采油微生物降解原油组分分离鉴定及代谢途径分析.pdf

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1、 Xian 采油微生物降解原油组分分离鉴定及代谢途径分析 侯兆伟1 金 锐 郭盟华 王 颖 王艳玲(大庆油田有限责任公司勘探开发研究院 黑龙江大庆 163712)摘要：摘要：开展了微生物采油菌株对烷烃和多环芳烃的降解实验，通过中间代谢物鉴定和同位素标记代谢物检测，确定了采油菌降解二十二烷代谢途径。判断采油微生物是以末端单加氧的形式代谢正二十二烷生成二十二烷醇，然后进一步氧化成酸，进入-氧化过程；同时根据中间物结构鉴定得到芴的降解存在两条代谢途径：一为 9 位两步单加氧反应生成 9-fluorenone，另一条代谢途径为 3,4 位双加氧，然后开环，经过连续两步氧化，然后氧化脱羧、氧化开环生成(

2、E)-3-(2-hydroxyphenyl)acrylic acid。阐明了多环芳烃氧化开环后产物进一步脱羧降解的过程为-氧化。通过对原油中烃类代谢途径的研究，为进一步深化微生物降解原油过程的机理，实现对降解过程的定量化控制奠定基础。关键词：关键词：生理生化特性；烷烃降解；多环芳烃降解；代谢产物 The analysis of isolation and identification of intermediates and metabolic pathway during microbial degradation of oil composition Hou Zhaowei Jin Rui

3、 Guo Menghua Wang Ying Wang Yanling (Daqing Oilfield Limited Company,PetroChina,Heilongjiang 163712,China)Abstract：From the degradation of alkane and polycyclic aromatic hydrocarbons，the metabolic pathway of docosane and fluorine,which degraded by microorganism were determined by identification of i

4、ntermediate metabolites and examination of isotope labeled metabolin.According to structural identification of intermediate,docosane was metabolized by microorganism in the form of terminal oxidation and generated docosanol,then further oxidized to acid,and underwent-oxidation process.According to s

5、tructural identification of intermediate,There were two metabolic pathways in Fluorene degradation:(1)9-fluorenone was generated by 9 site 2 step mono-oxygenation.(2)By 3,4-dioxygenase,open-loop,and continuous two-step oxidation,(E)-3-(2-hydroxyphenyl)acrylic acid was generated after oxidative decar

6、boxylation,oxidative ring cleavage reaction,in which polycyclic aromatic hydrocarbons were decarboxylation degradated by-oxidation.In this paper,The metabolic pathway of crude oil hydrocarbon was studied,this will be an important basis for further reseach on the mechanism of microbial degradation of

7、 crude oil,and the quantitative control of degradation processes.Key words：the physiological and biochemical characteristics；degradation of alkanes；degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons；catabolite.对烷烃生物降解的研究自 1941 年就开始了,关于微生物对石油烃尤其是正构烷烃和多环芳烃的代谢作用。最初，大部分研究工作都涉及底物与产物的相互关系，以及确定能够依赖石油烃生长的微生物种群

8、的多样性。大量的报道已经充分证实了烷烃底物与这种微生物氧化产物之间的关系1-6。石油微生物代谢石油化合物组分中间产物鉴定，揭示石油化合物的代谢途径对于微生物采油具有重要的指导意 作者简介:作者简介:侯兆伟，男，1975 年 10 月出生，大庆油田勘探开发研究院，主任工程师，高级工程师，主要从事微生物采油研究工作。联系地址：大庆油田勘探开发研究院采收率二室，E-Mail：。Xian 义。本文利用纯品化合物进行了中间产物分离、鉴定。建立了反应体系中中间产物的分离鉴定方法。并利用氢放射性同位素氘标记了正构烷烃（二十二烷）和多环芳烃（芴），通过 GC-MS 检测了代谢产物，对采油微生物降解原油烃过程进

