江苏省水稻纹枯病菌遗传多样性分析与致病力研究_吴荷芳.pdf

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1、江苏农业学报(Jiangsu J of Agr Sci)，2013，29(1):51 59http:/www jsnyxb com吴荷芳，王晓宇，罗楚平，等 江苏省水稻纹枯病菌遗传多样性分析与致病力研究 J 江苏农业学报，2013，29(1):51-59doi:10 3969/j issn 1000-4440 2013 01 009江苏省水稻纹枯病菌遗传多样性分析与致病力研究吴荷芳1，2，王晓宇2，罗楚平2，陈志谊2(1 南京农业大学植物保护学院，江苏 南京 210095;2 江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏 南京 210014)收稿日期:2012-06-13基金项目:农业部公益性(农业)

2、行业科研项目(200803032)作者简介:吴荷芳(1986-)，女，安徽安庆人，硕士研究生，研究方向为植物病害生物防治。(Tel)025-84390230;(E-mail)bran-dy12590126 com通讯作者:陈志谊，(E-mail)chzy jaas ac cn摘要:通过 ISSR(简单序列重复区间)标记技术，针对 87 株水稻纹枯病菌菌株的遗传多样性进行了聚类分析。从 9 个随机引物中筛选出 3 个重复性好、特异性高的 ISSR 引物，PCR 扩增共产生 76 个 ISSR 分子标记，其中96 05%的片段具有多态性，表明水稻纹枯病菌菌株个体间存在较大的遗传变异，具有丰富的遗传

3、多样性。聚类分析结果显示测试菌株被分成了 7 个遗传聚类群，ISSR 遗传聚类组群的划分与菌株的地理来源有一定的相关性。菌株生长速率和致病力的测定结果表明，菌株的致病力差异与菌株来源、DNA 条带的多态性及遗传聚类群的划分并无明显相关，而与菌丝的生长速率存在中等程度的正相关性。研究结果对今后利用代表性菌株进行水稻抗纹枯病的种质资源筛选以及抗病品种的合理布局提供了参考。关键词:水稻;立枯丝核菌;聚类分析;致病力;ISSR中图分类号:S435 111 4+2文献标识码:A文章编号:1000-4440(2013)01-0051-09Genetic diversity and pathogenicit

4、y of Rhizoctonia solani isolates fromJiangsu ProvinceWU He-fang1，2，WANG Xiao-yu2，LUO Chu-ping2，CHEN Zhi-yi2(1 College of Plant Protection，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China;2 Institute of Plant Protection，Jiangsu Academy of AgriculturalSciences，Nanjing 210014，China)Abstract:Genetic

5、 diversity of eighty seven isolates of Rhizoctonia solani was investigated by ISSR(inter-simple se-quence repeat)technique，with 3 specific and stable primers selected from nine primers A total of 76 sites were genera-ted，among which 96 05%were polymorphic，indicating the high genetic diversity of the

6、se strains of Rhizoctonia solani Byclustering analysis，the isolates were classified into 7 ISSR groups，which were correlated with geographical origin of the i-solates The pathogenicities of the isolates were independent of the source of strains，polymorphisms of DNA bands and theISSR clustering group

7、s，however，they were positively correlated with growth rates of isolates These results will contributeto further study on the population of Rhizoctonia solani，and provide reference for the screening of the germplasm resourcesagainst rice sheath blight using representative strains and the reasonable l

8、ayout of the disease-resistant rice varietiesKey words:rice;Rhizoctonia solani;clustering analysis;pathogenicity;inter-simple sequence repeat水稻纹枯病是水稻上世界性三大病害之一，近年来随着矮秆品种和杂交稻的大面积推广，以及高肥密植栽培技术的运用，该病害的发生区域持续扩大，危害日益严重1-4，同时由于抗纹枯病水稻品种资源匮乏，造成该病防控困难5。目前该病在中国一些水稻产区已位居三大病害之首，是造成水稻生产严重损失的主要因素之一。水稻纹枯病病原菌为立枯丝核菌

