EST-SNP开发软件特性分析及比较.pdf

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1、生命的化学2011 年 31 卷 6 期CHEMISTRY OF LIFE 2011，31(6)906 Technique and Method文章编号:1000-1336(2011)06-0906-06EST-SNP 开发软件特性分析及比较李 猛1 郭大龙1 刘崇怀2 张国海11河南科技大学林学院，洛阳 4710032中国农业科学院郑州果树研究所，郑州 450009摘要：利用生物信息学软件，对表达序列标签(EST)序列进行单核苷酸多态性(SNP)开发目前已较为普遍，其方法简单实用，且软件数量较多，可分为需要测序峰图的SNP开发软件和不需要测序峰图的SNP开发软件。对有测序峰图的序列进行SNP

2、开发，操作步骤较少且结果较为精确；对无测序峰图的序列进行SNP开发可大批量操作且成本较低。本文针对这两类软件进行分析比较，阐述EST-SNP开发流程，重点分析以公共数据库中EST序列为基础的SNP开发过程，并对其各种使用参数加以说明，旨在为EST-SNP开发提供参考，提高效率。关键词：SNP；软件分析；测序峰图；EST序列中图分类号：Q81收稿日期：2011-04-25国家自然科学基金项目(30800742)；国家葡萄产业技术体系(nycytx-30-zy-01)；河南省高等学校青年骨干教师资助计划(2010GGJS-072)资助作者简介：李猛(1987-)，男，硕士生，E-mail：lime

3、ngak47 ；郭大龙(1978-)，男，博士，副教授，通讯作者，E-mail：；刘崇怀(1965-)，男，博士，研究员，通讯作者，E-mail：；张国海(1962-)，男，博士，教授，E-mail：zgh_单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指基因组内DNA某一特定核苷酸位置上的转换、颠换、插入、缺失等变化。一般情况下，我们所指的SNP不包括碱基的插入与缺失1。SNP作为近年来出现的第三代遗传标记，目前已广泛应用于遗传连锁图谱构建2、多样性分析3、品种鉴定4和重要性状的基因定位5等相关研究中，具有密度高、遗传稳定性强、易于实现自动化分析等特

4、点，比以简单序列重复(simple sequence repeat,SSR)为代表的第2代分子标记效率更高，更适用于高通量的检测分析。理论上讲，任何用于SNP检测的手段都可以用于SNP的开发，但当前SNP的开发主要通过两种途径：(1)DNA扩增片段的直接测序。这是开发SNP最简单的方法，其原理是根据EST序列或者单拷贝基因组序列进行引物设计，选择有代表性的个体进行扩增，产物测序后进行序列比对。此方法的优点是开发SNP假阳性率低，同时还能鉴定出由SNP组成的单体型(haplotype)；缺点是工作量大，花费高，非一般的实验室能独立完成。因而此方法只用于特定SNP的开发和验证6；(2)利用生物信息

5、学的方法。该方法是利用生物信息学软件从核酸数据库中开发SNP，通过软件自动识别序列中的多态性位点，从而得到候选SNP，是一种成本较低且简单有效的SNP开发策略。近年来，随着表达序列标签(expressed sequence tag,EST)计划在不同物种间的开展和研究内容的深入，来源于不同物种、不同组织、不同细胞类型和不同发育阶段的基因表达序列的数目在公共数据库中急剧上升。截止到2011年3月，美国国家生物技术信息中心(NCBI)的dbEST数据库已收录了6900多万条EST序列，这些表达序列都为SNP的开发提供了良好的基础。由于EST序列来自转录区，保守性较高，因此，基于EST序列信息开发出

6、的SNP可能与表达基因紧密相关或直接位于基因的编码区内，这就为今后的基因组比较及基因定位和克隆研究奠定了基础7。目前开发EST-SNP的软件众多，如何选取软件以及如何设置参数都是影响试验结果的关键因素，本文针对这一问题，阐述EST-SNP的开发流程，重点分析比较EST-SNP开发软件的特性及其参数设置，为EST-SNP的开发提供参考。生命的化学2011 年 31 卷 6 期 907 技术与方法CHEMISTRY OF LIFE 2011，31(6)1.EST-SNP 开发流程利用生物信息学软件对EST序列进行SNP开发的方法大致可分为两类：(1)根据测序峰图开发SNP；(2)基于公共数据库中的