9、行了分析。1 实验材料及方法 1.1 实验材料：1.1.1 菌株 DQ8，DQF 和 DQ4 1.1.2 培养基 KH2PO4 0.5 g/l，K2HPO4 4 g/l，NH4Cl 1 g/l，质量百分比为 1%的 CaCl2 2 ml/l，质量百分比为 10%的 MgCl26H2O 2 ml/l，质量百分比为 1%的 FeCl3 200 l/l，维生素混合液 200 l/l 的，离子混合液 5 l/l。121 条件下灭菌20 分钟。1.2 实验方法：1.2.1 菌株生理生化特性分析 生理生化实验：菌株生理生化鉴定参照常见细菌系统鉴定手册（东秀珠，蔡妙英编著，科学出版社，2001 年）介绍方法

10、和实验步骤进行。主要鉴定指标为：荧光、脓青素、甲基红、V-P、葡萄糖发酵、吲哚等。1.2.2 菌株对正构烷烃降解 将种子液接种无机盐培养基，分别添加 100 mg/l 正十四烷或者正二十二烷；接种后振荡培养，定时取样，加入 6 N HCl 调节 pH 小于 2，并用乙酸乙酯萃取；萃取物 GC 检测各种化合物浓度，以不接菌培养基作为对照。1.2.3 采油菌株对对芳烃的降解（1）休止体系反应：1.接种 DQ8 菌株于 LB 液体培养基中，振荡培养 12 h，离心收集菌体，并用 pH 8.0 的磷酸缓冲液洗两遍，调节 OD600nm=5，制备休止细胞；2.分别在休止细胞中加入 40 mg/l 的芴，

11、振荡反应；3.反应结束后，加入 6 N 的 HCl 调节 pH 小于 2，然后用乙酸乙酯（0.3 mM 2-羟基联苯醚作为内标）萃取 3 遍，合并有机相，N2 吹干后重溶于 1 ml 乙酸乙酯中，GC 检测各种化合物含量，同时以无菌和灭活菌体（休止细胞 115湿热灭菌 5 min）作为对照；4.按照降解反应相同的反应体系，加入不同浓度的 PAHs，利用乙酸乙酯（0.3 mM 2-羟基联苯醚作为内标）萃取，制作各种 PAH 的标准曲线。（2）生长体系反应：1.LB 液体培养基活化菌株，离心收集菌体，用 pH 8.0 的磷酸盐缓冲液洗两遍并重悬于此缓冲液中作为种子液；2.种子液接种无机盐培养基，添

12、加 40 mg/l 菲、荧蒽或者芘，混合 PAHs 反应中加入各 20 mg/l 的芴、菲、荧蒽和芘；3.接种后振荡培养，定时取样，加入 6 N HCl 调节 pH 小于 2，并用乙酸乙酯萃取；4.萃取物 GC 检测各种 PAH 化合物含量，生长体系以不接菌培养基作为对照。1.2.4 中间产物分离制备 反应结束后，样品用 6 N HCl 调节 pH 小于 2，在分液漏斗中用等体积乙酸乙酯萃取，重复萃取三次，合并有机相；上一步有机相用等体积氢氧化钠溶液（10 mM）反萃三遍，分别收集水相和有机相，有机相为中性代谢物，水相为酸性代谢物；上步反萃水相用 6 N HCl 调节 pH 小于 2，再用等体

13、积乙酸乙酯萃取 3 次，合并有机相，为酸性代谢 Xian 物；萃取物经真空减压蒸馏后加入 1 ml 乙酸乙酯重溶，中性样品直接 GC-MS 检测，酸性样品甲基化衍生后 GC-MS 检测。2 结果与讨论 2.1 采油菌生理生化特性研究 对降低原油粘度较好的 DQ8、QF、DQ4 生理生化特性进行了研究，根据常见细菌系统鉴定手册确定菌株 DQ8为铜绿假单胞菌；菌株为地衣芽孢杆菌。2.2 采油菌株降解正构烷烃能力研究 本实验利用纯品的正十四烷和正二十二烷分别作为唯一碳源进行了 DQ8 的生长降解实验，用以验证菌株 DQ8 降解正构烷烃的能力。经过 6 天的培养，经 GC 检测菌株 DQ8 在 2 天

