基因表达快速分析新技术-MPSS简介.pdf

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1、配对的序列杂交，这显著地增加了特异性!。它的一个主要缺点是对杂交探针的设计，尤其是对两端互补序列的设计。如果在发夹结构中荧光标记物不能紧靠淬灭子，那就会产生很强的背景信号。同样地，如果分子信标内杂交过强，这会妨碍同目标#$分子的杂交，使得荧光信号不能充分释放，所以最佳的分子信标应该有合适的熔链特性。%&杂交探针这种方法使用两个杂交探针，可大大提高特异性(。其中一个探针 端带有荧光供体，可被激发产生绿色荧光。另一个探针的(端带有荧光受体，且 端被封闭，以便阻止其在复性时延伸。受激发的荧光供体，发出的信号可被受体接收而发出红色的荧光，检测器只检测受体发出的荧光信号。在溶液中，由于两个荧光染料是分开

2、的，所以背景中只有供体发出荧光。在复性阶段，如果两个探针与目标#$杂交成功，则荧光供体和受体靠近，从而激发受体发出荧光信号，且信号强弱与合成的#$量成正比（如图）。只有当两个独立的探针与它们的目标序列都正确杂交时，才能检测到信号，这显著地增加了扩增的特异性，而且探针不被水解可反复使用。%&!)*+,*-探针这种方法使用具有(外切核酸酶活性的#$聚合酶.，它能够水解同底物#$杂交的探针。反转录后，在复性阶段，两个特异性的引物同模板#$的末端杂交，同时探针同模板中互补序列杂交（如图!）。)*+,*-探针的(端带有荧光染料报道子（/012/30/），它发出的荧光信号可被 端的淬灭子吸收，以热量的形式

3、释放掉。如果在 456 过程中，底物序列不能同探针互补，则探针仍然是游离的，由于使用的是酶是双链特异性，因此没杂交的探针仍然保持完整，荧光信号也就不能被检测到。相反如果正确的底物被扩增出来后，探针就会在复性阶段与其杂交，当聚合酶延伸到探针时，它就会将探针的(端给替换下来，并将报道子切割下来，这就使得报道子和淬灭子分开，从而使荧光信号释放出来，可通过检测系统观察到信号的变化。753（38/0982:;=6#$的定量分为相对和绝对两种。相对定量可用于判断基因转录的变化。但是在医学诊断方面，常需要准确判断每个细胞的拷贝数，这就需要针对每一扩增基因制作一条标准曲线来确保准确的反映 456 的扩增效率。

4、常用的制备标准曲线的方法是在质粒载体上用)?或 4.6#$聚合酶的启动子来亚克隆复制子，然后用#$90 消化样品，同时对 6#$进行准确定量(。重要的是要保证 6#$模板是单链的，并且没有#$污染。用光密度扫描仪来测定 6#$的浓度并转化成每微克 6#$含多少拷贝数。然后将 6#$样品进行梯度稀释，并分别进行实时定量 456 测定其 53 值，以 53 值为纵坐标，6#$模板数的对数为横坐标绘制标准曲线。这样待测样品进行 456 后，根据其 53 值结合标准曲线可知准确浓度。而常规的 456 定量都是针对 456 终产物来进行的，456 的平台效应在一定程度上干扰了 456 的原始模板数量和终

5、产物之间的相关性，使定量准确度难以提高?。!应用领域由于实时定量 456 技术中应用了荧光染料和探针来保证扩增的特异性，并且荧光信号的强弱同扩增产物的量成正比，从而实现了真正意义上的定量。对样品进行直观的定量分析是实时定量 456 技术的一个主要应用方向。前面提到#$结合染料，分子信标，杂交探针以及)*+,*-探针，它们的敏感度相差不大，但是在特异性上有一定的差别。由于探针涉及杂交过程，要比单纯的#$结合染料有更高的特异性，同时有报道显示分子信标要比线性探针的特异性还要高A。B*CD*等对人端粒酶的 6#$成分进行了定量分析E。F20/D 等应用该技术对人的)GH I!%、)#H I 7、)#