9、(Rhizoctoniasolani Khn)，有性态为瓜亡革菌(Thanatephorus cu-cumeris(Frank)Domk)。该菌属土壤习居菌，主要15以菌核为初侵染源，在土壤中可存活 1 2 年，分布广，危害的寄主范围广泛，适应力强，因此防治相当困难6-7。对该病的防控，除使用井冈霉素外，传统的抗病育种方法也是有效方法之一。而了解一个地区病原菌的群体遗传信息结构特征及其变化规律，探寻病原菌的遗传多样性和致病型及其相关性，将为该病抗病育种及病害的预测预报提供重要的理论基础和应用依据。对水稻纹枯病菌的遗传多样性，目前国内外已有报道。Rosewich 等8 利用 RFLP 标记研究了

10、来自美国 Texas 地区182 个 R solani AG-1 IA 菌株，发现菌株间具有高度的遗传分化。周而勋等9 利用RAPD 标记对中国南方 6 个代表省(区)的 72 个水稻纹枯病菌菌株进行了聚类分析和致病力测定，发现供试菌株存在丰富的遗传多样性，DNA 条带的多态性与地理来源呈现明显的相关性，但与致病力的强弱无明显的相关性。陈涛等10 对浙江省 60 个水稻纹枯病菌菌株进行了 ITS 序列分析和致病力测定，同样发现系统发育树的结果显示菌株间呈现出高度的遗传分化。而在国内的研究中，利用 ISSR 技术对纹枯菌遗传多样性研究的报道尚为少见11。江苏省作为中国水稻主产区，随着农业产业结构

11、调整及现代农业的发展，水稻纹枯病菌种群遗传多样性发生了怎样的变化，其遗传变异是否与致病性有关等已成为迫切需要明确的问题。而近 20 年来，此方面相关研究尚未见报道。因此，我们采集了江苏省 6 个不同水稻产区的水稻纹枯病菌共 87 个菌株，对其进行了遗传多样性分析及致病力测定，以期了解不同地理来源的菌株亲缘关系的遗传结构及致病力分化情况，并试图寻找菌株 DNA 多态性与菌株致病力之间的关系，为今后利用代表性菌株进行水稻抗纹枯病的种质资源筛选，以及抗病品种的合理布局提供理论依据。1材料与方法1 1供试菌株2009 2010 年 6 10 月从江苏省 6 县市田间采集具有典型症状的水稻纹枯病病株样品

12、，采用周而勋的水琼脂快速分离法12，分离纯化得到 80 个水稻纹枯病菌菌株。其中 2009 年采集分离菌株 17株，2010 年采集分离菌株 63 株。6 县市(南京市，溧水县，徐州市，盐城市，南通市，苏州市)分别至少 10株菌株。另从江苏省宿迁市泗阳县采集分离 1 株菌株，从福建省厦门市田间采集的病株分离得到 6 株菌株，本实验室保存水稻纹枯病菌菌株 RH-2，共 87株菌株(见表 1)。对以上菌株进行 DNA 提取、IS-SR-PCR 扩增、以及菌丝生长速率和致病力的测定。表 1水稻纹枯病菌株采集地点和时间Table 1Sampling site and date of the strai

13、ns of Rhizoctonia solani菌株数量采集地点采集时间菌株数量采集地点采集时间N-1 N-99南京2009-07Nj01 Nj1313南京2010-07Xz-1 Xz-55徐州2009-09Xz01 Xz1515徐州2010-0909Ls1溧水2009-08Ls01 Ls099溧水2010-0809Sz1苏州2009-10Sz01 Sz099苏州2010-1009Nt1南通2009-10Nt01 Nt088南通2010-1009Sy1泗阳2009-10Yc01 Yc088盐城2010-10Fj01 Fj066福建2010-06Rh-21南京20001 2供试水稻品种选用江苏地

14、区主栽中感水稻品种金刚 30。1 3DNA 的提取用洁净接菌刀切取新培养的菌丝块，接种于装有 75 ml PS 液体培养基(马铃薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 ml)的 250 ml 三角瓶内，25，130 r/min摇培2 4 d，在菌核形成前用灭菌的接种钩针挑取菌丝，用灭菌滤纸挤压吸干。取100 200 mg 吸干的菌丝在灭菌的研钵中加入适量液氮研磨充分后转入 1.5ml Eppendorff 管中。采用 Transgen 吸附柱法 DNA 提取试剂盒进行基因组总 DNA 的提取。紫外分光光度法测定DNA 浓度和纯度(A280/A260，A280/A220)。最后存入20 冰箱储

