广藿香八氢番茄红素脱氢酶PcPDS1基因克隆和序列分析.pdf

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1、 2 4 4 6 煎 塾 i n e T r a d i t i o n a l a n d H e r b a l D r u g s 第4 4 卷 第 l 7 期 2 0 1 3 年9 月 广藿香八氢番茄红素脱氢酶 P c P DS 1基因克隆和序列分析 欧 阳蒲月 ，沈笑飞，1 广 东食 品药 品职业学院，2 中国科学 院武汉植物园，3 中国科学 院华南植物园，曾少华，广东 广州 湖北 武汉 广东 广州 王瑛，莫小路 51 05 20 43 00 74 51 06 50 药材与资源 摘要：目的 为 阐明广藿 香类胡 萝 卜 素代 谢途径，克 隆 了广 藿香 P o g o s t e m

2、 o n c a b l i n 八氢番 茄红素脱 氢酶(p h y t o e n e d e s a t u r a s e，P D S)基 因，并对其进行相关生物信息学分析。方法搜索本课题组建立的广藿香转 录组数据库，获得 P D S基 因全长序列，并设计全长引物进行 P C R验证；利用生物信息学软件对 P DS基因进行生物信息学分析。结果本研究获得的 广藿香P DS基因命名为 P c P DS 1(Ge n B a n k登录号为 K C8 5 4 4 0 9)，该基因全长 1 9 6 0个碱基，编码 5 6 9个氨基酸。基于生物 信息软件分析了P c P DS 1 基因编码蛋白的理

3、化特性。系统进化树分析结果表明，P c P DS 1 基因与黄龙胆 G8 t i“n l u t e a的 P D S 序列 同源性最高，与烟草 N i c o t i a n a t a b a c u m、番 薯 I p o mo e a b a t a t a s次之，与 自然进化关系保持致。结论成功克隆、分 析 了广藿香 P c P D S 1 基因。关键词：广藿香；八氢番茄红素脱氢酶；P c P DS 1 基因；基因克隆；生物信息学分析 中图分类号：R 2 8 2 1 2 文献标志码：A 文章编 号：0 2 5 3 2 6 7 0(2 0 1 3)1 7 2 4 4 6 0 7 Do

4、h 1 0 7 5 0 1 j i s s n 0 2 5 3 2 6 7 0 2 0 1 3 1 7 0 2 0 Cl o n i ng a nd s e q ue nc e a n a l y s i s o f ph y t o e ne d e s a t ur a s e g e ne i n Po go s t me n c a b l i n OUYANG P u y u e ，S HEN Xi a o f e i。，ZENG Sh a o h ua ，W ANG Yi ng ，M O Xi a o 1 u 1 Gu a n g d o n g F o o d a n d Dr

5、u g V o c a t i o n a l Co l l e g e，Gu a n g z h o u 5 1 0 5 2 0，Ch i n a 2 W u h a n Bo t a n i c a l Ga r d e n，Ch i n e s e Ac a d e my o f S c i e n c e s，W u h a n 4 3 0 0 7 4，Ch i n a 3 S o u t h Ch i n a Bo t a n i c a l Ga r d e n，C h i n e s e Ac a d e my o f S c i e n c e s，Gu a n g z h o

6、 u 5 1 0 6 5 0，Ch i n a Ab s t r a c t：Ob j e c t i v e I n o r d e r t o e l u c i d a t e t h e c a r o t e n o i d me t a b o l i c p a t h w a y i n P o g o s t e mo n c a b l i n，a p h y t o e n e d e s a t u r a s e(P DS)o f P c a b l i n(P c P DS 1)g e n e w a s c l o n e d a n d a n a l y z

7、e d b i o i n f o r ma t i c a l l y Me t h o d s T h e f u l l l e n g t h P D S g e n e s e q u e n c e wa s r e t r i e v e d f r o m t r a n s c r i p t o m i c d a t a b a s e o f P c a b l i n，t h e ful l l e n g t h p r i me r wa s d e s i g n e d f o r P CR v e r i f i c a t i o n，a n d P c

