@@壳聚糖的抑菌活性分析及其抑菌机理的研究_荆迎军.pdf

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1、中国抗生素杂志2006年6月第13卷第6期文章编号:110 0一8869(2(0)6)06一0 361一05壳聚糖的抑菌活性分析及其抑菌机理的研究荆迎军郝友进渠晖单颖李德森杜荣蓦(南开大学生命科 学学院遗传工程研究室,天津30 00 7 1)摘要:制备1 0个分子量 的壳聚糖,对6种细菌作抑菌实验。抑 菌实验结果表明分子量在1 4.9一29 7.6k u的壳聚糖有很强的抑菌活性,此活性有随pH的降低而增加 的趋势,pH S.5时最低抑菌浓度为0.0 3%一0.0 6%,c a,、M扩可显著降低壳聚糖对革兰阴性菌的抑菌作用。壳聚糖的抑菌机理有可能影响细胞膜的通透性。对实验结果的方差分析表明,壳聚

2、糖的不同分子量、pH值和金属离子等外界因素都是壳聚糖抑菌活性的极显著影 响因素,但菌株本身才是壳聚糖抑菌活性大小 的最关键因素。关键词:壳聚糖;抑菌;机理中图分类号:Q6 36.1文献标识码:APr elimina rystud ie sonantiba cterialme chanismandanalysisofantibacteriala ctivit yofchitos ansJingYing一un,Ha oYo u一in,QuHui,Sha nYing,Li De一s en(e Gn etieEngine eirng肠boa rro砰,Colle罗of Lif eSeiene eof

3、Na nkaiUniv es r ity,andDuRo ng一qianT ian jin30 0071)ABSTRACTe Tnehito sanswithdif f er entmole e ularweightswe repr epa redandtheira ntiba ete riala etivitie swer eexam in edagainstsixbaete ria.Resultsshowedthatehitos an s(14.9一297.6ku)ha vesro rngerantiba etei ralaetivi-tie s.C hitos ansshowed hig

4、he rantibaete riala etivitie satlowpHvalu e.h Teminimuminhibito口e o n e e nta rtio nofehito s ansa rngedo f rm0.0 3%一0.06%.h Teantiba eteiralme eha nismofehiro s a n sm ightber elatedtothepeneta rtionme eha-nismoftheeellmembrane.Dif f ere ntmole e ula rweights,pHvalu ea ndio nea nsto rnglyaf f eetth

5、ea ntibaeteriala etivi-tie sofehito s a n s,butthetyPeofba eteriawa sthekeyef f eetingf aetor.K E YWORDSC hitosan;Antiba etei ral;Meeha nism壳聚糖是一种无毒性的天然高聚物,是甲壳素脱1.1实验材料乙酞基的产物。研究表明壳聚糖具有抑菌川、抗肿瘤2,1.1.1壳聚糖美国红蟹壳制得,分子量11 91.3k u,等生物活性,在医药领域有广阔的应用前景,是一种脱乙酞度9 0%。潜在的 良好的抗生素。但不同论文报道壳聚糖的抑菌1.1.2供试细菌革兰 阳性细菌有枯草芽抱

6、杆菌效果有所不同,一些研究表明高分子量壳聚糖的抑菌(Ba ci l lu s:u bi l t动ATCc 93 7 2,金黄色 葡萄 球菌活性强 于低分子量壳聚糖1 3,而另一些研究则相反“。(s ta Ph l ro c o ccu s。ue r。)ATcC2592 3,藤 黄 微 球菌本论文通过制备一系列分子量 的壳聚糖,研究不同分(Mi co rc oc col u te。)A TCC934;1革兰阴性细菌有大肠子量壳聚糖的抑菌活性及影响因素;并利用碱性磷酸埃 希菌(s Eh ce rich iac oi l)A TC C2592 2,铜绿 假单胞菌酶位于壁膜间隙和p一半乳糖昔酶位于细胞

7、膜内,不向(s Pe汕n I Da s na er卿o ns。)ATC C2 785 3和普通变形菌细胞外分泌的特点,测定细胞壁和细胞膜的通透性,(o r Pe tu s。妙i s r)A TC C49o2 7。对壳聚糖的抑菌机理进行初步研究,为壳聚糖在抗生1.2方法素药物方面的开发和利用及今后的临床应用做一些1.2.1壳聚糖的降解HZO:一乙酸体系51将壳聚糖基础研究工作。降解 为 一 系 列不同的粘均分子 量(Mw二109 1.3,1材料与方法496.1,297.6,198.4,145.5,9 9.2,7 4.4,4 5.6,14.9,收稿日期:20 0 5一12一10基金项目:天津市自然