15、存备用。PCR 反应均在同一台 PCR25江 苏 农 业 学 报2013 年 第 29 卷 第 1 期仪(BIO-RAD)上进行。反应以灭菌双蒸水代替模板 DNA 作阴性对照。1 4ISSR 反应体系14 1筛选 ISSR 引物从加拿大哥伦比亚大学设计的 100 个 ISSR 引物序列中(上海生工公司合成)挑选 9 条常用于真菌和植物的随机引物13。通过PCR 预试验，从中筛选出3 条重复性好、特异性高的引物(表 2)进行 ISSR-PCR 反应。1 4 2PCR 反应体系10 PCR buffer(含 2mmol/L MgCl2)2.5 l;150 mol/L dNTP 1.5 l;0.7

16、mol/L primer 0.5 l;1.5 U Ex-TaqTM(TaKa-Ra)1.0 l;纹枯病菌基因组 DNA 50.0 ng(对照反应以超纯水代替 DNA)，灭菌 ddH2O 补足反应体积至 25.0 l。1 4 3PCR 反应程序94 预变性4.0 min;94 变性 1.0 min;36 退火 1.0 min;72 延伸 1.5min;39 个循环;72 延伸 10.0 min。1 5谱带的记录与数据处理PCR 产物在 1 TAE 缓冲液 0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA(pH 8.0)中 经 1.0mg/ml 琼脂糖凝胶电泳，再经溴化乙锭(

17、EB)染色，用BIO-RAD 凝胶成像系统拍照。整体试验重复3 次。以 Trans 2K plus DNA ladder marker 为分子量标准，由同一引物扩增的电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，属于同一位点的产物14。针对在不同菌株中 PCR 扩增的多态性条带的出现情况，按DNA 条带的有无分别赋值 1 或 0 并进行统计，有条带(弱带或强带)的记作“1”，无条带的记作“0”。1 6生长速率(菌落生长直径)测定将病原菌移植到 PSA 培养基平板中间，25 保湿培养2 d 后，待菌丝接近长满平板，在 PSA 平板上菌落边缘用内径 7 mm 的打孔器打下菌丝块，挑取菌饼放置于新鲜无菌的

18、PSA 平板中央，于 26 恒温培养。1 2 d 内分别于 12 h、24 h、36 h、48 h 测量菌落直径(十字交叉法，扣除菌饼直径 0.7 cm)，并观察菌落颜色及形态。每个菌株设置重复 3 次，以 3 次重复的平均值为测定结果。整体试验重复 2次以校正。1 7致病力测定采用温室盆栽人工接种法分析各菌株的致病力。选用江苏地区主栽中感水稻品种金刚 30 为材料，选取生长情况一致的 5 叶期水稻苗移栽到盆钵中，每盆栽 3 穴，即 3 次重复，每穴 3 个单株，保持每盆的水肥条件一致。待水稻长到 2 3 个分蘖后，采用火柴梗嵌入接种法15，将带菌火柴梗嵌入各茎秆的倒三叶鞘内，分别接种 87

19、个待测菌株，每穴接种5 个茎秆，每盆接种一个菌株。保持稳定的温湿度，接种 15 d 后调查发病情况。病情调查方法:测量植株高度(土表至主茎最高叶叶尖的长度)，同步测量病斑高度(病斑拓展下界至最高病斑上界的长度)。单株病级=(病斑高度/植株高度)9 级，平均病级=(菌株测得的单株病级)/n，n 为调查发病茎秆数。以发病植株的平均病级作为该菌株的终致病力。病情分级:采用左示敏等16 修改的 0 9 级病情评价方法调查各接种植株病级。在水稻抗病育种研究中通常将抗性分为高抗、抗病、中抗、中感、感病和高感 6 个等级，在0 9 级病级划分系统中这 6 个抗性等级分别对应 6 个病级范围:0 级(完全不发

