体积排阻色谱_电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒蛋.pdf

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1、DOI:10 3724/SP J1096201320845体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒蛋白组成方 勇杨文建马 宁汤晓智陈 曦胡秋辉*(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，南京 210046)摘要建立体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱(SEC-HPLC-ICP-MS)联用技术分析富硒大米含硒蛋白组成方法。通过水提、盐提、碱提和醇提方法提取，并用丙酮沉淀蛋白，硒的回收率分别为 9 6%，16 8%，48 2%和 14 9%，纯化后的蛋白结合硒的量由大到小依次为碱溶谷蛋白 球蛋白 醇溶蛋白 清蛋白。蛋白液经 SEC-HPLC-ICP-MS

2、检测，通过蛋白色谱峰(=280 nm)和 ICP-MS 硒峰(78Se)对比分析，利用分子量标准曲线测定出 4 类蛋白中含硒蛋白的分子量。结果表明，富硒大米中清蛋白和醇溶蛋白并不是硒的主要存在蛋白。硒主要存在于 7 kDa 的碱溶谷蛋白和球蛋白，其中碱溶含硒蛋白主要组分 F1分子量为 199 8 kDa。关键词体积排阻色谱;高效液相色谱;电感耦合等离子体质谱;大米;含硒蛋白2012-08-20 收稿;2012-10-08 接受本文系国家自然科学基金(No 31101247)、江苏省高校自然科学基金重点项目(No 10KJA550011)和江苏省自然科学基金(No BK2011833)资助*E-

3、mail:qiuhuihu njue edu cn1引言稻米是世界上的主要粮食之一，全世界一半以上人口以大米为主食。大米蛋白是谷类蛋白中的最佳蛋白，被公认为优质的食品蛋白。蛋白质在大米中含量一般为 5%8%，胚乳中蛋白可分为 4 类:谷蛋白(80%以上)，清蛋白(4%9%)，球蛋白(10%11%)和醇溶谷蛋白(2%4%)1。硒(Se)是人和动物的必需微量元素之一，在防癌、抗癌，预防和治疗心血管疾病、克山病和大骨节病等方面的重要作用已为世人所公认2。近年来，硒的研究重点逐渐从总硒转移到有机硒的研究。其中，硒蛋白已成为研究热点之一3。国内外十分重视大米蛋白的研究和开发利用，而对于富硒大米蛋白的研究

4、较少。Xu 等4 发现富硒大米的水提物具有较好的抗氧化活性，并与硒的含量成剂量关系;Fang 等5 通过提取大米中 4 类蛋白，分析蛋白中硒的含量，发现硒主要存在于碱溶谷蛋白中。富硒大米中硒主要以硒代甲硫氨酸(SeMet)存在于蛋白链中6。为了认识富硒大米在体内体外所表现的活性机理，需要进一步明确富硒大米中含硒蛋白的具体组成。因此探讨富硒大米含硒蛋白组成，有利于进一步评价含硒蛋白的生物有效性及其功能研究。高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)联用技术在硒的形态分析上具有高分离效率、高灵敏度等优点，被广泛用于金属组学研究中7 11。本研究通过水提、盐提、醇提和碱提方法提取富

5、硒大米蛋白，建立 SEC-HPLC-ICP-MS 联用技术方法。以 4 类蛋白为研究对象，分析富硒大米蛋白中含硒蛋白的组成情况。2实验部分2 1仪器、试剂与材料Sorvall RC-5B 高速冷冻离心机(美国 Dupont 公司);Turbo Vap LV 氮吹仪(美国 Zymark 公司);微波消解系统(美国 CEM 公司);7500ce 型 ICP-MS(美国 Agilent 公司)，包括自动进样器(I-AS)、微型同心雾化器、Scott 双通道雾化室(2)、屏蔽炬管、7500ce 透镜组和八极杆碰撞池反应系统;1100 型高效液相色谱系统(美国 Agilent 公司)。牛 球蛋白(158