7、EST序列开发SNP(图1)。这两种方法都需要提前对数据进行处理，测序峰图需要进行判读，识别出碱基质量，序列峰图及碱基序列的信息，而公共数据库中的EST序列则需要去除影响SNP开发的干扰因素，如poly A尾巴、载体序列等。2.SNP 开发软件的比较分析2.1 需要测序峰图的 EST-SNP 开发软件利用测序峰图进行EST-SNP的开发目前较为普遍。如Stickney等8根据斑马鱼的测序峰图通过Poly-Phred软件开发验证了1313个SNP，并利用SNP绘制了斑马鱼突变图谱；Singh等5利用PolyPhred对水稻的测序峰图进行SNP的开发，通过分析非同义替换的SNP，阐述水稻不同品种间

8、芳香性的差异。根据测序峰图开发EST-SNP的软件的方法操作步骤少，结果较为精确，假阳性率较低，但工作量大，需要人工进行结果的核对，成本较高。利用此方法开发SNP较具代表性的软件有：Nickerson等9开发的PolyPhred、Zhang等10开发的SNPdetector、Weckx等11开发的novoSNP以及Li等12开发的SOAPsnp。PolyPhred和SNPdetector均需要第三方软件对序列峰图以及开发结果进行判读与处理，且PolyPhred只能预测某一核苷酸位点上单个碱基的替换，不能对插入与缺失(in-del)进行预测，但其研发时间较早，使用率最高。novoSNP可在Win

9、dows操作系统下使用，具有用户图形界面，适合于不熟悉Linux系统的用户使用。SOAPsnp图1EST-SNP开发流程生命的化学2011 年 31 卷 6 期CHEMISTRY OF LIFE 2011，31(6)908 Technique and Method则是基于新一代测序技术分析基因组SNP的软件，需要基因组参考序列，目前应用较为广泛(表1)。这四款软件所采用的算法标准并不统一，因此搜索到SNP位点的准确性也不尽相同。研究表明：SN-Pdetector的假阳性率和假阴性率均为最低，PolyPhred的假阳性率较低，但其假阴性率却较高，novoSNP的假阳性率则明显偏高9-11。假阳性

10、率高则产生错误SNP位点的几率会增加，假阴性率高则真实的SNP位点被忽略的几率会增加。Li等12通过SOAPsnp分析人类SNP表明：利用SOAPsnp开发的候选SNP具有高达99%的正确率，但该结果的前提是存在参考序列，这也同样是SNPdetector具有较高正确率的原因，因此，在具有可靠的参考序列时，SNPdetector与SOAPsnp应是较为理想的开发SNP的软件。所以在应用此类软件时，用户需要根据自己的需求选择合适的软件或是将同一数据导入不同的软件中进行分析比较，提高结果的可靠度，同时也可提高后期试验效率。利用测序峰图进行SNP开发的常用软件还有：PolyBayes13、ssahaS

11、NP14、InSNP15、SNP-PHAGE16，以及基于新一代测序技术分析基因组SNP的软件MAQ17，Atlas-SNP218等。此类软件预测SNP的准确性与测序结果的质量和用户自定义的软件质量阈值有直接关系，测序结果的质量越高，用户自定义的质量阈值越高，则开发的SNP位点越准确。但是随着用户自定义的软件质量阈值的增加，也许会过滤掉一些低质量区域真实的SNP位点，因此在使用过程中，需要选择一个相对平衡的质量阈值19。2.2 不需要测序峰图的 EST-SNP 开发软件近年来，利用公共数据库中的EST序列进行SNP开发，已得到广泛应用。如Batley等20利用AutoSNP从102,551条玉