20、病)1 50 级、1 51 3 00 级、3 01 4 50 级、4 51 6 00 级、6 01 7 50级、7 51 9 00 级(整株非正常死亡)。根据上述 6 个病级范围，将菌株划分为弱、较弱、中等、较强、强、极强 6 个致病力等级。1 8数据分析在 Excel 软件上进行基础数据处理，利用唐启义等17 的 DPS v7 05 统计软件，对菌株致病力采用Duncan 氏新复极差法进行多重比较，完成差异显著性分析。运用 SPSS 17 0 软件，对菌株致病力与生长速率进行相关性分析。多态性条带赋值的数据构成 ISSR 表型数据矩阵，应用非加权配对算术平均法(UPGMA)进行聚类分析，采用

21、 NTSYS ps2 1 软件处理，建立个体间遗传关系聚类图。应用 PopGene 1 32 软件18 获得与遗传多样性相关的指数。2结果与分析2 1菌株 ISSR-PCR 扩增图谱及条带从 9 个 ISSR 引物中选出重复性好、特异性强的3 个引物对 87 个菌株进行 ISSR-PCR 分析，大部分引物扩增的位点数为 9 16 个，扩增的 DNA 片段大小在250 bp 至 3 000 bp 之间(图1)。3 个引物扩增后分别得到 27、26、23 个位点，其中各有 1 个为特征位点，即其多态性位点比率均达 95%以上，说明测35吴荷芳等:江苏省水稻纹枯病菌遗传多样性分析与致病力研究试菌株个

22、体间存在较大的遗传变异(序列及每引物扩增的 ISSR 条带数见表 2)。7 个地理种群 南京种群(Nj)、徐州种群(Xz)、南通种群(Nt)、苏州种群(Sz)、溧水种群(Ls)、盐城种群(Yc)和福建种群(Fj)的多态位点百分率在53.42%至 80.82%之间，平均多态位点百分率为67.39%。各地区种群多态位点百分率按由大到小的顺序为:Nj Xz Nt Sz Ls Fj Yc，具体见表5。表 2选用的 3 条随机引物的碱基序列及扩增结果Table 2ISSR primer sequences used in the study and the amplification resultsIS

23、SR 引物碱基序列(53)ISSR 条带数多态性条带数多态性位点数百分率(%)ISSR 3(IRN6)GAGAGAGAGAGAGAGATG27269630ISSR 5(P5)ATGTCGTCGTCGTCGTCGTCG26259615ISSR 7(UBC808)AGAGAGAGAGAGAGAGC23229565总计76739605a:Xz-5;b:Xz-4;c:Xz-3;d:Xz-2;e:Xz-1;f:09Sy;g:09Nt;h:09Sz;i:Rh-2;M:Trans 2K plus DNA ladder marker;j:Nj01;k:Nj02;l:Nj03;m:Nj04;n:Nj05;o:N

24、j06;p:Nj07;q:Nj08;r:Nj09;s:Nj11;t:Nj12;u:Nj13。图 1引物 IRN6 对部分水稻纹枯菌菌株的 ISSR-PCR 扩增结果Fig1Amplification results of some Rhizoctonia solani strainsby ISSR-PCR with primer IRN62 2聚类分析用 NTSYS 软件对扩增出的多态性条带构建个体间遗传关系 UPGMA 聚类树状图(图2)。利用 IS-SR 标记揭示的遗传相似系数对 7 个不同地理种群的水稻纹枯菌进行地理种群间遗传关系聚类分析。结果显示，在相似系数约 0.70 阈值下，聚类分

25、析可将它们分成 7 个遗传聚类群，这些水稻纹枯病菌间遗传相似系数在 0.52 至 0.97 之间，遗传距离系数在 0.05 至 0.92 之间。表明各菌株的遗传背景各不相同，存在一定的遗传分化。这 7 个遗传聚类群中，类群 1 4 包括了大部分菌株(75 株)。其中，在类群 1 中，盐城菌株中的 8株聚类在一起;南通菌株中的 6 株和溧水菌株中的9 株则是在类群 2 聚类在一起;在类群 3 中，聚类了苏州菌株中的 8 株;另外，在类群 2 中，23 株南京菌株中的 14 株，20 株徐州菌株中的 10 株，同一地方的大部分菌株也归为一类。以上结果显示，来源于同一地区的菌株基本各自可归为一类，相