8、P DS1 g e n e wa s a n a l y z e d u s i n g s e v e r a l b i o i n for ma t i c a 1 s o f t wa r e s Re s u l t s P c P DS 1 f N C B I a c c e s s i o n KC 8 5 4 4 0 9)c o n t a i n e d 1 9 6 0 b p l e n g t h o f o p e n r e a d i n g fl a me (OR F)a n d e n c o d e d 5 6 9 a mi n o a c i d s p o

9、 s t u l a t e d Ad d i t i o n a l l y,t h e p h y s i c a l a n d c h e mi c a l p r o p e r t i e s o f P c P DS 1 c o d e d p r o t e i n w e r e a n a l y z e d b y b i o i n f o r ma t i c a l s o f t wa r e s P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s s h o we d t h a t P c P DS 1 wa s t i g h t

10、 l y c l u s t e r e d wi t h P DS g e n e s i n Ge n t i a n a l u t e a，Ni c o t i a n a t a b a c u m，a n d I po mo e a b a t a t a s，wh i c h i s c o n s i s t e n t t o t h e p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p o f s p e c i e sConc l us i on Pc PDS 1 i s s u c c e s s f u l l y c o

11、 l o n e d a n d mo l e c u l a r l y c h a r a c t e r i z e d Ke y w o r d s：P o g o s t e mo n c a b l i n(B l a n c o)B e n t h；p h y t o e n e d e s a t u r a s e；P c P DS 1 g e n e；g e n e c l o n i n g；b i o i n f o r ma t i c a l a n a l y s i s 广藿香P o g o s t e m o n c a b l i n(B l a n c o

12、)B e n t h 为唇 形科刺蕊草属植物，是 中国药典收录 的重要药 用植物之一，以全草入药。其味辛，性微温，归脾、胃、肺经，具有芳香化浊、开 胃止呕、发散表邪 的 功能。广藿香原产于菲律宾、马来西亚、印度等 国 家，白宋代传入我国已有千余年历史”，是藿香正 气丸(水)、抗病毒 口服液等中成药 以及大量医药、香料和化妆品等商品的主要原料。迄今为止，国内 外广藿香 的研究主要集中在化学成分分析、新化合 物筛选和相应化学成分的药理药效、药效成分与群 收稿 日期：2 0 1 3-0 4 一 O 7 基金项目：广东省科技厅粤港关键领域重点突破项 目(2 0 0 9 A 0 3 0 9 0 1 0

13、1)；广州市科技计划基础研究项 目(2 0 1 3 J 4 1 0 0 0 7 6)；广东食 药晶职业 学院课题(2 0 1 2 Y z 0 0 2)作者简介：欧阳蒲月(1 9 7 8 一)，女，湖南邵阳人，硕士，讲师，从事生物技术与药用植物资源研究。T e l：(0 2 0)2 8 8 5 4 9 3 5 E ma i l：o u y a n g p y g d y z y e d u e ll 通信作者莫小路T e l：(0 2 0)2 8 8 5 4 8 8 3 E ma i l：mo x l g d y z y e d u c n 中草焉Ch i n e s e T r a d i t

14、 i o n a l a n dHe r b a l D r u g s 第 4 4卷 第 1 7期 2 0 1 3年 9月 体遗传学之间的内在联系以及离体培养和植株再生 等方面 2-1 0 1。广藿香的功效成分主要 为萜类和黄酮 类化合物，而有关其萜类化合物的生物合成途径及 代谢调控方面的研究鲜有报道。类胡萝 卜 素是 自然界广泛存在 的一大类色素，是植物、藻类、光合细菌、蓝细菌等生物生存所必 不可少的，在光合作用中发挥作用。类胡萝 卜 素是 一些色素蛋 白复合体的必要组成成分_ l，具有抗癌 活性 1，同时也是赤霉素、脱落酸、维生素 A和动 物形态发生所需的类维生素 A复合物的前体。八 氢