8、科学基金资助项目(NO.03 36 04 9 1 1)。作者简介:荆迎军,男,生于197 4年,在读博士研究生。*通讯作者,E一mi a l:o ug re nee yo u.c om36 2壳聚糖的抑菌活性分析及其抑菌机理的研究荆迎军等6.g ku)。所有制备的壳聚糖均为粉末状,室 温 干燥保藏。将壳聚糖溶于浓度为0.5%(v/V)乙酸溶液中,制备成1%(详/V)溶液,壳聚糖溶液现用现 配。1.2.2壳聚糖抑菌活性的测定分别取6种菌株各3林l菌液(10,eFu/ml),加人到lomlLB培养基中,充分混匀,倒人中g cm平皿,水平 放置,凝固后4冰箱放置3 0mi n,然后使用3mm打孔器在

9、培养基上打孔,每孔加人待测壳聚糖溶液样品15闪,3 7培养1h 2,测定抑菌圈直径(含孔径),以抑菌圈直径的大小表示抑菌活性的大小,对照采用相应的溶剂。1.2.3不同分子量的壳聚糖的抑菌活性分析调 整壳聚糖溶液pHS.5,分别在每孔加人不同分子量的壳聚糖溶液各1 5闪,测定抑菌活性。采用 两 因素交叉分组实验,实验重复三次,线性统计模型为:、=卜十。i一J一),6,6二1,2,3x。k=;+。一J一l2,1 12,62,3其中A因素为不同分子量的壳聚糖(固定因素),B因素为不同菌株(随机因素),这是一混合模型,使用SAS软件(6.1 2版本)进行统计分析。1.2.4pH值对 抑菌活性的 影响用

10、0.l mo l/LNaOH或0.lmd/LHC I调整壳聚糖溶液的pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,测定抑菌活性。采用 三 因素交叉分组实验,实验重复三次,线性统计模型为:xok,=卜+。i+pJ+丫、+(ap)i j+(a丫)i、+=1,2=1,2l l6其中A因素为不同的金属离子(固定因素),B因素为不同菌株(随机因素),这是一混合模型,使用s As软件(6.1 2版本)进行统计分析。1.2.7细胞膜通 透性的测定将大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌分别接人LB培养基(加人1%乳糖作为酶诱导剂)37培养18h,4 0 00r/m in离心15min收集菌体,0.0 5mo l/

11、L磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤3次后重新悬浮,稀释细胞浓度为A6 0 0二0.2。加人壳聚糖溶液,使终浓度 为0.2 5%,调pH 5.5,37温育,定时取样,4000r/m in离心1smin,取上清测定碱性磷酸酶6,活性和 p一半乳糖昔酶 7 J活性。0.0 1个吸光度定义 为1个酶活单位。2结果与讨论2.1不 同分子量壳聚糖的抑菌活性不同分子量壳聚糖对测试的6株细菌的抑制作用见表l。从表1可以看出,抑菌活性随着壳聚糖分子量和菌株的不同而有所不同。分子量在1 4.9一29 7.6k u之间的壳聚糖有十分显著的抑菌能力。当分子量大于297.6ku或小于 1 4.gk u时,抑菌活性降低。对表

12、1中的数据进行方差分析的结果见表2。从方差分析的结果 可以看出,不同分子量 的壳聚糖、不同菌株的尸值均小于0.01,说明壳聚糖的分子量、菌株在抑菌作用上都是极显著因素。特别是分子量与菌株的交互作用也是极显著因素,该结果说明抑菌作用是由分子量与菌株共 同决定的,特定的菌株只有在特定的分子量下抑菌效果才最明显。由表1和表2可以归纳出以下结果:壳聚糖对大肠埃希菌的最佳抑菌分子量是6.9-1 48.sku,对变形菌的抑菌最佳 分子 量是1 4.9-1 98.4k u,对 铜绿假单胞菌的 最佳抑菌 分子 量 是1 4.9一19 8.k 4u,对金黄色葡萄球菌的最佳抑菌分子量是148.8一19 8.4k