26、似性较高。类群5 7 较特殊。其中，类群 5 包括南通的 2株菌株和溧水的 1 株菌株。类群 6 包括 1 株苏州菌株(09Sz)、对照菌株 RH-2 和福建厦门的 6 株菌株。类群7 仅包括苏州的1 株菌株。另外，泗阳菌株只有 1 株，与 7 株盐城菌株聚于一支，分布于分支 1 上。在相似系数 0 52 处，分为 2 类，其一包括类群1 5，其二则包括类群 6 与 7;在相似系数 0 60 左右，类 1 又可分为 3 分支，分支 1 包含类群 1、2、3，分支 2 包含类群 4，分支 3 包含类群 5;类 2 分为 2分支，分别对应类群 6 与 7。2 3水稻纹枯病菌遗传变异和遗传分化7 个

27、地理种群构成 ISSR 表型数据矩阵，输入PopGene 软件进行分析。统计下列参数:各种群的多态位点百分率(PPB)、平均每个位点的有效等位基因数(Ne)、Nei s 基因多样性信息指数(Ho)、Shannon 表型多样性信息指数(I)(表 3)，以及总的基因多样度(Ht)、种群内基因多样度(Hs)、种群间的基因多样度(Dst=Ht Hs)、种群基因分化系数(Gst=Dst/Ht)及基因流(Nm)等，反映不同种群的遗传变异情况。表 3 表明，7 个地理种群的平均多态性位点百分率(PPB)为 67.39%。Shannon 信息指数(I)可评价种群内和种群间遗传多样性的高低，指数越大，表45江

28、苏 农 业 学 报2013 年 第 29 卷 第 1 期图 287 株水稻纹枯病菌菌株 ISSR-PCR 指纹图谱分析所得 UPGMA 树状图Fig2Dendrogram constructed by UPGMA based on the molecular fingerprinting patterns of 87 strains of R solani55吴荷芳等:江苏省水稻纹枯病菌遗传多样性分析与致病力研究明种群的遗传多样性越高。本研究各种群的 I 值为0 296 8 0 420 1，平均为 0 302 3，具有较高的遗传多样性;种群间 Neis 多样性指数(Ho)反映了基因多样性和基因

29、的分化程度，本研究各种群的 Ho值为0 197 2 0 245 1，平均值为 0 223 1;有效等位基因数(Ne)为1 339 6 1 560 2，平均为1 426 5，存在着明显的遗传分化。以上 3 个指数由大到小的排列规律与多态位点的百分率变化规律是一致的。表 37 个水稻纹枯病病菌地理种群的遗传多样性Table 3Genetic diversity of 7 geographical populations of R solani种群多态位点数PPB(%)NeIHoNj5980 821560 20 420 10232 1Xz5676 711476 30 399 50229 2Nt557

30、5341462 20 396 10 226 1Sz5372 601451 10 379 30222 9Ls5068491428 90 365 20245 1Yc3953 421363 20 302 90206 3Fj(-Xm)4257531339 60 296 80197 2平均54 667391426 50 302 30223 1PPB:多态性位点数百分率;Ne:平均每个位点的有效等位基因数;基因多样性指数 I:Neis;Ho:Shannon 信息指数。Nj:南京种群;Xz:徐州种群;Nt:南通种群;Sz:苏州种群;Ls:溧水种群;Yc:盐城种群;Fj:福建种群。总的种群基因多样度(Ht)为

31、 0 391 6，种群内基因多样度(Hs)均值为 0 150 1，表明相同地理来源的菌株具有更近的亲缘关系;种群间的基因多样度(Dst)为 0 241 5，大于种群内多样度，表明种群具有较高的基因多样度;种群基因分化系数(Gst)平均值为 0 616 7(Gst 0.5，种群间的遗传分化明显)，说明江苏省不同县市水稻纹枯病菌种群间存在着明显的的遗传分化;基因流(Nm)为 0 121 9，说明种群间存在一定的基因流动。表明种群间具有较高的基因多样度，不同地理来源的亲缘关系较远。2 4病菌生长速率根据生长 24 h 的菌落直径，可以将 87 株菌株的生长速率分成 5 个群体 慢速(0 1.00 c