14、几乎完全降解正十四烷，降解率达到 90以上，在第4 天完全降解正十四烷。相对正十四烷，正二十二烷的降解速率稍慢，2 天降解率接近 60，4 天降解率达到 90左右，6 天后完全降解正二十二烷。而未接菌对照正十四烷和正二十二烷没有明显的浓度变化（图 1）。本实验证实了菌株 DQ8 具有降解正十四烷和正二十二烷的能力，并且可以明显观察到菌株的生长，说明菌株可以利用中长链的正十四烷和长链的正二十二烷作为唯一碳源和能源生长。而正二十二烷的降解速率稍慢于正十四烷，这可能是与碳链的长度有关。有报道称长链的正构烷烃生物利用性比短链正构烷烃差。采油菌株对正二十二烷具有很好的降解能力，菌株 HT，4 天可以降解

15、 50 mg/l 的正二十二烷。经过 14 天的降解菌株 DQ4 也可以降解 70以上的正二十二烷（图 2）。2.3 采油菌株降解正二十二烷产物鉴定及代谢途径分析 通过 GC-MS 鉴定得到了三种产物，包括正二十二烷酸（图 3 A）、正十八烷酸（284 M+,71%,269 M+-CH3,4%,241 M+-CH2CH2CH3,93%,227 13%,213 15%,199 39%,185 40%,171 15%,157 19%,143 57%,129 20%,101 25%,87 79%,74 100%,55 48%,43 72%）（图 3 B）和正十六烷酸（256 M+,38%,227 M

16、+-CH2CH3,8%,213 M+-CH2CH2CH3,71%,199 25%,185 19%,171 17%,157 30%,143 55%,129 18%,101 30%,87 81%,74 100%,55 52%,43 62%）（图 3C）。0246020406080100Concentration of hydrocarbons(mg/l)Time(days)Docosane Tetrodecane Control of docosane Control of tetrodecane图 1 菌株 DQ8 降解正十四烷和正二十二烷 图 1 菌株 DQ8 降解正十四烷和正二十二烷 图 2

17、 菌株 HT、DQ4 降解正二十二烷 图 2 菌株 HT、DQ4 降解正二十二烷 Xian 可见菌株是通过末端单加氧酶开始第一步反应，在正构烷烃末端加羟基生成醇，然后在醇氧化酶作用下进一步氧化生成酸，然后进行-氧化每次脱掉两个碳生成乙酰辅酶 A，逐步完全降解（图 4）。2.4 采油微生物降解芳香烃（芴）中间产物鉴定及代谢途径分析 将采油微生物降解芴的中性样品进行质谱鉴定，得到以下几种中间代谢物（图 5），其中 A 为代谢底物芴的质谱结果，与数据库中标样质谱结果可以很好的吻合；B 为芴被降解开环后的产物，此产物在文献中已被报道，推测为芴双加氧后发生间位裂解，然后继续降解得到的产物；C 为芴 9

18、位碳原子发生单加氧产生的 9-芴；D 为 C 进一步氧化生成。可见在降解过程中包含两种氧化降解芴的途径（图 6）。A B C 图 3 菌株 HT 降解正二十二烷产物鉴定 A：正十六烷酸；B：正十八烷酸；C：正二十二烷酸图 3 菌株 HT 降解正二十二烷产物鉴定 A：正十六烷酸；B：正十八烷酸；C：正二十二烷酸 图 4 菌株 HT 降解正二十二烷途径图 4 菌株 HT 降解正二十二烷途径 Xian 图 5 芴降解中性代谢物质谱结果 图 5 芴降解中性代谢物质谱结果 将芴降解的酸性样品中检测到如下中间代谢物。其中 A 为芴 3，4 位双加氧后，开环产物进一步氧化的产物；B 是在样品中检测到的中间产