13、u,对枯草芽抱杆菌的最佳抑菌分子量是 4 5.6一9 9.Zk u,对藤黄微球菌的最佳抑菌分子量是4 5.6一74.4ku。由此看出,为 了得到最佳的抑菌效果,不同菌株应该选择不同分子量 的壳聚糖。NO等3报道了壳聚糖对革兰 阳性菌的抑菌作用高于革兰阴性菌,与本实验结果有所不同。例如,从表1可 以看到壳聚糖对革兰 阴性的变形杆菌具有很强的抑制作用,但对革兰 阳性的枯草芽抱杆菌的抑制能力反而较弱。郑连英等8服道,对于革兰阴性菌,随壳聚糖分子量的减小,抑菌作用逐渐增强;对革兰 阳性菌正好相反。本结果提示,无论是革兰 阳性菌还是革兰阴性菌,3和上 爪匡S+丫Q其中A因素为不同pH值(固定因素),B因

14、素为不同菌株(随机因素),c因素为不同分子量(固定因素),这是一 混合模型,使用SAS软件(6.1 2版本)进行统计分析。1.2.5最 小抑菌浓度(MI C)将浓度为1%(w/闪的壳聚糖溶液加人到LB琼脂培养基中,使壳聚糖最终浓度分别为0.25%、0.12%、0.06%、0.0 3%,调pH5.5,倒平皿中。分别在LB琼脂培养基表面点加1少个试验菌,3 5培养1h 8,观察细菌生长情况。无菌生长时该琼脂平皿所含壳聚糖的浓度即为其MC I值。1.2.6金属 离子对抑菌活性的影响分别向浓度为1%的壳聚糖 溶液(分子量为9 9.Zku)中加人不同金 属离子(K+,Na,Ca,M扩,L i+),使离子

15、终浓度为0.1%(w/V),调pH 4.0进行抑菌活性检测。采用两因素交叉分组实验,实验重复三 次,线性 统计模型为:中国抗生素杂志2 006年6月第3 1卷第6期36 3表1不同分子量的壳聚糖的抑菌圈直径平均值(m m,n二3)菌株对照6.914.94 5.67 4.4猫均分子量(ku)9 9.2148.819 8.429 7.649 6.1109 1.3大肠埃希菌普通变形菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球 菌枯草芽抱杆 菌藤黄微球菌3.03.03.03.03.03.08.28.513.08.413.07.08.51287.08.512.87.08.513.06.98.013.06.85.55.08

16、.54.0404.04.012.07.012,06.812.57.09.07.07.11 15551 1.05.010.510.51 0.01 3.06.59.713.06.5958.012.06.01206.59.07.512.05.59.56.07.56.5表2不同分子量的壳聚糖的抑菌活性方差分析变差来源自由度平方和均方F值PrFA(分子量)1077 8,469 79 87 7.846 9 8 011.6 80.0 0 01B(菌株)51 13 2.5 5 6 822 2 6.51 13 6277 1.8 90.0 0 01AxB5 0333.2 12 6 36.6642581.5 50.

17、0()0l误差13210.786 670.0 8172总和1972 25 5.02 591壳聚糖的抑菌趋势基本一致。2.2pH值对壳聚糖抑菌活性 的影响pH值对壳聚糖的抑菌活性的影响实验结果见表3。从表3可以看出,壳聚糖的抑菌活性随pH值的降低而增高。方差分析表(表4)也可以看出,A因素(pH)是一个极显著影响因素,说明pH值对抑菌活性有重要影响。表4显示,由于AxB、AxC、BxC及AxBxC交互作用均为极显著因素,就使主效应变得/.、力。、重要 了。根据统计学原理,当交互作用与主 因素均为显著因素时,应考虑交互作用的影响,而不能只看主效应。从表3中也可以看出,一些菌株与不同分子量的组合不符

18、合随pH值降低抑菌活性增高这一变化规律。有些随pH值降低抑菌活性变化不大,例如,pH从4.5降到4.0时,分子量为1 4.gk u的壳聚糖对铜绿假单胞表3pH值对壳聚糖抑菌圈直径平均值(m m,n二3)PH菌株分子量(ku)0 0:气乙0一.二.且大肠埃希菌普通变形菌1 1.510.07.515.0铜绿假单胞菌14.99 9.24 9 6.114.99 9.249 6.114.99 9.249 6.114.99 9.249 6.11499 92496.11 4.99 9.24 9 6.111.310.59.018015.01 1.08O8.06.515.014010.57.89.58.5130