15、番茄红素脱氢酶(p h y t o e n e d e s a t u r a s e，P DS)是 类胡萝 卜 素生物合成过程 中的一个 限速酶。对该基 因进行研究将有助于了解萜类化合物尤其是四萜化 合物的生物合成过程，为利用基因工程调控广藿香 药用成分的合成提供研究基础。至今，仅从杏、万 寿菊、甘薯 1 4-1 5 J 等少数植物中分离到该基因，而分 离、克隆广藿香 P DS基 因未见报道。因此，研究广 藿香 P DS编码基因的克隆，具有重要的科学理论价 值和实践应用价值。基于本研究组所得到的广藿香转录组数据，从 中挖掘出大量参与类胡萝 卜 素代谢相关基因信息。本实验对广藿香 的 P DS

16、基 因进行了克隆及生物信 息学分析，为阐明广藿香的类胡萝 卜 素生物合成途 径奠定基础。1 材料 本实验材料采 自于广东食品药品职业学院药用 植物 标本园广藿香栽培地。海南广藿香 P c a b B n (B l a n c o)B e n t h c v h a i n a n e n s&经广东省中药研究所 蔡岳文教授鉴定，展开幼叶及成熟黄褐色叶，迅速 放入装有液氮的保温瓶 中，后置于一 7 5冰箱保存 备 用。2 方法 2 1 总 RN A 的提 取 取-7 5 保存 的幼叶及 成熟叶，在 1 8 0 42 0 0 烘 烤过 的研钵 中用液氮将其充分研磨，迅速倒 入焦磷 酸二 乙酯(DE

17、 P C)处理过 的离心管中，待 液氮 挥发后，按 1 mL 1 0 0 mg材料加入适量的 T r i z o l(植物 R NA提取试剂 T I A NGE N DP 4 2 1)，混 匀，室温放置 1 0 mi n。向上清液 中加 0 2倍 T r i z o l 体积的三氯甲烷，并充分混匀，室温放置 3 5 rai n。4，1 2 0 0 0 r mi n离心 1 0 mi n，吸取上层水相至另 一离心管。向水相中加等体积的异丙醇，并充分混 匀后，室温放置 2 0 43 0 mi n。1 2 0 0 0 r mi n，4，离心 1 0 mi n，弃上清，并保留沉淀。加入 1 mL 7

18、5 乙醇(用 R Na s e f r e e d d H2 O配制)洗涤沉淀，5 0 0 0 r mi n，4，离心 3 mi n，倒 出液体，注意不要倒 出沉 淀。室温放置晾干，将沉淀溶解于 5 0 mL 的 R Na s e f r e e d d H 2 0中，反复吹打，混匀，充分溶解 R NA。电泳检测总 R NA 的质量，并用紫外分光光度计(N AN OD R O P 2 0 0 0 c)测定总 R N A的浓度和纯度。2 2 P c P DS基因全长的获得 2 2 1 第一链 c D NA 的合成初始反应体系的建 立：Ol i g o d T(2 0 p mo l t L，广州凯

19、基生物有限公司)2 ；R NA 1 0 g L(嫩 叶及老叶 R N A 各 5 g L)；d NT P mi x(2 5 g mo l L)2 g L；RNa s e f r e e d d H2 0 1 2 u L，将反应体系于 6 5变性 5 mi n，取出后置于冰上 1 mi n 以上，向初始反应体系中加入下列试剂：5 fi r s t s t r a n d缓冲液 8 u L；0 1 mo l L D T T 4 g L；S u p e r s c r i p t I I I 反转录酶(2 0 0 U g L)2 ，H2 0 2 g L，再将总反应体系于 4 2 5 0 mi n，7

20、 0 1 5 mi n，于 P C R仪上进行第一链 c D NA 的合成。反转录产 物 c D NA可在一 2 0保存。2 2 2 基因克隆反应体系：3 的第一链 c DN A(反 转录产物稀释 1 0 倍)为模板；2 5 L AP C R 缓冲液；2 正向及反向特异引物(1 0 m mo l L)：正向引物(P DS 1，5 -C C C C C T T T T C A A T G T G C T A A 3 )和反向 引物(P DS 2，5 T T C C A T GA A C C C T A T T T G GT C 一 3 )，0 2 5 g LL AT a qD NA聚合酶(大连宝