6、H6%的 6#$表达水平进行了定量，均取得了良好的效果。同时，实时定量 456 技术在临床诊断上有着广阔的前景，目前该技术在临床上已经用于对一些基因疾病的血清分析%J和病毒的检测%。除此之外，该技术在基因突变的检测A、基因表达的研究E、微生物的检测%J%、转基因食品的检测%7等领域有着重要的应用价值。参考文献：%#D33/0 5)，K0/*-,G，,299$，!#$&52-3D-L2L9 M:L2/090-2-D32/ND-O 2M/*1D;=1:DMD*3D2-F&!#$%&()*%+，%EE?，77（%）：%J I%A&7,2/D92-)P，Q0D9)，Q/D330/5)&RL*-3DMD

7、*3D2-2M:2S I 21=3/*-9/D139T=2-D32/D-O;L/D-O*1:DMD0/H 6&,2:0L:*/T0*2-9：1/2T09 38*3 M:L2/090/H 6 W)=*OD&,L:3D1:0X;0303D2-2M 9D-O:0I-L2:0L:*/T0*2-9 F&/%(%$&0(-.1+，%EEE，?（7）：7?I7&(PL93D-$&$T92:L30+L*-3DMD6#$L9D-O/0*:I 3D0/0Y0/90 3/*-N90/*90 8*D-/0*0 12:=0/*90 8*D-/0*3D2-M2/380 2/0M*0/$11:D0;TD29=9309;DY

8、D9D2-?JJ90+L0-0;0300/H6&,L:3D2:0L:*/T0*2-9 M2/*:0:0;D9ND-*3D2-F&,-$*3%!#$%&(#.#91，%EEA，%.（%）：!E I(&E B*CD*)，B*OD8*98D$，U*098D*K，!#$&RL*-3D3*3DY0/0Y0/90 3/*-9/D13D2-I 456*99*=2M 380 6#$12-0-3 2M 8L*-30:20/*90 L9D-O 380)*+,*-M:LN2/2O0-D;030 F&.(&-.*30 3/*-9/D13D2-：33D9 L90 D-380 93L;=2M D-80/D30;090*9

9、0 F&=*:-(5*$-$#(，%EE7，%（）：(?I.J&%U P/00+L*-N3D3*3DY0 12:=0/*90 8*D-/0*3#.#9&-.5%$#7+，7JJ%，E（%）：%J(I%&%7 5*/:29$G*/*;D*-，P*T*Z G8*/DV*;08，!#$&,L3*3D2-;0N303D2-T=1=/290+L0-D-O：90+L0-2/9L11/0992/O0-0 F&/%(%，7JJJ，7(（7）：7!E I 7(?&%,0D DL，$-D3*:，G/0O2/=F 6DOOD-9&$;*3*T*90 M2/0OD2-*:O0-0 0X1/09N9D2-D-380 8

10、L*-T/*D-F&/%(%6?3%+#(A-$%3(+，7JJ%，%（%）：I A&%!F*09$&KDOOD-9，62-H*=0/，!#$&60*:I 3D0 456 M2/380;030 1*/YL F&2#*3(-.#4 5&3#B#.#9&-.5%$#7+，7JJ%，!?（）：7 I?&%($/8D0 2Y*33&$11:D*3D2-9 2M+L*-3D3*3DY0 456 D-380 TD29*M03=*-;O0-03D0-3 2M TD2308-2:2O=1/2;L39 F&C%D%E+(5#.%&*.-3!#8$%&(#.#91，7JJ7，A7（7）：7?E I JJ&基因表达

11、快速分析新技术 I,4 简介张智俊%，罗淑萍7，谭晓风%（%&中南林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙!%7JJ.；7&新疆农业大学，新疆 乌鲁木齐 AJJ(7）摘要：介绍了一种新的基因表达快速分析技术 I,4 技术的基本原理、技术路线及其优点和应用。关键词：基因表达；测序,4中图分类号：R?A文献标识码：$文章编号：%JJ!I%_（7JJ）J7 I JJ!J I J7收稿日期：7JJ7 I%J I JA；修回日期：7JJ I J%I J%作者简介：张智俊（%E?!I），男，博士生，从事林木分子生物学研究；谭晓风（%E(.I），男，教授，博士导，从事林木遗传育种、分子生物学研