19、12.58.514.010.58.0756.07.013.513013.57.57.05.513.012.010.57.57.56.51 1.010.07.58.58.57.513.012.812.07.17.0551 1.512,5955.57.06.01 1.010.07.53.07,56.516.014012.0404.03.01 1.51 1.510.03.0553.000:、弓,.皿甘.人金黄色葡萄球菌枯草芽抱杆菌10.58.0藤黄微球菌8.57.012.510.07.51 1.59.07.5364壳聚糖的抑菌活性分析及其抑菌机理的研究荆迎军等表4pH值对壳聚糖抑菌活性影响的方差分析

20、变差来源自由度平方和均方F值(pH)B(菌株)c(分子量)AXBAxCBxCAxBKC误差总和3 66.5 9814819 8 1.407 41218.7 9 07 4 16 5.4 3 5 1921.82 9629671.5314840.7 37 0445.0 0t)02 8 1 1.32 96 391.6 49 5 37396281481 09.3 9 5 3703.27 17672 87 03715 3 151.018430.2 5 0 0028.0 115 85.1315.2913.092.6 8286 14.070.00010.0 0 010.00 090.00 0 10.01 8

21、50.0 0 0 10.00015 4,n UO U00 00/214O U6l,菌的抑菌活性没有改变;分子量为14.gk u和4%.Ik u的壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑菌活性也没有改变,甚 至有些菌株与分子量的组合随pH值降低,抑菌活性 也降低,例 如pH从4.5降到4.0时,分子 量 为14.g ku的壳聚糖对大肠埃希 菌和枯草芽抱杆菌的抑菌活性也有所降低。从方差分析得到的正确结论应该是,对于不同菌株,不同分子量的壳聚糖在不 同的pH值下抑菌效果不同。2.3壳聚糖 的最小抑菌浓度壳聚糖的最小抑菌浓度测定见表5。从表5可以看出,对于多数参测菌株,壳聚糖的最小抑菌浓度多在0.0 3%一0.0

22、6%(w/V)之间,说明壳聚糖的抑菌能力很 强;同时也看到最小抑菌浓度与细菌的种类相关,不同的细菌,最小抑菌浓度不同。大肠埃希菌的最小抑菌浓度较高,较其它四种菌株高2一4倍,表明壳聚糖对大肠埃希菌抑菌能力相对较低。不同分子量的壳聚糖最小抑菌浓度也不一样,14.9一29 7.6k u的壳聚糖最小抑菌浓度相对较低,这与此分子量段的壳聚糖抑菌活性较高相一致。2.4金属离子对壳聚糖抑菌活性的影响金属离子对壳聚糖抑菌活性的影响结果见表6。从表6可以看出,金属离子可显著降低壳聚糖的抑菌活性,对革兰阴性菌的影响大于对革兰 阳性菌的影响。不 同金属离子影响的程度不 同,Ca,、M扩影响最大,显著降低了壳聚糖对

23、革兰 阴性菌的抑菌作用,特别是使壳聚糖完全失去 了对普通变形菌的抑菌能力,对大肠埃希菌的抑菌也有显著降低。方差分析(表7)结果可以看出,金属离子与菌株的交互作用是极显著因素,说明在不同金属离子的作用 下,壳聚糖对不同菌株的抑菌活性变化不 同。从表2、表4和表7三个方差分析表可以看出,菌株这一因素的F值都是最大的,说明无论是不同分子量对壳聚糖抑菌活性的影响还是pH值或是金属离子对壳聚糖抑菌活性的影响都受到菌株的制约。关于pH值对壳聚糖抑菌活性的影响,No等1 3 1认为原 因是 随着pH值的降低,壳聚糖分子所带正 电荷增加,导致了抑菌活性的增加。金属离子对壳聚糖抑菌活性的影响,有学者认为壳聚糖能

24、够鳌合金 属离子9,由于环境 中离子浓度的改变而影响了壳聚糖的抑菌活性。从我们的研究结果看,壳聚糖的抑菌活性的大小更主要取决于菌株本身,不同菌株细胞的特点不同,如膜电位和细胞膜通透性等不同,导致了不同壳聚糖分子量及不同pH值下壳聚糖的抑菌作用 不同。细胞外因素虽然很重要,但对壳聚糖的抑菌活性大小起关键作用的还是菌株细胞本身。2.5壳聚糖对细胞膜和细胞壁 通透性的影响表5壳聚糖的最小抑菌浓度(%)勃均分子量(ku)菌株6.914.945.67 4414 8.819 8.429 7.649 6.110 9 1.3大肠埃希菌普通变形菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌枯草芽抱杆菌藤黄微球菌0250.2 50

