_省略_aA基因5_调控区功能的体内分析_乔殿华.pdf

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1、微生物 学 报38(l):26一 31,199 8月ea t弃五erobioo g li caiSniea黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究且.A.ni ge rT2 1和.37 9 5ga l注基因5 调控区功能的体内分析乔殿华钟丽蝉唐国敏杨开宇(中国科学院微生物研究所北京1 00 0 80)摘要对糖化酶高产菌株注ng le r几1和原始菌株Ani ge r.379 5的ga lAS上游区的序列分析证明,两者在1.sk b的区域内有9个部 位的碱基不同。为考察这些碱基差异 是否是 引起几1ga lA基因转录水平提高的原因,构建了以几1和3.79 5ga lA基因转录调控区及几i nd ua ln

2、 st r PC基因终止子为表达元件的,oi l彻h基因表达载体(pxZ H和1灯H l),用px u和区泪1分别转化注ng le r几1,对两种转化子的HlllB抗性水平测定和So uh t em杂交分析显示,在转化子X 卜 巴C和GH IC中,p xZ H和区泪1以相同拷贝数(2拷贝串联)整合到 染色体】NA的相同位置上,XluC的 什11B抗性水平(300 0陀/而)为G H I C(l50 0协g/间)的2倍。这一结果表明,诱变引起的调控区序列改变使孔1岁aA基因转录调控区的功能水平比3.79 5提高1倍。关键词黑曲霉,糖化酶基因,转录调控区功能水平分类号09 3 3黑曲霉 C咬 邵,

3、e馆i l lu sog le r)几l是 通过诱变获得 的糖化酶高产菌株,其产量比原始菌株A.n心e r.37 95提 高1 0倍以上。前 文 曾报道2 T1菌体内糖化 酶mRN A的含 量为.3 79 5的4.3一.44倍,并证明这 一 差别与糖 化酶 基因(gl a刃的转录效率不 同有关川。通过对两 菌株gl aA上 游序列测定 发现,在一34 0一一1 505的范围内有9个部 位的碱基不 同2 l。为了进一步考察这些碱基的差异与转录效率之 间是否有对 应关系,对两者的功能进行了体内分析。在 丝状真 菌基因转录调 控区功 能分析中,通 常 是将 待 分析的序 列与报告基因(如 大肠杆 菌

4、。id A3 、l。才4、彻砂等)重组,构建表达 载体,转 入 适 当的丝状真菌,通过分析报告基因在 宿主中的表 达水平和 调控 特点以阐明 该序列 的功能。本 文以.E。0 11潮 霉素B磷酸转移酶(y Hgo rmyeinBphosphot ransf七ra se)基因(h Ph)为报告基因,以A.ni ge:孔l为宿 主,其表 型为潮霉素B抗性,转化子 抗性 强 弱与如h基因表达水平有关,可以籍此判断不 同序列在 调控 基因表 达 中的作用。11.11.1.1材 料和方法菌株、培养基、质粒、试剂和酶菌株:几nige r2 T1为 中国科学 院微生 物研究所糖化酶研究组经 多次诱变选育的糖

5、*国家自然科学基金和联合国教科文组织资助项目。收稿日期:19 96刃8刁3l期乔殿华等:黑 曲霉糖化酶基因表达调控的研究且.化酶高产菌株,3.79 5为其诱变 出发菌株。大肠杆菌Dlls和S3 K8 3为质粒转化受体菌 株。1.1.2培养基:查 氏斜面培养基(0.3%a NNO:,0.1%长P HO4,0.0 5%K CI,0.0 5%Mg S047巩0,.00 01%e FSO47毯0,3%蔗糖,1.5%琼脂粉,自然p H)用于A.oi ge r的菌种保存和活化培养。A.oi ge r液体培养基为:0.5%K HpO4,2%聚陈,6%可溶性淀粉,】%黄豆饼粉,自然pH。LL 3质粒:pUx

6、E与pUGp l分别为本实验室 克隆的A.ni ge rTZ I和3.79 5g laA基因5调控区片 段与ptJC19的重 组质粒。pDI33为D r.cu lle n惠赠。l.L 4试 剂 和 酶:氯化节 为 北 京 化 学 试 剂一厂 产品,a一2,l PdC开为u Do pn t公司产品,y Hgo rmc yi nB和牛肠碱性磷酸 醋酶(C I)P 为Bo ehi rg ne r公司产品,限 制性 内切 酶 为 中国医科院基础 所 友谊生 物制品公司及Po rme ga公司产品,4 TDNA连接酶 为友谊生物 制品公司产品,7 TDNA聚合酶测序殉t为Ph am ra ci a公 司

7、产品,Ta ql)NA聚合酶为 中国科学院遗传研究所产品,切刻平移 瓦t和4 TD NA聚合酶及 aa1iLn ke r为 r Pomg ea公司产品,两vozyme234为B iospa cii fc公 司产品,Cellula se-Rlo为Yaku ltpham ra ce ui tealIndust卿公司产品。1.2注.ni ge,的D NA转化参考沁n li6 和t知改】e尹8 等的方 法制备原 生质体。取.0 2司原生 质体(0.5一5.0 xl了/司),加人1一 2此DNA(2 0 闪),转化后与3而5 5保温的上层培养基(0.3%吻瀚,0.1%凡H珍落,.0 05 o o/K(1

