墨旱莲药材的高效液相指纹图谱及聚类分析.pdf

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1、收稿日期:2005 03 01作者简介:吴红霞(1976),女(汉族),湖北武汉人,硕士,主要从事药物分析工作,Tel.024 23986295,E mailevahisun 。文章编号:1006 2858(2006)02 0097 04墨旱莲药材的高效液相指纹图谱及聚类分析吴红霞,高晓霞,赵云丽,刘 涛,于治国(沈阳药科大学 药学院,辽宁 沈阳 110016)摘要:目的 建立墨旱莲药材的指纹图谱研究方法并进行聚类分析。方法 色谱柱:Betasil C18柱(250 mm 416 mm,5 Lm);流动相:体积分数为 1%的磷酸水溶液和体积分数为 1%的磷酸乙腈溶液,采用梯度洗脱;流速:110

2、 mL#min-1;检测波长:330 nm;柱温:30 e。结果 精密度与重复性试验中各共有峰的相对峰面积 RSD 小于 510%,根据聚类分析结果,可将墨旱莲药材分为合格品和非合格品 2 类,合格品产地为浙江、江西、广东、武汉、江苏(苏州)、江苏(南京)、湖南、辽宁、河北、山西、北京、上海、安徽、海南,非合格品产地为河南、吉林、福建、山东、陕西(西安)。结论 该指纹图谱研究及聚类分析方法可用于控制墨旱莲药材质量。关键词:墨旱莲;高效液相色谱法;指纹图谱;聚类分析;质量控制中图分类号:R 917;R 93115 文献标识码:A 中药墨旱莲又称旱莲草,系菊科鳢肠属植物鳢肠(Eclipta pro

3、strata L.)的地上干燥部分,是二至丸、天麻首乌片等的原料之一。我国各省区均有分布,主产于江苏、江西、浙江、广东等地。具有滋补肝肾、凉血止血之功效。在我国,墨旱莲主要用于治疗牙齿松动、须发早白、眩晕耳鸣、腰膝酸软、阴虚血热、吐血、咳血、尿血、血痢、崩漏下血、外伤出血 1。在印度等国家,墨旱莲已被广泛用作治疗肝硬化、肝炎及胆囊疾病2。墨旱莲中的化学成分包括三萜皂苷类、噻吩类、香草醚类及黄酮类等3。由于受产地、气候和生态环境的影响,不同产地墨旱莲药材的所含主要指标成分的差异较大,为了更全面的控制药材的质量,作者对19 个产地的墨旱莲药材进行了指纹图谱研究及聚类分析。1 仪器与材料LC 10A

4、D高效液相色谱仪(配有 LC 10ATvp输液泵、SPD 10Avp 可变波长紫外检测器、TA130 柱温箱、Anastar 色谱数据处理系统,日本岛津公司)。蟛蜞菊内酯(自制,纯度质量分数 98%,甲醇(色谱纯,康科德有限公司),水(重蒸水,自制)。墨旱莲药材,购于江苏、湖北、安徽、吉林、辽宁等19 个产地,经沈阳药科大学孙启时教授鉴定。2 方法与结果211 色谱条件选择色谱柱:Betasil C18柱(250 mm 416 mm,5 Lm);流动相 A:体积分数为 1%磷酸水溶液;流动相 B:体积分数为 1%的磷酸乙腈溶液(梯度洗脱时间及流动相比例:0 min:A 与 B 体积比为90B1

5、0;21 min:A 与 B 体积比为80B20;45 min:A与 B 体积比为 70B30;60 min:A 与 B 体积比为60B40);流速:110 mL#min-1;检测波长:330 nm;柱温:30 e;进样量:15 LL。理论塔板数以蟛蜞菊内酯计算不低于10 000。212 墨旱莲指纹图谱的绘制对照品溶液的制备:以蟛蜞菊内酯作为参照物。取蟛蜞菊内酯对照品适量,用甲醇稀释,制成质量浓度 30 mg#L-1的对照品溶液。供试品溶液的制备:精密称取过 900 Lm 筛的墨旱莲药材的粉末215 g,置250 mL锥形瓶中,加水100 mL 煎煮 2 次,每次2 h,冷却,过滤,合并滤液,