32、m)，较慢(1 01 2.00 cm)，中等(2 01 3.80 cm)，较快(3 81 5.10 cm)，快速(5 11 6.00 cm)，其中，10 株菌株的生长速率为快速，4 株菌株的生长速率为慢速。内参菌株 Rh-2 生长速率属快速类。福建的菌株属较快或中等。泗阳的 1 株菌株(09Sy)生长速率属快速。由表 4 可知，溧水、苏州、南通分别有 1 2 株菌株(09Ls、Sy09、Nt05、Nt06)生长速率为慢速的菌株;生长速率较慢菌株徐州地区的最多，达到生长速率较慢菌株的 66.67%(6 株);生长速率快速的菌株中，苏州、南通、盐城地区的较多，共 占 总 数 的75.00%(9 株

33、)。表 47 个地区水稻纹枯病菌菌株生长速率Table 4Growth rates of 7 geographical populations of R solani种群数目慢速较慢中等较快快速Nj230(0)3(1304%)12(5217%)6(2609%)2(870%)Ls101(1000%)0(0)4(4000%)5(5000%)0(0)Xz200(0)6(3000%)13(6500%)0(0)1(500%)Sz101(1000%)0(0)1(1000%)5(5000%)3(30 00%)Nt92(2222%)0(0)1(1111%)4(4444%)2(22 22%)Yc80(0)0(0

34、)1(1250%)3(3750%)4(50 00%)Fj60(0)0(0)5(8333%)1(1667%)0(0)总数864(460%)9(1034%)38(4368%)24(2759%)12(13 79%)种群见表 3 注。2 5病菌致病力水稻纹枯病菌各菌株之间存在不同程度的致病力差异，针对水稻纹枯病菌各菌株在水稻品种金刚30 上的平均病级，采用 Duncan 氏新复极差法进行差异显著性分析(表 5)。由表 6 可知，对水稻金刚 30 具有强及较强致病65江 苏 农 业 学 报2013 年 第 29 卷 第 1 期力的菌株共占 87 株的 32.18%。在水稻金刚 30 上表现致病力强的菌株

35、有 2 株，分布为:盐城 1 株(Yc04)，南通 1 株(Nt04)。表现致病力较强的菌株26 株，占总数的 29.89%，其中徐州地区的最多(10株，占 38.46%)，其 次 为 南 京 地 区 的(4 株，占15.39%)，再次是盐城、苏州、南通和溧水地区的(各有 3 株，分别占 11.54%)。表现弱致病力的菌株有 4 株，分别为 09Ls、Sz09、Nt05、Nt06，其中，2 株(Nt05、Nt06)未检测到对水稻金刚 30 具有致病力。表现较弱致病力的菌株6 株，分布为:南京的 2 株(Nj01、N-9)、徐州的 2 株(Xz10、Xz15)、苏州的 1 株(09Sz)、及福建

36、的 1 株(Fj01)。综上所述，致病力弱及较弱的菌株占总数的 6.90%。另外，内参菌株 Rh-2 属较强致病力菌株。泗阳的菌株仅 1 株，属中等致病力。福建地区菌株的致病力普遍中等，没有发现典型的强或弱类型，仅有 1株(Fj01)属较弱致病力型。2 6菌株生物学指标与遗传多样性相关性分析对 87 株菌株生长速率和致病力的相关性分析结果显示，相关系数为 0.507(P 0.01，相关性成立)，二者存在中等强度(相关系数0 4 0.6)的正相关性。线性回归方程为:Y=0 479 6x+1 606 6，R2=0 154 4(x 为致病力，Y 为生长速率)。菌株个体之间生长速率与致病力无明显相关性

37、，但从总体水平来看生长速率与致病力呈正相关，即生长速率快的群体致病力较强。表 5菌株盆栽致病力的差异Table 5Pathogenicities of the isolates of R solani in pot菌株平均病级005 显著水平001 极显著水平菌株平均病级005 显著水平001 极显著水平Yc046343 2 1229 0aA09Sy4132 5 1110 8jGNt046048 9 1722 2bBNj124067 6 0579 8jGYc065923 3 0705 8bcBFj043973 2 1121 1jGSz045848 7 1 248 6cBNj083954 6 0

38、793 1jGHNj025598 8 1134 5dCLs023906 9 1026 4jkGHXz-25520 2 1 027 2deCN-13839 6 0292 4jklGHXz015310 7 1223 2deCNj063761 7 0513 7klGHSz075281 5 0779 1deCDLs053698 4 0465 1lHYc075171 8 0 582 1efCDE09Nt3631 7 0409 7lHXz-35073 5 0 941 6fgCDEFNt073559 0 0611 3lHXz-45036 5 0 749 7fghDEFFj053453 1 0353 0lHX