12、究，发表论文!J 余篇。随着基因组研究的深入，人类、水稻、支原体、酿酒酵母和大肠杆菌等的全基因组测序工作相继完成，尤其是人类全基因组测序计划的完成，标志着生物体基因组研究已进入后基因组时代。在后基因组时代，分子生物学工作者不仅要对基因结构与功能进行研究，而且更为艰巨的任务是，从整体出发对生物体的全部基因表达的时续性和空间性进行分析，了解基因组的功能活动和相互作用。目前，除了 6)I 456%、$G7 I!、*99DY0:=1*/*:0:9DO-*N3L/0 90+L0-D-O 简称,4）(。应用这一方法不但可以检测出基因组中某一个基因的表达水平，而且还可以获得特定细胞整个基因组活动的概貌，进而

13、还可以根据基因表达水平的特点开展诸如发现新基因等一系列研究工作。现就这一新技术做简单介绍。%原理,4技术是利用限制性内切酶和荧光检测知识，发展出的一种辨认和测定细胞每一个#$克隆片段末端%.7JT1序列的方法，从而查明细胞内所有基因的表达情况。7系统组成第%卷第 7 期：!J7JJ 年!月生物技术Pa)5K#aaGBb2:&%，#2&7：!J!$1/&7JJ万方数据!#分析系统大体可划分为三大部分，如图$所示：微球体阵列槽、反应液供排系统和荧光信号处理系统。其中微球体阵列槽主要功能是微球体从槽的一端进入，在槽内紧密排列形成微球体阵列；反应液供排系统主要功能是在连接、酶切、洗脱等过程中自动供排所

14、需的反应液；荧光信号处理系统则主要负责荧光信号的收集和处理，该系统主要由弧光灯源、荧光显微镜、%&照相机、计算机及相应的数据处理的软件构成。图$!#系统的组成图 微球体上进行的!#分析过程表$酵母!#测序的准确性生长阶段测序克隆数（个）验证的克隆数（个）准确率（(）早期$)，)*+$,，)+,-$中期$.，.$,$*，-/.-0总计)-，0-/./，)$-0/技术方法!#分析步骤如图 所示：（$）首先将 1&23 模板体外“克隆”到直径,!4 的微球体上。“克隆”的方法主要是利用人工设计长度不同的两类互补寡核苷酸，分别与 1&23 模板和微球体连接之后，再将 1&23 模板与微球体连接起来。为

15、了能装载下细胞内所有的 1&23 模板（若以/5.6$0.个基因计算），寡核苷酸的数量至少应该要比模板的量多$00 倍以上，为此 789:98 等设计了$;)*6$0*个片段长/498 的寡核苷酸，这样足可以保证生物体所有不同的 1&23 模板都能与不同的寡核苷酸相连接，而且每一个的微球体上也可承载$0.5$0,个相同的 1&23 拷贝。（）用&?$识别位点的不同寡核苷酸接头与连接在微球体上的 1&23 模板相连接，另外每一种接头的/端还带有一个荧光标记，可与荧光探针杂交，产生荧光信号，该信号可以反映出接头,端与模板 1&23 杂交的不同位置上的碱基信息，从而获取模板 1&23 的序列信息。（

16、.）分别加入能产生红黄蓝绿杂交信号的四套荧光探针，进行杂交，每次杂交完毕用洗脱液清洗微球体阵列，除去上一轮杂交的荧光探针。用显微拍照的方法记录荧光信号，并将四种信号的图像输入计算机储存。（,）用=型限制性酶 7?$进一步消化 1&23模板，7?$能在距识别位点约$/个碱基的位置切割 1&23 双链，并在 1&23 模板上产生下.个碱基末端。（)）洗脱除去寡核苷酸接头，经过 7?$酶切后的 1&23 模板，进入下一轮分析。重复（/）5（,）的步骤.5,次后，分析所得到的$)5 0 张荧光显微照片，就可以读出微球体阵列中每一个微球体上长度为$)5 0 的序列，所以这就为在转录水平上进行基因表达分析

