活血化瘀法调节DEN肝癌大鼠相关基因的生物信息学分析.pdf

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1、活血化瘀法调节 肝癌大鼠相关基因的生物信息学分析卓少元，方肇勤，管冬元，吴中华，高必峰（广西中医药大学，广西 南宁 ；上海中医药大学，上海 ；科罗拉多大学医学院，美国丹佛 ）摘要：目的：研究活血化瘀法对 大鼠肝癌基因表达谱的影响，初步探讨活血化瘀治疗肝癌的分子机制。方法：利用 、和 等在线分析工具，对前期检测的活血化瘀法干预前后 大鼠肝癌基因表达谱变化进行生物信息学分析。结果：活血化瘀法调节的差异基因 个，包括上调表达 个和下调表达 个。这些差异基因表达产物主要位于细胞的胞外区域，及细胞突起和突触，主要涉及神经元分化、细胞组分形态、细胞黏附、钙离子结合等生物过程或分子功能；参与多条信号通路，但

2、主要与单核细胞的增殖和分化，及肝癌细胞上皮 间质转化（）相关。这些差异蛋白的相互作用主要集中在 个蛋白，其中被活血化瘀法下调的 和 在更为复杂的转录因子网络图谱中仍处于中心节点位置，结合文献挖掘发现它们在肝癌细胞中发挥了非常重要的作用。结论：活血化瘀法对 肝癌大鼠的治疗是多方位的，目前对活血化瘀药抗肿瘤的争议可能与具有很强的活跃基因表达的能力，引起一些基因或信号通路在肿瘤细胞中过度激活或抑制所致；和 基因可能是活血化瘀治疗肝癌的重要靶点，但针对 的干预要防止引起促癌 抑癌基因表达失衡。关键词：肝癌；活血化瘀治法；基因；生物信息学中图分类号：；文献标志码：文章编号：（），（，；，；，）：（），：

3、，：，：，：；收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）；广西中医药大学重点课题（）作者简介：卓少元（），男，河南南阳人，副教授，博士，研究方向：肝癌的中医药防治。通讯作者：方肇勤（），男，上海人，教授，博士研究生导师，研究方向：证的基础实验研究，：。原发性肝癌是我国高发的恶性肿瘤之一，中医药辨证论治在防治肝癌方面疗效肯定，并积累了丰富的临床经验。近年发展起来的基因芯片技术，显示了其在功能相关差异基因筛选方面的优越性，随着基因芯片这种高通量技术的应用，产生了海量的基因表达数据，这些数据极大地增强了对中医药防治肝癌机理的认识 。而如何深入挖掘和阐述隐藏在这些数据背后的生物学信息，已成为中医药防

4、治肝癌研究的一个主要焦点。生物信息学的兴起为相关研究带来了新的契机。因此，本研究利用生物信息学方法对活血化瘀法干预 （二乙基亚硝胺）肝癌大鼠后肝（含肝癌）组织基因表达谱数据进行分析，为中医药防治肝癌研究提供新的思路。辽宁中医杂志 年第 卷第 期DOI：10.13192/j.issn.1000-1719.2013.12.084 网络出版时间：2014-01-15 10:13网络出版地址：http:/ 材料与方法 材料本研究采用以往所检测的 组芯片数据（分别来源于正常组大鼠肝脏、模型组大鼠肝癌组织，及活血化瘀法干预后的大鼠肝癌组织）。该芯片实验采用雄性 大鼠，体重 ，随机分组，每组 只。除正常组外

5、，其它两组大鼠自由饮用 二乙基亚硝胺（）水溶液；活血化瘀组自造模 周后开始给药（活血化瘀药由柴胡、丹参、桃仁、赤芍等七味中药组成，剂量按成人公斤体重的 倍量）；至造模后第 周（模型组肝癌已形成），处死各组大鼠。采用 公司 试剂盒及其方法抽提肝（含肝癌）组织总 ，采用 试剂盒及其操作手册方法纯化 。采用 检测总 并确认的完整性，继而采用 芯片标记与杂交，（）扫描读取芯片信息。原始数据处理及差异表达基因筛选将芯片原始数据进行预处理后（包括背景校正、数据对数转换、归一化处理等），利用 网站数据分析中心 对芯片数据进行注释。差异表达基因的筛选条件为：示为上调表达，示为下调表达；并剔除其中正常、肝癌及活

6、血各组均小于芯片均值 的基因。活血化瘀法相关差异基因的 分析将筛选出的活血化瘀法相关差异表达基因（包括活血化瘀法上调和下调基因）转换成探针编号（）的文本格式，编号中间以 分隔；然后上传至 （：）在线分析工具，进行基因本体论（，）分析。活血化瘀法相关差异基因信号通路分析通过 （：）分析差异基因所在的通路，并利用超几何分布统计学方法分析通路结果，通过 值（）筛选有显著意义的目标通路 。活血化瘀法相关差异基因编码蛋白的相互作用分析利用 在线分析工具（：），分析差异基因表达蛋白间的相互作用；并利用 （：）进一步分析差异基因相互作用关系的网络调节。结果 活血化瘀法调节的差异基因 诱发大鼠肝癌后，肝（含肝