39、z054977 8 0797 5ghiEFN-83427 6 0261 5lmHXz034882 0 1202 5hiFYc083302 5 1076 1lmHRh-24828 8 0888 0iFXz123236 3 0571 8mHXz044803 1 1004 2iFN-63235 3 0984 8mHLs074792 0 0799 0iFNj012961 1 1198 7nINj054679 7 0798 7ijFG09Sz2904 5 0748 4nIJNt014611 1 1046 0ijFGN-92721 1 0457 5oJLs034530 7 0663 8jFGFj01208

40、7 6 0603 0pKN-74509 8 0524 8jGSz091463 9 0295 9qLFj024413 3 1001 6jG09Ls1278 7 0187 8rMYc054355 4 0827 8jGNt050 0sNNj074234 3 0848 4jGNt060 0sN75吴荷芳等:江苏省水稻纹枯病菌遗传多样性分析与致病力研究表 67 个水稻纹枯病菌地理种群菌株致病力Table 6Pathogenicities of 7 geographical populations of R solani from种群数目弱较弱中等较强强Nj230(0)2(8 70%)17(7391%)4

41、(1539%)0(0)Ls101(1000%)0(0)6(6000%)3(3000%)0(0)Xz200(0)2(10 00%)8(4000%)10(5000%)0(0)Sz101(1000%)1(10 00%)5(5000%)3(3000%)0(0)Nt92(2222%)0(0)3(3333%)3(3333%)1(1111%)Yc80(0)0(0)4(5000%)3(3750%)1(1250%)Fj60(0)1(16 67%)5(8333%)0(0)0(0)总数864(460%)6(6 90%)49(5632%)26(2989%)2(230%)3讨 论遗传多样性分析多采用 RAPD、RFLP

42、、SSR 和ISSR 等分子标记技术8-9，15。本研究中，我们采用了 ISSR 技术，ISSR 分子标记是一种简单重复序列区间扩增多态性分子标记，具有重复性好、信息量大且多态性高等优点，因而是一种非常理想的检测物种内遗传变异的分子标记，已被广泛应用于遗传多样性分析和品种鉴定14、居群生物学研究19 以及物种的分类系统学比较20 等方面，同时也成为构建遗传图谱的有力工具21。而其中在遗传多样性方面多用于真核生物品种资源遗传多样性研究22，用于水稻纹枯病菌遗传多样性分析的尚为少见。本研究中，我们应用 ISSR 反应体系扩增出 76 条条带，多次重复试验均得到较好的多态性图谱。而在同时进行的 RA

43、PD 扩增中，多态性条带比例较少且重复试验的多态性图谱一致性稍差。表明本试验中 ISSR-PCR 反应体系具有较好的稳定性和重复性。因此，本研究选用 ISSR-PCR 扩增结果做了进一步的遗传多样性分析。本研 究 中 ISSR 标 记 多 态 位 点 百 分 率 为96.05%，说明测试水稻纹枯病菌株个体间存在较大的遗传变异，具有丰富的遗传多样性，不同地理种群间存在很大的遗传分化现象，这与先前学者认为纹枯病菌变异性较高的结论一致。如黄雯雯等23 对安徽省水稻纹枯病菌分析得到的 RAPD 指纹图谱片段的多态率在98%以上。Ciampi 等24 采用10 个微卫星位点(SSR)标记研究了来自巴西

44、5 个不同地区的 232 个 R solani AG-1 IA 菌株，同样发现菌株间有丰富的遗传多样性。从聚类分析结果来看，来自江苏省 6 个水稻产区的水稻纹枯病菌被分成了 7 个遗传聚类群。其中盐城的 8 株菌株、南通的 6 株菌株、溧水的 9 个菌株、苏州的 8 株菌株、南京的 14 株菌株和徐州的 10株菌株均分别聚类在了一起。这一结果说明这些地区的 ISSR 遗传聚类组群的划分与菌株的地理来源有明显的相关性，该结论与周而勋等9 对中国南方六省水稻纹枯病菌研究的结论是一致的。其中，南京和徐州地区的个别菌株聚类在了其他不同的 3 个类群，且这两个地区的多态性位点百分率较高，达76%以上，说