8、,.0 05 0 0/城Sq7乓O,l o o/麦 芽糖,.0 8mo f/L蔗糖,0.7%琼脂,20 0随/耐F的IB)混和,铺于选择培养基平板(除1%琼脂外,同上层培养基)上,3 0培养1 0一1Zd oL 3月.n仓e r染色体D NA提取参照朱衡等的方法9 I J进 行。1.4o Suther n杂交分析参照文 献【10 的方法。1.5c PR扩增翅.n仓e rTZ I和.37 95ga l月基因5 调控区近上游区根 据A.nl se;T2 1与3.79 5ga l月基因5调控区序列圈,设计和合成 如 下 引物:p i rmerl:(一848)5CA汇CAGT TC CACCACAC

9、GTA3,(一827)pirmerZ:(一25)3A(汇汇兀汀C GTAGTA ATGTC凌iAS(一6)p CR反应(50,l):10 xBuf f er501,25m mol/LMgC125,l,Ani gerT Z I或3.7 9 5染色体l)NA Z 卜l(200一250ng),pirme rl(5 卜mol/L)5 林l,pi rmerZ(5协mol/L)5协l,dN T ps(2mmol/L/ea ch)5 卜l,去离子水23件l。94,5min预变性 后,加ZuTaqDNA聚合酶,随后 进 行3 0个循环 的扩 增 反应:变 性,9 44 05;退 火,5 850 5;延伸,7

10、260 5。最后 增 加延伸72o C0min。L 6DN A序 列分析采用Sa nge r双脱氧链终 止法。以双链质粒I)NA为 测序模板。2结果.21慈。仓e rTZ I和.3 795gl a月基因5 调控区引导转录的hh P基因表达载体的构建按图1所示分别构建了A.n心e rTZ I和3.79 59 1“A基因 5 调 控区(l.skb)引导转录 的28微生物学报38卷EC ORIU CP19Bam日X balPUEXorPU GPIk0 6bskbPgaA(1T 2or3.795)EC ORIBam 日ISalokbPst!H一nd日IEe oR1ClaxEC OR30kbpstl酶切

11、,T4DNA聚合酶切平L!nker、Ee oR连ClaI+C!al酶切C lal酶切.回收载体片段,脱PlEC ORIC!alC la1Sal lSallSa曰部分酶切,l K e now片段补平.连C!a比I nker,Clal+Ee oR I酶切EC ORIllO Z kb13 kbPB R32 2C C C la厂二3飞飞尹尹烹犷 C C C【a【一,_.匕匕COKI I I a bbx故C la0.3k bSaBamHIAC CTGACCI 红立T三工 旦AA A AAGPg A书6)匕一一卜hp h图1Rg.IT卜ee onstrl lci ton大肠杆菌彻h基因丝状真菌表达质粒pX

12、 扫 叹和口6H I的构建ofpla si mdsPXl lZa ndPG卜11f orh teexPe rssionofEe olih Phgen ein注n烤e rh Ph基因表达 载体X PZ H和口6日 1,表达 载体中的终止子 部分均使用A.i n血la n,tr Pc基因终止 子。由于在ga lA基因起始密码子 附近 没有 可资利用的限制酶位点,为了获得游离的ga lA基因 5 调 控区片段,采 用PCR扩 增办 法合成了ga lA基因 5 调 控区中与起始 密码子 毗邻的区域(一84 8一一6),因在一80 1处有一Ba mHI位点,故用Ba mHI酶切C PF1期乔殿华等:黑曲

13、霉糖化酶基因表达调控的研究且产物,然 后 与pUC19/Ba mHI+Hc nn载体片断连接,转化五c oi l感受态细胞,获 得重组质粒pCG PI,对其插人片断的DNA序列分析表 明,PCR扩 增未 引人任何碱基错误。2.2pX甩和pGHI对.ni ge r.T 2 1的转化预备实验表明,A.。i ge;TZ I对Hll lB敏感,最多只能耐受100协g/m lHlllB,因此可以作 为转化重组质 粒 的受体菌。A.nl ge r2 T1在培养1 7h左右 后,收集菌丝 体制备原 生质体。实 验表 明,菌丝体的分散好坏和 菌龄 长短是影 响原生质体数量和质量的 主要因素,提高 菌 丝体分散

14、程 度和尽量 缩 短培养 时 间,可以显著 增 加胞壁 酶 解 速度和胞壁破 除 完 全程度,并因此 提高原 生 质体的数量和质 量。本实 验 中原 生 质体数 量 约 为每0.5 9菌丝体(湿重)108个。用2林g左 右 的pXZ H和pGH I分别转化通.n仓erT Z I原生 质体(o.Zml,约108/ml),在 含2 00协g/mlHn rB的选择培养基上培养5 d以上,最高转化 频率 为4个 转化子/卜gDN A,而未经转化的原生质体在同样的选择培养基上未见任何生长。.2 3转化子的Hm B抗性水平随机选取X PZ H和闪HI的A.ni ge r2 T1转化子各7个(X印-AG,G