7、癌）组织上调基因 个（个为已知基因），下调 个（个为已知基因有）。筛选出活血化瘀法调节的差异表达基因共计 个，其中包括下调基因 个，上调基因 个；活血化瘀法逆转的肝癌基因共计 个，其中包括下调逆转 个（肝癌 正常 ，活血 肝癌 ），上调逆转 个（肝癌 正常 ，活血 肝癌 ）。由此可见，活血化瘀法抑制肝癌基因表达的能力要远低于其活跃肝癌基因表达的能力，但活血化瘀法上调表达的基因中，仅有一小部分是肝癌组织中选择性下调的基因。活血化瘀法相关差异基因的 分析 （，基因本体论）数据库将基因功能分为三大类：细胞组分（）、生物学过程（）和分子功能（）。将 个活血化瘀法调节的差异表达基因上传至 （剔除 个未知

8、基因，共识别 个基因），获得的各功能注释聚类（）以参数富集积分（，）进行筛选，每个聚类内的 术语按富集倍数（，）、（值）进行筛选，当 术语重叠时，以最高水平术语归类（如 ：和 ：均归类于 ：）。结果发现，这些差异基因表达产物在细胞的定位有一定倾向性，主要位于细胞的胞外区域，及细胞突起和突触；生物学过程主要涉及是神经元分化、细胞组分形态和细胞黏附，其次是表皮和和腺体的发育、机体一些管道的形成，及组织形态等；而其参与的分子功能则涉及最多的是钙离子的结合，涉及较少的蛋白激酶的抑制活性和核酸内切酶活性。具体结果见表 所示。表 活血化瘀法相关差异基因 分类（）分类基因数 值 细胞组分（）：生物学过程（）

9、：分子功能（）：，注：表中富集积分 越高，说明该组聚类内 术语包含的基因对相应注释所描述的功能越重要；值越小，相应 术语越有意义。活血化瘀法相关差异基因信号通路分析 是美国亚利桑那大学癌症中心建立的通路分析 网 络 平 台，可 根 据 三 大 公 用 的 通 路 数 据 库（、和 ），生成变化基因参与的通路，并用 精确概率检验；输出结果自动分为代谢通路和细胞调节通路两类。分析结果显示，差异表达基因在 数据库中可以找到 个，共参与了 条通路，其中有显著意义的信号通路有 条，全部参与细胞和调控过程通路（见表 ）。辽宁中医杂志 年第 卷第 期表 活血化瘀调节涉及的有显著意义通路通路值涉及的基因调节趋

10、势 、注：表示活血化瘀法对相关通路调节的整体趋势，“”示为上调，“”示为下调。值得注意的是，表 中各通路涉及的基因相对比较集中，结合 等文献资源深入挖掘分析，发现这些基因的功能主要表现在两个方面：参与单核细胞的增殖和分化。活血化瘀法可能通过上调与单核细胞增殖、分化相关的基因（如 、等），并上调与之相关的 信号途径 和 信号途径 ，及下调 信号途径 ，促进肝癌组织内单核细胞的增殖与分化；参与肝癌细胞上皮 间质转化（，）。同芯片检测 结 果 一 样，、等基因在肝癌或其它肿瘤组织中过度表达，参与肿瘤细胞的 过程，促进肿瘤的恶性增殖、浸润和转移；而活血化瘀法对它们有明显的下调作用（见表 ）。表 相关基

11、因在 大鼠肝癌中的表达及活血化瘀法的调节作用 正常组芯片读数肝癌组芯片读数活血组芯片读数肝癌上调倍数活血下调倍数 活血化瘀法相关差异基因编码蛋白相互作用网络 是由 、和 共同开发管理的、由已知和预测的相互作用蛋白汇集的相互作用数据库。图 活血组差异基因的蛋白 蛋白相互作用图 在线分析，该网络主要以 个基因的产物为中心（、瑏瑡 、瑏瑢 、瑏瑣 、瑏瑤 、瑏瑥 、瑏瑦 ）。从图 可以看出，活血化瘀法相关差异基因编码蛋白间的相互作用主要集中在 、等 个基因的表达产物（这些产物与其它 个蛋白存在相互作用关系），为此蛋白 蛋白相互作用网络的中心节点，删除这些节点蛋白后，可使网络结构完全崩溃；而其它蛋白间