17、提供了强有力的定性和定量手段，很明显这一技术首先可以应用于不同丰度基因的差异表达分析，制作基因转录图谱，这无疑将加速新基因克隆和基因功能的分析；!#所获得的基因序列可提供%引物，可通过比较 A9:97B:C、D#E 数据库等进行基因定位，也可转化为分子标记构建遗传图谱等等，因此该技术在实际应用上可被广泛用于动植物体分类学和遗传学，功能基因组学，蛋白质组学等研究。在医学方面，可利用!#侦测到不同组织器官细胞内致病基因的表达水平，从而可应用于人类各种疾病的基因诊断。在农作物遗传育种方面，可对各种数量基因进行 FEG 定位克隆，从而提高育种的靶向性，加快育种进程。从生物信息学的角度来说，!#技术的分

18、析结果将丰富核酸数据的内容，同时也为验证已知生物信息数据提供了参照物。比如 789:98 等通过!#酵母在不同生长阶段的基因表达情况进行了检测，将所获得的$0 万多个克隆序列同已知的酵母基因数据库比较，其检测的准确率高达-0(，具体数据见表$。另外，利用!#技术对 EHI$细胞中基因表达水平进行了检测，检测的出的序列结果通过与 D#E 序列数据库比较，也取得了令人满意的结果（具体结果略）。对于一些高丰度表达的 EHI$基因，!#检测的准确率高达-(以上。这说明!#同其他的基因表达检测方法，诸如 D#E、#3AD 等有着同等的正确性，而且!#对于基因表达的检测效果还是非常理想的,。,!#技术的优

19、缺点目前!#分析系统对基因表达分析过程，诸如微球体阵列的制作，反应液的供排、各种反应条件的控制，图像的处理和数据的分析已经完全自动化，能够在很小的一块微球体阵列上，通过常规的分子生物学手段：连接、酶切、萤光成像等简单几个步骤就可以同时分析数以万计的基因数目，这大大超过了基因的 D#E、2BJ9 保护分析、&EE I%分析（这几种方法一次只能检测很少的基因表达情况），甚至超过了#3AD 的一次性分析能力（#3AD 的一次性可分析上千个基因），同时不需要耗费时间做大量的%实验，不需要对 1&23 模板做特殊的处理，也不用对探针序列进行提前选择，因此!#技术分析样品基因表达的操作简便，速度快，时间短

20、。更为重要的是!#可根据荧光信号对基因表达水平做定量的分析，能提供基因末端序列信息，这一点!#与 E I%、#3AD 等常规方法不同。另外!#对基因末端序列与常规测序不同的是，它不需要进行基因片段的分离、克隆再逐一测序，而是具备了&23 芯片、1&23微阵列荧光分析法直接读出序列的优点/，,，)，可同时获得大量 1&23 末端序列，从而简化了测序过程，这符合后基因组时代基因功能分析的高通量、自动化、微型化的要求。当然该技术同&23 芯片技术一样，需要较为昂贵的硬件和相配套的软件的协同运做，目前国内外的相关应用报道较少，因此目前还亟需降低仪器检测的成本，加强推广和普及工作。总之，!#技术是基因表

21、达定性和定量研究的一种有效工具，它能在短时间内侦测细胞或组织内全部基因的表达情况，并能通过与已知基因数据库进行比对，定量显示出基因在细胞或组织内的表达状况。随着!#技术的不断发展，相信该技术必将在各种生物基因组功能方面及其相关领域研究中发挥巨大的作用。参考文献：$GKB:L，B8M99 37;&KNN989:OKBP MKJQ49B:J RN OT9 RPQ498BJ9 1TBK:89B1OKR:U;!#$%$，$-，,*（,0*）：-)*I-*$;VK1OR8 D V9P1SP9J1S，GK:WTB:L，798O VRL9PJO9K:，!#$;#98KBP B:BPQJKJ RN L9:99