15、HI舟G),对它们 的H角B抗 性 水 平 进 行了测定和比较。将 各 转化子的抱子用牙 签 接 种于含不同浓 度Hll lB(100协g/ml一4000卜g/蒯)的查氏培 养基上,在30培养sd,以未 转 化的注.ni ger2 T1为对照,结 果列于表1。各 转化子的生长均 随 什11B浓度的增加 而逐渐 延缓,当HlllB达到一定 浓度后,生长即被完 全抑 制。除CH ID以外,闪Hl转 化子的Hll lB抗 性 水平普 遍低表lTablelA.ni ge rTZ I转化子的潮霉素B抗性水平测定h Tehy gromye 一 ns e n s 一i tvltyof几nl gerT ZIt

16、a rn sf om ra ns t转化子Ta rnsf onl lans t在不同浓度月 mB年g/ml)下的生长情况h Tegrowh tsa ti tonsunderdlf f ee rnte on centa ri ton sofl1115 0 0+()!,:+)2 0 0 0一+().一+1 5 0 0.+()()+.5 0010 00+(+)(+)+(+)4 00 0(+)n划、n+l+在+十、.于、r、.苦+十吸+,正常生长Nor malgr owh t;(+),生长被 明显抑制Inh j bit edgr owh t;一,没有生长Nogo rwh t。1期乔殿 华等:黑曲霉糖

17、化酶基因表达调控的研究1 1参考文献l【2【34【567【8910乔殿 华,唐国敏,钟丽蝉,等.微生物学报,1 99 7,37(5):34 9一3 54.钟丽掸,乔殿 华,唐国敏,等.微生物学报,1996,36(3):18 1一18 6.Rob er t s1N,o liv e rRP,u PntPJeral.u CrrGe n et,19 89,1 5:1 7 7一18 0Va n(玉c romRF从o Pu welsP城Go osenTetal.Gen e,19 85,40:99一106-L冶viesJ,Crit zL.Gene,19 8 3,2 5:1 79一18 8.Gi m.Ki l

18、ml lr ay,Haya5etal.月griciBolh Cem,1987,5 1:254 9一2 5 5 5Unk lesSE,Ca mPb ellEl,儿nghomJReral人穴FG,1989,2 18:9 9一104.Unk le sSE,Ca mPb ellEl,Ca爪2Deral.Ge ne,19 89,7 8:15 7一16 6朱衡,瞿峰,朱立煌,等.真菌学报,1 994,1 3:(l):3 4一4 0.Sa mbr oo kJ,i r Fc t shEEMa mi a tsT著(金冬雁等译).分子克隆.北京:科学出版社,199 2,47 4一491.R ESE A RC HO

19、NTH ER EGU L A T IONOFGLU COAMYL ASEGENE烤a l注)E X P R ESS ION州月.八尽6 ER1 1.ANA L YS I SOFTH EFUNCT ION0F5,一R EGULA TORYR EGIONOF通.八 注6E RT2 1AND3.79 5gl a月GENEqaonanhLlah ZongiLeha nTa ngGuo而nYa ngKaiyu(n Is厅扭e to fi Merobiolo舒乃eh Cin e s eAead e娜o f及ie n e e s,及i jing100080)Abstra etTwol Pa s而dveeo

20、ts rPXZ Ha ndPGH Iwee rc on stu rce tdthroughh tef usionof五eoli如hgene,h e te r钾r tgenea ndh tesupste ra me rgio n sof.Ani ge r亡la nd3.7 9 5e rsp eeitvely,a swella sh tee ti m rnao trof注nid ua lnst r PCgen e.h TePla smidve etos rwee rh ta nus edo ttra n sf om r注ni ge rZ TIo tf unci to na llyide nitf

21、yh tos ed if f ee rntba siegr oupsb ew te enh tew tosu Pse t ra me rgionse rs伪nsib lef orhig卜levelexPe rssionofh tega lAge n e.So uh e tma nalysisofw totr a llsf om ra ns tXZ HCa ndGH ICe rvea ledh tatX PZ Ha ndPGHIwee rine tga re tde rsp eeitvelyintoh teehr omo s omeatsa mesie twih tw toe oPiesina

22、tndemar ray.h Televele rsisa tnttoHmB(3000卜g/ml)ofXZ HCwa sw tic ea si hg ha sh tat(1500 卜g/ml)ofGH IC,indie ai tngh tath teeha ngesofba siego ruPsh to rughmua t i tone rsultinw tic ein ce ra seoff un cito n allevelofe rg ione rsp on siblef ort ra n seir Pi to na nde r guli a tonof注ni ger孔1glaAgenee omPae rdwih th tatof3.7 95.Keywo rds月s Peg rillusni ger,l Guc oa myla segene,u Fc ni to nofu Pse t ra me rgio n