12、的相互作用比较分散。为了更好地了解上述 个差异基因相互作用网络，将这些基因输入 在线工具进行分析，参数设置为：；。在线网络图谱可以清晰地显示其物理相关和转录因子相关关系，结果如图 所示，此图显示仍有 、等 个差异基因在更为复杂的转录因子网络图谱中依然可见其相关关系，其中 个差异基因（和 ）更是在中心节点位置。图 个差异基因相互作用关系的网络调节（分析）讨论活血化瘀法是目前中医临床防治肿瘤的常用治则之一。但是，随着对活血化瘀药治疗肿瘤基础和临床研究的深入，活血化瘀药能否抗肿瘤、尤其能否抗恶性肿瘤转移的研究结果出现了不一致，甚至截然相反 。在此，我们采用基因芯片检测和生物信息学分析的方法，从整体水

13、平探讨活血化瘀法对肝癌基因表达的影响。结果发现，同其它中医治法一样 ，活血化瘀法对 诱发肝癌过程中部分高表达基因有明显的下调作用。例如，通过下调 、等 相关基因在肝癌中的表达，活血化瘀法可能参与抑制肝癌细胞的恶性增殖、浸润和转移。但是，活血化瘀法抑制肝癌基因表达的能力要远低于其活跃肝癌基因表达的能力，在此过程中有许多基因开始上调表达。例如，单核细胞增殖和分化相关基因 、等，及参与其调节 信号途径和 信号途径相关基因；活血化瘀法可能通过对这些基因表达的上调，促进单核细胞的增殖与分化。值得注意的是，在此过程中被上调的 信号途径 和辽宁中医杂志 年第 卷第 期 信号 可能是一把“双刃剑”，其调节失衡

14、甚至可能促进肿瘤细胞增殖或转移。我们推测在活血化瘀药抗肿瘤研究中出现的一些不一致结果，可能与这种情况有相似之处。此外，本研究综合应用生物信息学工具筛选出 个与活血化瘀法相关的潜在基因 和 。其中，基因编码产物波形蛋白（）广泛分布于各种正常的间质细胞及中胚层来源的细胞中，是最稳定的细胞骨架成分中间纤维（，）的主要组成部分，在上皮细胞中表达是细胞发生上皮 间质转化（）主要特征之一。已被证实 波形蛋白在众多上皮来源的恶性肿瘤组织或癌细胞株中（包括肝癌、胰腺癌和大肠癌等消化道肿瘤，及前列腺癌、乳腺癌、中枢神经系统肿瘤、恶性黑色素瘤和肺癌等）过度表达，参与肿瘤细胞的快速生长、浸润和转移。通过裂解波形蛋白

15、是一些抗肿瘤药物（如 ）诱导肿瘤细胞凋亡的关键，正如 等所说“评估 或其类似物，及其他抗波形蛋白疗法在具有 特征肿瘤中的作用，都是值得关注的”。活血化瘀法对 基因的表达有明显下调作用，是否能够通过裂解波形蛋白而促进肝癌细胞凋亡有待进一步研究。而 基因编码 甲基四氢叶酸 高半胱氨酸甲基转移酶（），又称为甲硫氨酸合成酶（），在体内催化 甲基四氢叶酸向高半胱氨酸（，）转移甲基，合成甲硫氨酸，从而参与 腺苷甲硫氨酸（，）的再生循环。在正常肝细胞有抗凋亡作用，但在肝癌细胞中能选择性诱导 而促进凋亡 。是体内“活性甲基”的重要来源，活血化瘀法通过下调 基因表达，导致“活性甲基”再生障碍，可能是活血化瘀法能

16、够活跃肝癌基因表达的重要原因，但同时可能也导致了两个不同的结果：癌基因和细胞生长相关基因表达上调促进癌细胞增殖；抑癌基因和编码细胞黏附分子、生长调节因子等基因表达上调抑制癌细胞增殖 。总之，活血化瘀法对肝癌基因的表达有非常明显的调节作用，和 基因可能是其发挥作用的重要靶点。但是，由于活血化瘀法“行气活血”的特点，导致包括 基因，及 信号途径和 信号途径相关基因等编码蛋白在内的分子（或信号通路）在治疗过程中可能出现过度激活或抑制而促进肿瘤细胞增殖和转移的失衡状态。因此，如何防止这种失衡状态向促进肿瘤细胞增殖和转移方向偏移，更好地发挥活血化瘀药的治疗效果，将是今后关注的一个重点。参考文献 盛学仕，

17、方肇勤，管冬元，等 诱发大鼠肝癌过程中肝组织基因表达谱的演变 中国中医基础医学杂志，（）：管冬元，方肇勤，赵晓珍，等 活血理气法下调大鼠肝癌信号转导有关基因转录水平的筛选 辽宁中医杂志，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：王耀春 信号途径对小鼠骨髓单核来源树突状细胞和巨噬细胞分化发育的调控 第四军医大学博士学位论文，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：张海林，聂克 活血化瘀药对恶性肿瘤影响研究进展 山东中医药大学学报，（）：管冬元，方肇勤，赵晓珍，等 健脾理气法下调大鼠肝癌信号转导有关基因转录水平的筛选 辽宁中医杂志，（）：，（）：，（）：，；，（）：，（）：，（）：辽宁中医杂志 年第 卷第 期