25、,2 50.2 50.250.250,250.120.1200 30.120,0 30.250.0 30.0 60.0 30.060.0 30120.030.0 60.0 30.0600 30.120.0 30.0 60.0 30,0 30.0 30.120.0 30.0 60.030.0 300 30.2 50.0 30.120.0 30.250.0 60.120.060.0 30.030.0 60.2 50.0 60.120.030.0 6O0 60.2 50.060.120.060.120.12中国抗 生素杂志2006年6月第3 1卷第6期表6金属离子对壳聚糖抑菌圈直径平均值(mm,n二

26、3)金属离子菌株对照MgZK奋Na令C扩奋MgZLi,K奋Na令Ca奋Mg艺 Li,大肠埃希菌普通变形菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌枯草芽抱杆菌藤黄微球菌1 0.51 5.08.014.09.512.59.07.58.011.09.510.59.08.08.01 109.510.57.53.06.51 1.59.010.58.03.06.01 2.59.511.510.08.57.51 159.5表7金属离子对壳聚糖抑 菌活性影响的方差分析变差来源自由度平方和均方F值A(分子量)B(菌株)AXB误差总和187.5 1851927 7.84193 12 0 5.9 35 8 471 3.5 8 3

27、3336 84.87 9 6 3037.503 7 0455.5683 868.9537320.1835 5 94.19302.7348.780.0 0 750.0 0010.0 0015气,J472,10l碱性磷酸酶位于细胞壁 和细胞膜之间,p一半乳糖昔酶位于细胞膜内,两者不分泌到细胞外,正常情况下在胞外不能检测到其活性。但当细胞壁或细胞膜遭到破坏后,透性增加,两者将泄漏到细胞外,通过检测细胞外两种酶的变化可以反映细胞壁和 细胞膜的透性变化6、7,。从图1和 图2可以看出,壳聚糖作用大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌6 0mi n后,溶液中碱性磷酸酶开始增多,反映壳聚糖对两种菌的细胞壁有了一定的作用

28、,且对金黄色葡萄球的作用 要快于大肠埃希菌。这一结果和前面的壳聚糖对金黄色葡萄球抑菌效果大于大肠埃希菌的结果一致。在作用h 2后,溶液中p一半乳糖昔酶开始增加,但增加的量并不大,推测壳聚糖对细胞膜仅有部分作用。该结果说明壳聚糖首先造成细胞壁通透性的增加,又进一步影响到了细胞膜的通透性。H e la nd e:等”,通过检测脂蛋白,发现壳聚糖对大肠埃希菌的细胞壁造成破坏。本研究结果显示,壳聚糖对细菌细胞壁与细胞膜都有一定的作用,使其通透性增加,造成细胞质物质外流,达到抑菌的效果。在这个过程中,壳聚糖不同分子量、pH值、金属离子等外界因素也起到重要的作用,造成不同分子量的壳聚糖在不同环境条件下对不

29、同菌株的抑菌效果不同,但菌株本身的内因是壳聚糖抑菌活性大小的关键因素。!110,户一l注Q0 0,了马理建华鬓之一吓升五匕屯一一一一一一二,_4_曰、n曰、门.4,J,J,4,三掣雌避督誉樱袋 5一,-,尸 甲0306 0901 2 01 5 01802102 4 0I(nl 一1)1:金黄色葡萄球菌;2:大肠埃希菌;3:金黄色葡萄球菌对照;4:大肠埃希菌对照图1壳聚糖对细菌细胞壁透性的影响0306 09012 0I(11 115)18021)24()1:金黄色葡萄球菌;2:大肠埃希菌;3:大肠埃希菌对照;4:金黄色葡萄球菌对照图2壳聚糖对细菌细胞膜透性的影响(下转第375页)环化酶抑制剂对三

30、抱布拉霉产生番茄红素的影响徐娜等537本,本实验还考察了废弃烟渣水提物(其中主要含烟碱)对番茄红素生物合成的影响。结果表明,当废弃烟渣水提物(浓度为19/Zoml水)的加人量为7 5ml/L时,番茄红素的产量可达16 0.3m g/L,而不加烟渣水提物,番茄红素的产量仅为1.4 2m g/L,增幅达11 0倍以上。我国卷烟行业每年都有大量废弃烟渣丢弃,将之应用与番茄红素生产,可起到变废为宝的作用。鉴 于环化酶在番茄红素代谢中的重要作用,通过诱变或基因敲除方法获得番茄红素环化酶缺失菌株,是今后研究工作的重点。致谢:本论文经顾觉奋教授 审校指导,在此表示衷心的感谢!参考文献川C linton5K.

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