6、 kDa)、鸡卵清蛋白(44 kDa)、马肌红蛋白(17 kDa)、细胞色素 C(12 5 kDa)、抑肽酶(6 5 kDa)、维生素 B12(1 35 kDa)、(Gly)6(0 36 kDa)和(Gly)3(0 189 kDa)等分子量标样均购于美国 Sigma-Aldrich 公司。甲醇和乙腈(色谱纯)，HNO3(优级纯，68%);HCl(36%)、丙酮、正已烷、三羟甲第 41 卷2013 年 6 月分析化学(FENXI HUAXUE)研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry第 6 期882 887基氨基甲烷(Tris)，均为分析纯(美国 F

7、isher Scientific 公司)。实验用水为超纯水(18 2 M cm)。富硒大米样品的制备参考文献 6，分别取适量普通大米和富硒大米，50 烘干，过 80 目筛，制备米粉样品，作为含硒蛋白提取与分析的原料。2 2实验方法2 2 1大米中4 种蛋白的提取与纯化分别称取 5 g 干燥后的脱脂大米，在室温条件下，分别用50 mL水，5%NaCl，0 08 mol/L NaOH 和 70%乙醇溶液，磁力搅拌提取 3 次后，以 5000 r/min 离心 10 min，分别合并上清液。然后，分别在水溶蛋白液、盐溶蛋白液和碱溶蛋白液缓慢加入冰丙酮，使其浓度增至80%，在!4 冰箱中静置 12 h

8、 沉淀蛋白，然后以 5000 r/min 离心 15 min，弃去上清液。用氮吹仪吹干4 种蛋白上残余有机溶剂，得到纯化后的清蛋白、球蛋白、碱溶谷蛋白和醇溶谷蛋白。分别在丙酮沉淀前后测定蛋白液和蛋白中总 Se 含量，计算 Se 的回收率(蛋白液或蛋白中总 Se 含量与大米总 Se 含量的百分比)。另外，取适量 4 种蛋白，分别以超声波辅助溶解于 1 5 mL 30 mmol/L Tris-HCl 缓冲液(含有6 mol/L 尿素，pH 7 5)，蛋白溶解液用注射器经 0 45#m PVDF 膜(美国 Alltech 公司)过滤，经 SEC-HPLC-ICP-MS 上机分析。22 2总 Se 的

9、测定参考文献 12 的方法测定大米粉和大米蛋白的 Se 含量。称取 0 050 g 试样于10 mL CEM 玻璃消解管中，加入1 mL HNO3(65%)后，加上 Teflon 内衬盖密封，静置过夜，第二天开盖放气后密封，放置于 CEM 系统按消解程序消化之后，取出消解罐后，将澄清消化液转移至容量瓶中，定容至10 mL，同时做3 次平行，制备空白样品待测液，配制标准曲线溶液，用 ICP-MS 检测样液中 Se 含量。2 2 3SEC-HPLC-ICP-MS 色谱联用系统建立参照 SEC 色谱柱 Superdex Peptide 10-300 GL(7 0 1 kDa)和 Superdex 2

10、00 10-300 GL(10 600 kDa)厂商推荐分离条件(见表 1)，用分子量标样绘制色谱柱分子量标准曲线，选用检测波长210，254 和280 nm 分析。将优化好条件的 SEC-HPLC 色谱经DAD 检测器(=280 nm)，用 300 mm 0 25 mm i d PEEK 管连接 ICP-MS，同时打开 DAD 和 ICP-MS检测器，将制备好的蛋白液进样 SEC-HPLC-UV-ICP-MS 分析，采用安捷伦 MassHunter 软件操作联用系统，建立 Sequence 自动触发质谱信号，获得的数据由软件分析。具体的仪器参数见表 1。表 1HPLC-ICP-MS 仪器参数

11、Table 1Instrumental operating conditions for HPLC-ICP-MSICP-MSSEC-HPLC功率 Power1450 W冷却气流速 Plasma Ar flow15 0 L/min载气流速 Carrier Ar flow1 05 L/min同位素监测 Isotopes monitoredSe:77，78，80，82反应反应气体 Reaction gas3 5 L/min H2四极杆偏压 Quadrupole bias16 0 V八极偏压 Octopole bias18 0 V驻留时间Dwell time for each isotope01 sS