19、物，虽然谱库中没有给出结构，但是根据离子碎片峰推测为正十四烷酸；并且在样品中检测到了正十六烷酸（C），这可能是底物中含有的微量正十六烷被氧化生成的产物。由此可以推测菌株 DQ8 降解直链烷烃是通过末端氧化实现的。这三种中间物都是以甲基化衍生物的形式被检出的，可见对酸性、非极性样品在 GC 检测时由于难气化造成的困难可以通过此种衍生的方法解决。3 结论 1.对降低原油粘度较好的 DQ8、QF、DQ4 进行了生理生化特性分析，初步鉴定菌株 DQ8 为铜绿假单胞菌，QF 为地衣芽孢杆菌，DQ4 是为短短芽孢杆菌；2.利用纯品的正十四烷和正二十二烷分别作为唯一碳源进行了生长降解实验，结果表明菌株可以利

20、用中长链的正十四烷和长链的正二十二烷作为唯一碳源和能源生长，而正二十二烷的降解速率稍慢于正十四烷；3.确定了采油菌降解二十二烷的代谢途径。根据中间物结构鉴定得到了正二十二烷代谢的二十二烷酸、十八烷酸和十六烷酸。因此可以判断采油微生物是以末端单加氧的形式代谢正二十二烷生成二十二烷醇，然后进一步氧化成酸，然A AC CD DB 图 6 采油微生物代谢芴途径图 6 采油微生物代谢芴途径 Xian 后进入-氧化过程，通过采油菌对烷烃降解途径的研究，为进一步对降解过程的定量化控制奠定基础。4.开展了菌株对多环芳烃的降解实验。通过中间代谢物鉴定和同位素标记代谢物检测，确定了采油菌降解芴的代谢途径。根据中间

21、物结构鉴定得到芴的降解存在两条代谢途径：一为 9 位两步单加氧反应生成 9-fluorenone，另一条代谢途径为 3,4 位双加氧，然后开环，经过连续两步氧化，然后氧化脱羧、氧化开环生成(E)-3-(2-hydroxyphenyl)acrylic acid。阐明了多环芳烃氧化开环后产物进一步脱羧降解的过程为-氧化。参考文献 参考文献 1.Resnick,S.M.and Gibson,D.T.(1996)Regio-and stereospecific oxidation of fluorene,dibenzofuran,and dibenzothiophene by naphthalene

22、dioxygenase from Pseudomonas sp.Strain NCIB 9816-4.Appl Environ Microbiol 62:4073-4080.2 Richard,J.Y.and Vogel,T.M.(1999)Characterization of soil bacterial consortium capable of degrading diesel fuel.Int Biodeterior Biodegradation 44:93-100.3.Seo,J.,Keum,Y.,Hu,Y.,Lee,S.and Li,Q.X.(2006)Phenanthrene

23、degradation in Arthrobacter sp.P1-1:initial 1,2-,3,4-and 9,10-dioxygenation,and meta-and ortho-cleacages of naphthalene-1,2-dicarboxylic acid and hydroxyl naphthoic acids.Chemosphere 65:2388-2394.4.Sugiura,K.,Ishihara,M.,Shimauchi,T.and Harayama,S.(1997)Physiochemical properties and biodegradability

24、 of crude oil.Environ Sci Technol 31:45-51.5.van Beilen,J.B.,Panke,S.,Lucchini,S.,Franchini,A.G.,Rthlisberger,M.,and Witholt,B.(2001)Analysis of Pseudomonas putida alkane degradation gene clusters and flanking insertion sequences:evolution and regulation of the alk genes.Microbiology 147:1621-1630.6.Van Hamme,J.D.,Singh,A.,and Ward,O.P.(2003)Recent advances in petroleum microbiology.Microbiol Mol Biol Rev 67:503-549.7 Keum,Y.,Seo,J.,Hu,Y.,and Li,Q.X.(2006)Degradation pathways of phenanthrene by Sinorhizobium sp.C4.Appl Microbiol Biotechnol 71:935-941.