21、生物工程有 限 公司)；用无菌去离子水将体系补至 2 5 r t L。P C R反 应条件：9 4预变性 5 mi n；9 4 变性 3 0 s，5 7 退火 3 0 s，7 2延伸 2 mi n，3 0个循环；7 2延伸 1 0 mi n。取 P C R产物 5 ，用 1 琼脂糖电泳检测。2 2 3 P C R回收产物的纯化、连接、转化、克隆及 测序将上述 P C R产物割胶，使用 A x y g e n公司凝 胶 回收试剂盒过柱回收。回收程序依据试剂盒提供 方法进行。各取 4 5 回收产物，克隆到 P MD1 9 一 T 载体过夜连接。将连接产物转入 D H一 5 a大肠杆菌感 受态细胞，

22、经涂布培养，在氯苄抗性平板上进行 阳 性克隆筛选，各取 4 8个进行菌液 P C R验证，后 各取 2个阳性克隆进行双向测序(上海生工生物工 程有 限公司)。2 2 4 序列的生物信息学分析先将所测得的序列 在美 国国家生物技术信息中心(NC B I)数据库中进 行B L AS T 搜索，初步确定这些基 因的类别。使用 OR F F i n d e r(h t t p：w ww n c b i n l m n i h g o v p r o j e c t s 一 g o r ff)进行开放阅读框预测，然后进行 P c P DS基因 中草1 I5 C h i n e s e T r a d i

23、 t i o n a l a n d H e r b a l D r u g s 第 4 4 卷 第 l 7 期 2 0 1 3 年 9 月 2 4 5 1 二烯途径合成 的_ J。其 中，P DS是继八氢番茄红 素合成酶(P S Y)之后，类胡萝 卜素代 谢途径 中 第 2步关键酶；而且 P DS是类胡萝 卜 素合成途径限 速酶L 1 7 l。因此，克隆、研究 P DS基因功能，具有重 要的科学理论意义和商业应用价值。通过高通量测序技术结合生物信息学分析是快 速挖掘非模式药用植物药用成分合成相关基因的有 效手段 1 8-2 0 。目前，通过 4 5 4高通量测序技术中已 发现大量 的参与活性

24、成分合成及调控 的候选基因。目前 已知 的植物 P DS序列相似性较高，氨基酸残基 的个数为 5 5 0 6 0 0。广藿香 P c P DS 1 编码 5 6 9个氨 基酸，相对分子质量 6 3 7 1 1 0 ，与草莓、番红花 的 P DS基因相似L 2。J。基于 P DS基因利用 NJ 法构 建的 1 4个不同物种间的进化树表明 P c P DS 1 基因与 黄龙胆的 P DS序列同源性最高，与烟草、番薯次之，这与 自然进化关系保持一致。WO L F P S OR T预测结 果表明 P c P DS 1基 因最可能定位在叶绿体中，而萜 类 的代 谢中 ME P途径就是在质 体中进行 的

25、。因此，上述 预 测结 果 证 明 了本 研 究 中所 克 隆的 P c P DS 1 基 因的正确性。广藿香药效活性成分主要是倍半萜和单萜等萜 类化合物，但 目前 国内外对广藿香萜类生物合成途 径相关基 因的研究较少。本研究成功克隆了广藿香 萜类合成途径 中的关键酶基因P c P DS 1，并对其 测序及相关 的生物信息学进行分析。由于 P c P DS 1 是广藿香合成四萜类胡萝 卜 素化合物 的重要关键酶 基 因，因此构建 P c P DS 1 R NAi 干涉载体、遗传转化 广藿香，有可能阻断类胡萝 卜 素合成而提高倍半萜 和单萜类药效活性成分 的量。因此，利用本研究克 隆得到的 P