12、EC 色谱柱 1(7 kDa 01 kDa)Superdexpeptide 10-300GL(300 mm 10 mm i d，13#m)SEC 色谱柱 2(600 kDa 10 kDa)Superdex200 10-300GL(300 mm 10 mm i d，13#m)紫外波长 UV wavelength210，254，280 nm流动相 Mobile phase30 mmol/L Tris，pH 75流速 Flow rate05 mL/min进样体积 Injection volume100#L3结果与讨论3 1Se 在富硒大米蛋白中的分布根据蛋白质的溶解性的不同，分别用水、NaCl 溶液

13、，NaOH 和乙醇溶液为溶剂分离富硒大米中清蛋白、球蛋白、碱溶谷蛋白和醇溶蛋白，然后经丙酮沉淀，测量纯化后蛋白的 Se 含量，比较沉淀前后 Se 的回收率，结果见图 1。丙酮沉淀后，水提、盐提、碱提和醇提方法 Se 的回收率分别为 9 6%，16 8%、482%和 14 9%。通过沉淀纯化后，去除蛋白液中非蛋白硒化合物，蛋白纯度提高，但 Se 的回收率略有降低。从 Se 的回收率可以看出，纯化后的蛋白结合 Se 的量由大到小依次为碱溶谷蛋白 球蛋白 醇溶谷蛋白 清蛋白，含硒蛋白主要集中在碱溶谷蛋白中。已有研究表明，富硒大米中蛋白结合硒主要是 SeMet5，为了阐明 SeMet 在各种蛋白分子中

14、的结合形式和类型，需要对这 4 类蛋白做进一步研究。388第 6 期方 勇等:体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒蛋白组成图 1富硒大米不同含硒蛋白提取的硒回收率Fig 1Selenium recovery of Se-enriched rice using vari-ous extraction methods3 2富硒大米的 4 类蛋白中含硒蛋白的组成大米蛋白被摄入体内，必须通过消化道中的多种蛋白酶水解后，转化为氨基酸的形态才能被人体吸收。但生物代谢实验发现，摄入的蛋白质大部分以肽的形态被直接吸收，短肽的吸收速度比同一组成的氨基酸快13。本研究利用 SEC-UV-ICP-MS

15、 方法分析大米蛋白中 Se 形态，通过比较280 nm 紫外光下的蛋白色谱峰和 ICP-MS 测量78Se 得到的质谱图分析含硒蛋白或含硒多肽分子量。选用分子量标样细胞色素 C(12 5 kDa)、抑肽酶(6 5 kDa)、维生素B12(1 35 kDa)、(Gly)6和(Gly)3绘制 SEC 色谱柱Superdex Peptide 10-300 GL 的分子量标准曲线，其SEC 色谱图见图 2a。以保留时间(min)为横坐标，lgMW(kDa)为纵坐标，绘制标准曲线线性方程 y=!0 1071x+6 2908，相关系数 R2=0 9601，具有良好的线性关系。选用分子量标样牛 球蛋白(15

16、8 kDa)、鸡卵清蛋白(44 kDa)、马肌红蛋白(17 kDa)和维生素 B12(135 kDa)绘制 SEC 色谱柱 Superdex 200 10-300 GL 分子量标准曲线，相关 SEC 色谱图见图2b，获得的标准曲线线性方程为 y=!00846x+36357，相关系数 R2=09315，同样具有良好的线性关系。说明两根SEC 色谱柱分子量测量范围为0 1 600 kDa，适合测定富硒大米中含硒蛋白或含硒多肽的分子量分布。图 2混合分子量标准样品的 SEC-HPLC-UV 色谱图，(a:色谱柱 Superdex Peptide 10-300 GL;b:色谱柱 Superdex 20

17、0 10/300 GL)Fig 2SEC-HPLC-UV chromatograms of mix standards for molecular weight on SEC column SuperdexPeptide 10-300 GL(a)and on Superdex 200 10/300 GL(b)3 2 1清蛋白在 4 类蛋白中含硒蛋白分布与分子量时，将 HPLC 与 ICP-MS 联用，同时打开紫外(UV)和 ICP-MS 检测器，分别检测 280 nm 波长的光吸收强度和78Se 的响应值。图 3a 是富硒大米清蛋白中含硒蛋白的 SEC-HPLC-UV-ICP-MS 色谱图，在