6、减压 浓缩至20 mL,加乙 醇60 mL,静置48 h,减压浓缩,回收乙醇,加水定容至50 mL,微孔滤膜过滤,即得。分别取对照品和供试品溶液15 LL,进样,蟛蜞菊内酯的色谱峰及广东、安徽、湖南三地的指纹图谱见图 1 4。第 23 卷 第 2 期2 0 0 6 年 2 月沈 阳 药 科 大 学 学 报Journal of Shenyang Pharmaceutical UniversityVol123 No12Feb.2006p197213 共有峰的确定根据 19 批供试品溶液 HPLC 图谱给出的参数,比较供试品图谱,其中 22 个峰是各批供试品所共有的,因此,确定这 22 个峰为 19

7、 个产地墨旱莲药材的共有峰。共有峰的峰号(相对保留时间):1(01046 01048)、2(01069 01072)、3(01165 01173)、4(01176 01183)、5(0118901198)、6(01247 01254)、7(01268 01277)、8(01334 01341)、9(01441 01444)、10(0145801461)、11(01480 01486)、12(01494 01499)、13(01529 01535)、14(01537 01545)、15(01562 01574)、16(01614 01618)、17(0164801652)、18(01666 01

8、682)、19(01704 01711)、20(01789 01794)、21(01830 01837)、22(1)。相对峰面积统计结果见表 1。214 指纹图谱重复性试验取供试品(辽宁)5 份,精密称定,按/2120条方法测得,各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 值分别为 011%111%、113%417%。215 指纹图谱精密度试验取供试品溶液(江苏南京),连续进样 5次,测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 值分别为 013%112%、016%311%。216 指纹图谱稳定性试验取供试品溶液(广东),分别在 0、2、4、6、8、12 h 进样,测得各共有峰的相对保留时间

9、和相对峰面积的 RSD 值均小于 510%。217 各产地药材指纹图谱的聚类分析对 19 个产地的墨旱莲作指纹图谱分析,获得包括蟛蜞菊内酯(22 号峰)的 22 个色谱峰,将各色谱峰相对于内参比峰的峰面积量化,得到 1922 阶原始数据矩阵,由软件 SPSS 作聚类分析,采用离差平方和法(Ward.s method),利用欧氏距离(Euclidean)作为样品的测度。聚类谱系图见图5。聚类分析将 19 个产地的墨旱莲药材分为两类,其中,浙江、江西、广东、武汉、江苏(苏州)、江苏(南京)、湖南、辽宁、河北、山西、北京、上海、安徽、海南的药材为合格品,列为 类;而河南、吉林、福建、山东、陕西(西安

10、)为墨旱莲的非主产地,出自这些产地的药材为非合格品,列为 类。3 讨论a1 色谱条件。采用等度洗脱,色谱峰分离度达不到要求,且出峰时间太长。因此,选择梯度洗98 沈 阳 药 科 大 学 学 报第 23卷Table 1 The relative area of the communal fingerprint peakAreaCommunal fingerprint peak1234567891011Zhejiang1129701241111000123301189019630191601809011290119101403Fujian217511119461030017320137651780

11、5155231555015120136711318Shanxi2117711038215560140601174213773130811683012620130701784Hubei0153501362116460129901445119321177021441012120116501595Beijing2152901219216590136101290213032122421087013120117001919Henan1177401663115600133101186114691129511764011350119101513Hunan016400108101764011260117601

12、6860179701965011360111201240Shanghai1110401526114940125701185113721131721041011330118701508Anhui2186101510219640142201421215783137831880014530126111408Jilin3417801016071817963141411383171034181706111296019821131011152Shandong231771510187186511257015876188071250716390011965Jiangxi51324212326190401590

13、0195261377613284121600148911290Liaoning0150801123015200105001030015120148511327012290105401101Nanjing0151001077015390110601052015200154201565010480113601295Xi.an2412432191212153821327019161114981115151111390021305Suzhou1121701589114930118901338114411132411411012920118601485Hebei218020149531454014630

14、1353312753176821108013770135401603Guangdong0147101104018830108701181017950192301639012200117301230Hainan1110201628117190113301536116141146911507014240123201095AreaCommunal fingerprint peak1213141516171819202122Zhejiang0136701213210110151811070016110109051149116090171211000Fujian115201103941718215056