26、c P DS 1基因，为通过基因操作提高广藿 香药效活性成分的量奠定基础。参考文献 1 吴友根，郭巧生，郑焕强 广 藿香本草及引种历史考证 的研究 J 中国中药杂志，2 0 0 7，3 2(2 0)：2 1 1 4 2 1 1 7 【2 魏刚，符红，王淑英，等 G C MS法建立广藿香挥 发油指纹特征 图谱研 究 J】中成药，2 0 0 2，2 4(6)：90 9 4 3 B l a n k A F，S a n t a n a T C P S a n t o s P S，e t a 1 C h e mi c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h

27、 e e s s e n t i a l o i l f r o m p a t c h o u l i a c c e s s i o n s h a r v e s t e d o v e r f o u r s e a s o n s J n d C r o p Pr o d，2 0 1 1，3 4：8 3 1-8 3 7 4 Di n g W B，L i n L D，L i u M e t a 1 T wo n e w s e s q u i t e r p e n e g l y c o s i d e s f r o m P o g o s t e mo n c a b l i n

28、 J J 5 6 7 8 9 1 0】1 2 1 3】1 4 1 5 1 6 1 7】1 8 As i an Nat Pr odRe s，2 01 1，1 3：5 99 60 3 Hu L F j Li S P，Ca o H，e l a 1 GC M S fi n g e r p r i n t o f P o g o s t e m o n c a b l i n i n C h i n a J _ J P h a r m B i o me d A n a l，2 00 6，42：20 0 2 06 S u n d a r e s a n V，S i n g h S R，Mi s h r a

29、 A N，e t a 1 Co mp o s i t i o n a n d c o mp a r i s o n o f e s s e n t i a l o i l s o f Po g o s t e mo n c a b l i n (B l a n c o)B e n t h (P a t c h o u l i)a n d P o g o s t e mo n t r a v a n c o r i c u s B e d d v a r t r a v a n c o r i c u s J l J E s s e n t O i l Re s，20 09，2 1：2 2 0

30、2 22 Wu H Q，L i L，L i J，a 1 Ac a r i c i d a l a c t i v i t y o f DH E MH，d e r i v e d f r o m p a t c h o u l i o i l，a g a i n s t h o u s e d u s t mi t e，De r m a t o p h a g o i d e s f a r i n a e J C h e m P h a r m B u l l，2 0 1 2，6 0：1 78 1 8 2 Ki u c h i F，Ma t s u o K，I t o M，e t a 1 Ne

31、 w s e s q u i t e r p e n e h y d r o p e r o x i d e s wi t h t r y p a n o c i d a l a c t i v i t y fro m P o g o s t e m o n c a b l i n J C h e m P h a r m B u l l，2 0 0 4，5 2：1 49 5 1 49 6 Ki y oh a r a H，I c h i n o C，Ka wa mu r a e t a1 Pa t c h o ul i a l c o h o l：i n v i t r o d i r e c

32、t a n t i i n flu e n z a v i r u s s e s q u i t e r p e n e i n P o g o s t e m o n c a b l i n Be n t h J J Na t Me d,2 0 1 2，6 6：5 5 6 1 Ni y o g i K KP h o t o p r o t e c t i o n r e v i s i t e d：g e n e t i c a n d mo l e c u l a r a p p r o a c h e s J A n n u R e v P l a n t P h y s i o l

33、P l a n t M ol Bi o l，1 9 9 9，5 0：33 3-3 59 M os k a l e n ko，Ka r a Pe t ya nSt r uc t ur a l r o l e of c a r o t e n oi ds i n p h o t o s y n t h e t i c me mb r a n e s J Z N a t u rf o r s c h，1 9 9 6，5 1 c：7 63 771 Ge r s t e r HThe Po t e nt i a l r o l e o f l yc o pe n e f o r hu ma n h e

34、a l t h J J A m C o i l N u t r,1 9 9 7，1 6：1 0 9 1 2 6 Ar ms t r on g G Eu ba e t e r i a s ho w t he i r t rue c ol or s：g e ne t i e s o f c a o r t e n o i d p i g me n t b i o s y n t h e s i s fro m m i c r o b e s t o p a n t s J JB a c t，1 9 9 4，1 7 6：4 7 9 5-4 8 0 2 陈选阳甘薯 B 胡萝 素合成途径系列酶基因的克隆