18、 60 min 洗脱时间内，共有 4 个蛋白峰(，和)和5 个 Se 峰被洗脱。在高分子量区，Se 峰1 和 Se 峰2 分子量大于7 kDa，在280 nm 下同时有吸收，为含硒蛋白，但含硒量很低。硒主要集中在含硒峰 3，为含硒多肽，分子量为 0 889 kDa 左右。然而，微量的 Se 峰 4 和 Se 峰 5 在低分子量区，可能为游离出来的无机硒或小分子含硒肽。清蛋白为代谢活性蛋白，在发芽早期可迅速启动进行生理作用，其主要存在于稻米种子的表皮层和胚中，胚乳中含量较低，分子质量一般为 10 200 kDa。本研究中分子量大于 7 kDa 的清蛋白中含 Se 很低，说明清蛋白并不是Se 的主

19、要存在蛋白。3 2 2球蛋白图3b 是富硒大米球蛋白中含硒蛋白的 SEC-HPLC-UV-ICP-MS 色谱图，在洗脱时间内，共有 3 个蛋白峰(，和)和 4 个 Se 峰被洗脱。蛋白峰 I 和 Se 峰 1 的出峰时间存在差异，这可能与蛋白峰 I 和蛋白峰 II 在死体积附近形成叠加有关，导致 Se 峰出现较早。Se 主要集中在含 Se 峰 1，分子量大于 7 kDa，占总球蛋白硒的 65 8%。含硒多肽峰 2 分子量为 0 769 0 934 kDa，占总球蛋白硒的17 9%。微量的 Se 峰 3 和 Se 峰 4 在低分子量区，在 280 nm 处几乎无吸收，可能为游离出来的无机硒。48

20、8分 析 化 学第 41 卷与清蛋白一样，球蛋白也为代谢活性蛋白，胚乳中含量较低，是由单链组成的低分子质量蛋白质，分子质量一般为 16 130 kDa。球蛋白虽然不是胚乳中主要蛋白，但 Se 存在分子量大于 7 kDa 的球蛋白中，说明球蛋白为 Se 的主要存在蛋白之一。图 3富硒大米清蛋白(a)和球蛋白(b)的 SEC-HPLC-ICP-MS 色谱图(SEC 色谱柱 Superdex Peptide10 300 GL)Fig 3Chromatograms of albumin(a)and globulin(b)from Se-enriched rice on SEC column Super

21、dexPeptide 10 300 GL3 2 3醇溶蛋白图 4a 是富硒大米醇溶蛋白中含硒蛋白的 SEC-HPLC-UV-ICP-MS 色谱图，在洗脱时间内，共有 3 个蛋白峰(，和)，蛋白峰分子量大于 7 kDa，为主要蛋白，但是 Se 含量很低。同时，有 3 个 Se 峰被洗脱，Se 主要集中在低分子量区，Se 峰 2 分子量约为 0 893 kDa，在 280 nm 处无吸收，因此，可以推断该含 Se 多肽可能没有色氨酸和酪氨酸等发色基团。Se 峰 3 分子量为 0 251 kDa，在紫外 280 nm 下有弱吸收，可能为游离的低分子量含硒多肽。醇溶蛋白为大米胚乳中蛋白体(PB-)，分

22、子量为 7 12 kDa，因无法被胃蛋白酶降解，不能被人体所吸收利用，通常在排泄粪便中被检测到14。在蛋白硒的体外模拟生物有效性研究中，硒主要以SeMet 的形式存在于碱溶谷蛋白(蛋白体，PB-)肽链中，且易于人体吸收5。然而，在本研究中，Se几乎不存在于难被人体吸收的醇溶谷蛋白中。32 4碱溶谷蛋白Se 主要存在于碱溶性谷蛋白提取液中，获得富硒大米沉淀蛋白，但含硒蛋白和多肽的分子量和种类未知。图4b 是富硒大米碱溶谷蛋白中含硒蛋白的 SEC-HPLC-UV-ICP-MS 色谱图，在洗脱时间内，共有 4 个蛋白峰(，和)，蛋白峰主要集中在高分子量范围，蛋白峰。同时，有2 个 Se 峰被洗脱，其

