愈后作 出判 断，尽管本 研究控制 了假阳性，但是对得到的兴趣基因，生物学家们还需 要从 生 物学角 度，用 R e

32、 a l Ti me P C R、We s t e r n B l o t 等技术来逐一验证，以剔除假阳性可能，为今后单基 因的致病机制研究作准备。参考文献 1 张杰，邵志敏，沈镇宙 基因芯片与乳腺 癌 肿瘤，2 0 0 2，2 2(4)：3 4 0 2 Ch r i s t o S，S o e k Yi n g N，Li s a MM，e t a 1 Br e a s t c a n c e r c l a s s i f i c a t io n and p r o g n c Ms b a s e d o n g e n e e x p r e s s i o n p r o f i l

33、 es f r o m a p o p u l a t io n b a s e d s t u d y P r 0 c f z Ac a d&，2 0 0 3，1 0 0(1 8)：1 0 3 9 3 3 C a r r o l l J S，L y n c h D K，S wa r b fi c k A，e t a 1 p 2 7(Ki p 1)i n d u c es q u i e s c e n c e an d g r o wt h f a c t o r i n s e n s it M t y in t a mo x i f e n t r e a t e d br e a s

34、t c a n c e r c e l ls C a n c e rR e s e a r c h，2 0 0 3，6 3(1 5)：4 3 2 2 4 Ke r s h a h S M，De s o u k i MM，Ko t e r b a KL，e t a 1 Ex p r e x s i o n o f e s t r o g e n r e c e pt o r c o r e g u l a t o r s i n n o r ma l a n d ma l ig nant h u ma n e n d o me t r i u m G 3 7 w c o l 0n c o l，2

35、 0 0 4，9 2(1)：3 0 4 5 M a c alU S O M，Cint i C，Ru s s o G，e t a1 p Rb 2 p1 3 0一 E2 F4 5一 HIDAC1 一 SUV3 9 H1 一 p 3 00 an d Rb 2 p1 3 0一 E2 F4 5 一 HDAC1 一 S UV39 H1 一 D 一 MT1 mu l t imo l e c u l a r c o mple x e s me d i a t e t h e t r a n s c r ip t i o n o f est r o g e n r e c e p t o r a l p h a

36、 i n b r e a s t C S _r l c e r On c o g e n e，2 0 0 3，2 2(2 3)：3 5 1 1 6 Va n t V，【，a u r a J，Ho n g y u e D，e t a l G e n e e x p r e s s io n p r o f i l in g p r e dic t s c l i n i c al o u t c o me of b r e a s t c a n c e r f 2 f 2 0 02，41 5：5 3 0 7 Mi k eW，C ar r ie B，Ho l l yD，e t a 1 P r e d i c t i n gt h e c l i n i c a l s t a t u so f h u ma n b r e a s t c a nc e r b y u s ing g e ne e x p r e s s i o n pr o f i l e s Pr o c dt z4c a d&，2 0 0 1，9 8(2 0)：1 1 4 6 2 8 张瑞 杰，许杰，王增权，等 利用基因 表达 谱对 组织样 品 分类方 法 的研究中国卫生统计，2 0 0 3，2 0(1)：2 (收稿日期：2 0 0 4 0 4 2 3；编辑：张秀峰)维普资讯 http:/