22、X89JJKR:U;!#$%$，$-,，*0：.+.I.+*;/冯闻铮，曹竹安，刘进元;分析基因表达图式的新方法 U;生物化学与物理进展，$-，$：,I*;.史春梦，粟永萍 全基因组基因表达频谱研究的新方法#3AD 和=A=U;生物工程进展，00$，0：),I)*;,789:98#，URT:JR:!，!#$;A9:9 9XQ 4BJJK?9PQ 9BM B88BQJ U;&(;)#*($+%*,;，000，$+，)/0 I)/.;)#1T9:B!，#TBPR:&，&B?KJ Z，!#$;FSB:OKOBOK?9 4R:KOR8K:L RN L9:9 9X89JJKR:BOO98:J KOT B

23、 1R4P949:OB8Q&23 4K18RB88BQ U;!#$%$，$-,，*0：.)*I.*0;$.00/年.月基因表达快速分析新技术 I!#!简介万方数据基因表达快速分析新技术-MPSS简介基因表达快速分析新技术-MPSS简介作者：张智俊，罗淑萍，谭晓风作者单位：张智俊,谭晓风(中南林学院经济林育种与栽培国家林业局重点实验室,湖南,长沙,412006)，罗淑萍(新疆农业大学,新疆,乌鲁木齐,830052)刊名：生物技术英文刊名：BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：2003,13(2)被引用次数：2次 参考文献(6条)参考文献(6条)1.Liang P;Rickinson AB Di

24、fferential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerasechain reaction外文期刊 1992(5072)2.Victor E Velculescu;Zhang;Bert Vogelstein Serial analysis of gene expression外文期刊 1995(5235)3.冯闻铮;曹竹安;刘进元 分析基因表达图式的新方法期刊论文-生物化学与生物物理进展 1999(02)4.史春梦 粟永萍全基因组基因表达频谱研究的新方法SAGE和IPGI期刊论文-中国生物工程杂志 2001(0

25、2)5.Brenner S;Johnson M Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing(MPSS)onmicrobead arrays外文期刊 2000(18)6.Schena M;Shalon D;Davis RW Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementaryDNA microarray外文期刊 1995(5235)本文读者也读过(7条)本文读者也读过(7条)1.殷晓璐.许雁萍.吴浩强.YIN Xi

26、ao-lu.XU Yan-ping.NG Hong-keung 髓母细胞瘤比较基因组杂交分析及ERBB-2异常表达的意义期刊论文-临床与实验病理学杂志2005,21(4)2.余传信.殷旭仁.菊池三惠子.平山谦二.朱荫昌.Yu Chuanxin.Yin Xuren.Mihoko Kikuchi.Hirayama Kenji.ZhuYinchang 日本血吸虫虫卵毛蚴中带信号序列基因的全长cDNA序列分析期刊论文-中国血吸虫病防治杂志2006,18(1)3.陈杰 大规模平行测序技术(MPSS)研究进展期刊论文-生物化学与生物物理进展2004,31(8)4.袁晓东.李国印.汤敏谦 一种高效的功能基因

27、分离解析法期刊论文-遗传2002,24(3)5.张波.徐昌杰.陈昆松.ZHANG Bo.XU Chang-jie.CHEN Kun-song 用于多基因表达检测的猕猴桃macroarray阵列期刊论文-果树学报2007,24(6)6.杨学.刘丽艳.关凤芝.李柱刚.吴广文.王珣.路颖.陈浩.YANG Xue.LIU Li-yan.GUAN Feng-zhi.LI Zhu-gang.WUGuang-wen.WANG Xun.LU Ying.CHEN Hao 基因表达系列分析技术在植物基因表达中的研究进展期刊论文-中国麻业科学2009,31(4)7.包文斌.陈国宏.束婧婷.吴圣龙 基因表达系列分析(SAGE)及其在生命科学中的应用期刊论文-中国兽医学报2008,28(1)引证文献(2条)引证文献(2条)1.刘田田.肖波 基因表达谱分析平台的建立及在癫痫中的应用期刊论文-中华临床医师杂志（电子版）2012(9)2.林世强.宁正元 生物信息学及其在农业科学中的应用期刊论文-亚热带农业研究 2007(2)本文链接：http:/