23、中 Se 峰 1 在 280 nm 下同时有吸收，Se 主要集中在 Se 峰 1，分子量大于 7 kDa，96 3%的蛋白硒为大分子含硒蛋白。谷蛋白由多肽链彼此通过二硫键连接而成，分子质量为 19 90 kDa，甚至可达上百万，占大米蛋白的 70%90%。因此，含硒蛋白可能存在于大分子量蛋白中，需要用更大范围的 SEC 色谱柱(600 10 kDa)分离碱溶性含硒蛋白，测定其分子量。图 4富硒大米醇溶蛋白(a)和碱溶谷蛋白(b)的 SEC-HPLC-ICP-MS 色谱图(SEC 色谱柱 Superdex Peptide10 300 GL)Fig 4Chromatograms of prolam

24、in(a)and glutelin(b)from Se-enriched rice on SEC column Superdex Peptide10 300 GL588第 6 期方 勇等:体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒蛋白组成大米胚乳中碱溶性谷蛋白主要以大分子形式存在。为进一步测定大分子含硒蛋白的分子量，选用SEC 色谱柱(Superdex 200 10-300 GL)测定。图 5 同时比较普通大米与富硒大米碱溶性谷蛋白的 SEC-HPLC-UV-ICP-MS 色谱图。普通大米(图 5A)与富硒大米(图 5B)碱溶性谷蛋白分子量分布及色谱峰型基本相似，主要有 F1，F2和

25、F33 个蛋白峰，峰型相似，只有蛋白峰 F2稍有差异。普通大米 F2峰分成两个分子量相近的蛋白峰。从78Se 色谱图可见，普通大米未有发现硒峰，这可能与普通大米中硒含量低(0 049 mg/kg)有关，经过提取分离后，蛋白液中硒含量低，未能达到仪器的检出限。然而，富硒大米硒峰主要集在高分子量区，与 F1蛋白峰重叠，说明 F1为主要含 Se 蛋白。峰 F3虽在 280 nm 紫外下有吸收，但不含 Se。通过分子量标准曲线(y=!0 0846x+3 6357)测定蛋白分子量，含 Se 蛋白 F1分子量为199 8 kDa，硒峰 2 分子量为 4 547 kDa。然而，含 Se 蛋白 F1已经接近

26、SEC 色谱柱死体积被洗脱，分子量可能更大。因此，主要含 Se 谷蛋白可能是多肽链彼此通过二硫键连接而成，且二硫键作用很强，即便样品处理中加入 SDS 也难以拆开。研究表明，清蛋白和醇溶蛋白并不是硒的主要存在蛋白，Se 主要存在于分子量较大的碱溶谷蛋白和球蛋白中。其中，碱溶含硒蛋白为主要组分。这部分蛋白为大米蛋白体，其消化率较高，而富硒大米含硒蛋白的体内生物有效性需要进一步验证，这将为大米源含硒蛋白功能食品的开发提供理论依据。图 5普通大米(a)和富硒大米(b)碱溶谷蛋白的 SEC-HPLC-ICP-MS 色谱图Fig 5SEC-HPLC-ICP-MS chromatograms of glu

27、telin from regular rice(a)and Se-enriched rice(b)onSEC column Superdex 200 10 300 GL致 谢北美安捷伦金属组学研究中心(美国)Joseph A Caruso 教授提供 ICP-MS 等仪器，谨表衷心感谢。References1YAO Wei-Rong，LIU Chuan-Ning Science and Technology of Cereals，Oils and Foods，2000，8(6):37 40姚卫蓉，刘传宁 粮油食品科技，2000，8(6):37 402Rayman Margaret P The L

28、ancet，2012，379(9822):1256 12683LIU Qiong，PENG Zhen，LIANG Xue-Ying Spectroscopy and Spectral Analysis，2009，29(2):530 535刘 琼，彭 珍，梁雪莹 光谱学与光谱分析，2009，29(2):530 5354Xu J，Hu Q H J Agric Food Chem，2004，52(6):1759 17635Fang Y，Brittany C，Zhang Y F，Zhao L Y，Caruso Joseph A，Hu Q H J Agric Food Chem，2010，58(17):