45、明该地区菌株具有更丰富的遗传多样性。其原因可能有二:一是南京位于江苏省中部，这种地理位置增加了它与其他邻近地方菌株的遗传信息交流，增加了菌株的变异频率，在长期与水稻的协同进化过程中，可能使菌株的进化速率加快;二是这两个地区种植的水稻品种多样性较高，采集地至少种植 6 个以上水稻品种25，且采集的纹枯病标样也是来自多个水稻品种。易润华等26 在对不同品种水稻纹枯病菌遗传多样性及致病力分化的研究中，指出不同寄主上的水稻纹枯病菌群体间发生了很大的遗传分化，这种遗传差异与寄主的选择作用有一定的 关 系。国 外 相 关 研 究 中，Rosewich 等8 用RFLP 标记研究了来自美国 Texas 地区

46、 6 个不同水稻生长区域的 182 个 R solani AG-1 IA 菌株，发现菌株间既有高度遗传多样性，又存在高度的基因流动现象。从聚类分析结果及致病力鉴定结果看，菌株的致病力差异与菌株来源、DNA 条带的多态性与遗传85江 苏 农 业 学 报2013 年 第 29 卷 第 1 期聚类群的划分并无明显相关。不同地理来源的种群中，其菌株致病力有强有弱。周而勋等9 对中国南方 6 个代表省(区)的 72 个水稻纹枯病菌菌株进行的 RAPD 聚类分析和致病力测定中发现，供试菌株存在丰富的遗传多样性，DNA 条带的多态性与地理来源呈现明显的相关性，但与致病力的强弱无明显的相关性。同样的结论存在于

47、易润华等26 对广东省 7 县市 48 个水稻纹枯病菌菌株进行的 RAPD 聚类分析和致病力研究中。参考文献:1洪剑鸣，童贤明 中国水稻病害及其防治M 上海:上海科学技术出版社，2006:56-62 2张国良 江苏省近几年水稻纹枯病重发生原因及防治策略 J 江苏农业科学，2012，40(9):116-118 3陈伟，钱建，程枫叶 南通地区水稻纹枯病的发生危害特点与综防技术J 江苏农业科学，2012，40(9):133-134 4孙以文，明亮，储西平 24%唑醇嘧菌酯悬乳剂防治水稻纹枯病效果 J 江苏农业科学，2012，40(7):131-132 5左示敏，张亚芳，陈宗祥，等 水稻抗纹枯病遗育种

48、研究进展 J 中国科学，2010，40(11):1014-1023 6黄江华，杨媚，周而勋，等 13 种植物丝核菌对水稻、甜玉米、黄瓜和甘蓝的交互致病性J 华中农业大学学报，2008，27(2):198-203 7GULERIA S，AGGARWAL R，THIND T S，et al Morphologicaland pathological variability in rice isolates of Rhizoctonia solaniand molecular analysis of their genetic variabilityJ J Phyto-pathol，2007，155

49、:654-661 8ROSEWICH U L，PETTYWAY R E，MCDONALD B A，et alHigh levels of gene flow and heterozygote excess characterize Rhi-zoctonia solani AG-1 IA Thanatephorus cucumeris(Frank)Domkfrom TexaJ Fungal Gene Biol，1999，28:148-159 9周而勋，曹菊香，杨媚，等 我国南方六省纹枯病菌遗传多样性的研究 J 南京农业大学学报，2002，25(3):36-40 10 陈涛，张震，柴荣耀，等 浙江

50、省水稻纹枯病菌的遗传分化与致病力研究J 中国水稻科学，2010，24(1):67-72 11 李挺丹，彭世文，王宗华，等 应用 ISSR-PCR 分析福建水稻纹枯菌的遗传多样性J 植物病理学报，2010，40(2):186-194 12 周而勋，杨媚 从植物病组织中分离立枯丝核菌的快速、简便技术 J 华南农业大学报，1998，19(2):125-126 13 MENZIES J G，BAKKEREN G，MATHESON F Use of inter sim-ple sequence repeats and amplified fragment length polymorphismsto a