15、17623168601954111995019543148011000Shanxi0163701240413911126731151213470132881148019692194411000Hubei0177501568317120190531745213110118831339014231102911000Beijing015150121321249016272184911831091512113651151611000Henan013940114821039018482134111386041702116802145311000Hunan0120101056211360140111043

16、016110110341487112261132711000Shanghai014660128321159017842101711353071488112942112711000Anhui0190201971214530188321438116542198371582114851169011000Jilin41111319531814217186019132812141903219634151616124011000Shandong11569410650117914167621755024114305161911000Jiangxi1112601523511872100281537515250

17、157081997018332144411000Liaoning010370102811067010211437019980121511145015240142811000Nanjing0104801036017110156001760014670179441389114121195011000Xi.an1196911631515352186191051513630148917159207107011000Suzhou015480123031465016252180411588021502018100144611000Hebei018320172831846111614132621599012

18、6471577110401142711000Guangdong0109901244217940122611634111510108931675019250126011000Hainan013760121781483014383154321277013276191711157013891100099第 2 期吴红霞等:墨旱莲药材的高效液相指纹图谱及聚类分析 Fig15 Hierarchical cluster analysis figure of Eclipta pros-trata L.脱。由于墨旱莲水溶性成分中多为酚性物质,加入一定比例的磷酸调节 pH 值来改善峰形及调整各峰的保留时间。曾经

19、考察了甲醇 水、乙腈 水、甲醇 乙腈 水等洗脱系统,结果乙腈 水梯度洗脱能满足要求,最终选择该洗脱系统。经二极管阵列检测器检测,在上述色谱条件下绘出三维图谱。从三维图谱中可以看出,在330 nm处检测,色谱响应较大,且基线平稳。因此选用 330 nm 作为检测波长。b1 供试品溶液制备。分别考察了用甲醇、体积分数为 50%、75%、95%的乙醇提取及水提醇沉等方法,结果水提醇沉法色谱峰峰形好,基线平稳,因此选用水提醇沉法。c1 参比峰。蟛蜞菊内酯是墨旱莲药材特征性成分,且是主要的有效成分,在指纹图谱中与其他峰的分离度在 210 以上,因此被选作参比峰。d1 指纹图谱。从聚类谱系图可以看出,各产

20、地的墨旱莲药材可分为 2 类。由相似度软件计算得出,类药材的相似度都在 0180 1100 之间,而 类药材的相似度在 0180 以下,由此得到了两种不同测度间的相互认证。用该法分析未知样品时,只需测得该样品的指纹图谱,计算未知样品与共有模式间的相似度,即可对样品进行分类鉴定和评价。参考文献:1 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部 Z.北京:化学工业出版社,2000.306.2 Singh B,Saxena A K,Chandan B K,et al.Hepatopro-tective effect of ethanolic extract of Eclipta alba on ex-p

21、erimental Liver damage in dats and mice J.Phy-totherapy Research,1993,7:154-156.3 汤海峰,赵越平,蒋永培.墨旱莲的研究概况 J.西北药学杂志,1999,14,(1):32-33.HPLC fingerprint of Eclipta prostrata L.and itshierarchical cluster analysisWU Hong-xia,GAO Xiao-xia,ZHAO Yun-li,LIU Tao,YU Zh-i guo(School of Pharmacy,Shenyang Pharmaceu

22、tical University,Shenyang 110016,China)Abstract:Objective T o establish fingerprint of Eclipta prostrata L.extract from 19 different producing ar-eas by RP-HPLC,and to get the result of grading by hierarchical cluster analysis,to establish the method forthe quality control of Eclipta Prostrata L.Met

23、hods The chromatographic conditions used are as follows:C18column(250 mm 416 mm,5 Lm);mobile phase:1%phosphate acid-water and 1%phosphate acid-ace-tonitrile,gradient elute;flow rate:110 mL#min-1;wavelength:330 nm and column temperature:30 e.Re-sults The RSD of precision and reproducibility were lowe

24、r than 510%.T he Eclipta prostrata L.from 19different areas could be divided into two grades through the results of hierarchical cluster analysis.Conclu-sionsT he fingerprint study and hierarchical cluster analysis method can be used for quality control of Eclip-ta prostrata L.Key words:Eclipta prostrata L.;HPLC;fingerprint;hierarchical cluster analysis;quality control100 沈 阳 药 科 大 学 学 报第 23卷