29、9731 97386Fang Y，Zhang Y F，Brittany C，Chan Q L，Hu Q H，Caruso Joseph A J Anal Atom Spectrom，2009，24(12):1657 16647Hsieh Y J，Jiang S J J Agric Food Chem，2012，60(9):2083 20898ZHAO Yan-Fang，SHANG De-Rong，NING Jin-Song，ZHAI Yu-Xiu Chinese J Anal Chem，2012，40(5):681 686赵艳芳，尚德荣，宁劲松，翟毓秀 分析化学，2012，40(5):681

30、6869Chen B F，He M，Mao X J，Cui R，Pang D W，Hu B Talanta，2011，83(3):724 731688分 析 化 学第 41 卷10Li Y F，Chen C Y，Li B，Wang Q，Wang J X，Gao Y X，Zhao Y L，Chai Z F J Anal At Spectrom，2007，22(8):925 93011TIE Mei，FANG Yu-Zhi，SUN Tie-Biao，LI Chuang，FEI Jin-Yan，LI Hua-Wei，ZANG Shu-Liang Chem J ChineseUniversities，

31、2007，28(4):635 639铁 梅，方禹之，孙铁彪，李 闯，费金岩，李华为，臧树良 高等学校化学学报，2007，28(4):635 63912Oktay C，Yathavakilla Santha K V，Caruso Joseph A Talanta，2006，70(4):784 79013TANG Guo-Ying，DAI Jun，CAI Mu-Yi，YI Wei-Xue，GU Rui-Zeng Food and Fermentation Industries，2006，32(5):131 133汤国营，戴 军，蔡木易，易维学，谷瑞增 食品与发酵工业，2006，32(5):131

32、13314Resurreccion A P，Li X，Okita T W，Juliano B O Cereal Chem，1993，70(1):101 104Analysis of Component Se-containing Proteins in Se-enriched RiceUsing Size Exclusion Chromatography-InductivelyCoupled Plasma Mass SpectrometryFANG Yong，YANG Wen-Jian，MA Ning，TANG Xiao-Zhi，CHEN Xi，HU Qiu-Hui(Key Laborator

33、y of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province，College of Food Science and Engineering，Nanjing University of Finance and Economics，Nanjing 210046，China)AbstractThe component Se-containing proteins in Se-enriched rice were investigated using size exclusionchroma

34、tography-high performance liquid chromatography coupled with inductively coupled plasma massspectrometry(SEC-HPLC-ICP-MS)The selenium recoveries of water extraction，NaCl extraction，NaOHextraction and EtOH extraction after rice protein precipitation were 9 6%，16 8%，48 2%and 14 9%，respectively The amo

35、unt of purified protein binding Se was as following order:glutelin globulin albumin prolamin When the protein solutions were injected to SEC-HPLC-ICP-MS，with comparison of protein peaks(=280 nm)and Se peaks(78Se)，the molecular weights of four proteins were determined by molecularweight curves The re

36、sults showed that Se was mainly incorporated into glutelin and globulin higher than7 kDa，while albumin and prolamin were not the most protein binding Se in Se-enriched rice The molecularweight of major fraction F1in glutelin was 199 8 kDaKeywordsExclusion Chromatography;High performance liquid chrom

37、atography;Inductively coupledplasma mass spectrometry;Rice;Selenium-containing protein(Received 20 August 2012;accepted 8 October 2012櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫)化学化工物性数据手册 有机卷(增订版)化学化工物性数据手册 分为无机卷和有机卷，本书为有机卷，共 16 章。内容包括有机酸和酸酐、有机盐和有机碱、烷烃、烯烃、炔烃、芳烃、醇类、酚类、醚类、酮类、醛和醌、酯类、胺类、腈类、油类和燃料及其他有机物料。书号:9787122144508定价:198 0 元出版时间:2013 年 1 月开本:16化学工业出版社出版788第 6 期方 勇等:体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱分析富硒大米含硒蛋白组成