35、 及相关研究 D】福州：福建农林大学，2 0 0 5 王 飞 甘 薯类 胡萝 卜素合 成相 关 基 因片 断的 克隆 D 北京：中国农业大学，2 0 0 5 L i c h t e n t h a l e r H K，S c h we n d e r J，Di s c h A，e t a 1 Bi os y nt he s i s of i s o pr e n oi ds i n h i g he r p l a n t c hl o r o pl a s t s p r o c e e d s v i a a me v a l o n a t e-i n d e p e n d e n t

36、 p a t h w a y J _ F E B S L e t t，1 9 9 7，4 0 0(3)：2 7 1 2 7 4 C h a mo v i t z D，S a n d ma n n G Hi r s c h b e r g J Mo l e c u l a r a n d b i o c h e mi c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f h e r b i c i d e r e s i s t a n t mu t a n t s o f c y a n o b a c t e r i a r e v e a l s t h a

37、t p h y t o e n e d e s a t u r a t i o n i s a r a t e l i mi t i n g s t e p i n c a r o t e n o i d b i o s y n t h e s i s J J B i o l C h e m，1 9 9 3，2 6 8(2 3)：1 7 3 4 8 1 7 3 5 3 S u n Y Z，Ni u Y L i e t a 1 Cl o n i n g a n d b i o i n f o r ma t i c s a n a l y s i s o f P q E R F 1 g e n e

38、 i n P a n a x q u i n q u e f o l i u s J A c t a Ph a r m S i n，2 0 1 1，4 6：1 0 0 8 1 01 4 2 45 2 1 9 2 0 2 1 2 2 1 1 Ch i n e s eT r a d i t i o n a l a n d He r b a l Dr u g s 第 4 4卷 第 1 7期 2 0 1 3年 9月 Luo H M，S un C，Su n Y Z，e t a 1 An a l ys i s o f t h e t r a ns c r i p t o me o f PaF l a x

39、n o t o gi n s e n g r o o t u nc o ve r s p u t a t i v e t fi t e r p e n e s a p o n i n b i o s y n t h e t i c g e n e s a n d g e n e t i c ma r k e r s J】B MC G e n o mi c s，2 0 1 1，1 2(S u p p l 5)：S 5 Li S un C，Lu o H M，e t a1Tr a ns c r i p t o me c h a r a c t e r i z a t i O n f lo r f v

40、 i a mi l t i o r r h i z a u s i n g 4 5 4 GS F L X J A c t a P h a r m ，2 0 1 0，4 5：5 2 4 5 2 9 白 洁 番红花(C r o c u s s a t i v u s)八氢番茄红素脱氢酶 C s P DS基 的克隆、表达及含西红花甙 资源植物 的研 究 D】成都：四川大学，2 0 0 3 李永 平草莓类胡萝 卜素合成相关基 因的克隆 D 福州：福建农林大学。2 0 0 9 2 3 Y u F N A，U t s u mi R Di v e r s i t y,r e g u l a t i o n，

41、a n d g e n e t i c m a n i p u l a t i o n o f p l a n t mo n o a n d s e s q u i t e r p e n o i d b i o s y n t h e s i s J J C e l l Mo l L if e S c i，2 0 0 9，6 6(1 8)：3 0 43 3 0 52 2 4 Ne w ma n J D，C h a p p e l l J I s o p r e n o i d b i o s y n t h e s i s i n pl a nt s：Ca r b on pa r t i t i o n i n g wi t h i n t h e c y t o pl a s mi c p a t h w a y J _ C r i t R e v B i o c h e m Mo l B i o l，1 9 9 9，3 4(2)：95 1 0 6 2 5 Go l d s t e i n J L，B r o wn M S R e g u l a t i o n o f t h e me v a l o n a t e p a t h wa y J N a t u r e，1 9 9 0，3 4 3(6 2 5 7)：4 2 5-4 3 0