12、米EST序列中开发了14,832个候选SNP，并通过测序的方法进行了验证；Jiang等4利用Quali-tySNP对55,296条甜橙EST序列和2,575条温州蜜柑EST序列进行SNP开发，得到3,348个候选SNP，并在30个柑橘属的品种中通过CAPS和重新测序法鉴定候选SNP，并利用SNP对柑橘进行品种鉴定和多态性分析。通过EST序列进行SNP开发的方法节省时间，节约成本，但其开发的多态性位点仅仅是通过比对数据库中的EST序列得到，无法有效地对结果进行核对，因此假阳性率比利用测序峰图开发的SNP要高。目前也有一些软件可以执行这项工作，如：Barker等21开发的AutoSNP，Savag

13、e等22开发的SNPServer，Tang等23,24开发的QualitySNP和HaploSNPer，及Phrap程序包中的cross_match(表1)。其中，AutoSNP是Perl语言的脚本，QualitySNP是基于C语言的程序，SNPServer和HaploSNPer分别是AutoSNP和QualitySNP的网页版，具有用户图形界面，操作简便，cross_match则是Phrap程序包中用于去除EST载体序列的软件，也可 用 来 进 行 S N P 位 点 的 搜 索，运 行 时 只 需 输入-alignments和-discrep lists两个口令即可，由于不是专业的SNP开

14、发软件，所以其结果的可靠度也较低。Tang等22利用人类基因对AutoSNP和QualitySNP进行比较显示：AutoSNP预言的候选SNP数量近似是QualitySNP的2倍，但其正确率却不到QualitySNP的1/4，且QualitySNP的运行速度要快很多，因此Quali-tySNP应该是一款较为理想的通过无测序峰图的EST序列进行SNP开发的软件。尽管QualitySNP开发SNP的正确率要比AutoSNP高很多，但也仅为35.5%，剩余65.5%的SNP均为假阳性。由此也反映出，单纯通过数据库中的EST序列进行SNP开发，其结果的假阳性率较高，这对后期的试验会造成干扰。为提高SN

15、P开发的准确性，研究者需要提前对公共数据库中的EST序列进行预处理，在处理过程中，对不同的步骤设置不同的参数，均会对SNP的开发结果产生较大影响。目前常用的参数为：聚类相似值为80%(D2cluster)，拼接相似值为95%，拼接的最小重叠碱基数为100 bp(cap3)，且拼接后合格的重叠群(contig)至少要由4条EST序列组成。当然，并不是重叠群所含有的EST序列越多越好，若过多很有可能是由于软件本身计算错误造成的。笔者通过以上参数，利用AutoSNP和QualitySNP对26,173条葡萄EST序列进行分析，结果显示：虽然AutoSNP预言的候选SNP位点很多，但通过人工筛选原则进

16、行随机检测，其合格率却不容乐观，相反，QualitySNP预言的候选SNP位点虽然较少，但其合格率却很高。这也证实，QualitySNP的性价比较高，适用于公共数据库中的EST-SNP开发。综上，用户用此类软件进行SNP开发时，需要根据自己的需求进行软件的选择和各种参数的设置。为提高结果的可靠度，用户可使用不同的软件运行同一数据，通过分析比较，选择可靠度评分较高的且在不同软件中均能得到认证的候选SNP位点进行试验验证，这也是提高效率的一种有效方法。生命的化学2011 年 31 卷 6 期 909 技术与方法CHEMISTRY OF LIFE 2011，31(6)表1EST-SNP开发软件特性比

17、较 软件名 运行环境 程序类型 辅助软件 引用次数 用户图 特点 地址 形界面PolyPhred Linux 本地 Phred/Phrap/Consed 734 无 不能识别INDELS，能考虑双峰 http:/droog.gs.wash-(Nickerson等,1997)情况，对杂合子预测有优越性 ington.edu/polyphred/SNPdetector Linux 本地 Phred/ptrfinder/47无 比较精确，可用于检测INDELS，ftp:/ftp1.nci.nih.gov/(Zhang等,2005）Consed 用SIM拼接，需要引物序列和模 pub/SNPdetec

18、tor 板序列，操作复杂 novoSNP Windows/本地 SCF格式用Phred 86 有 可在Windows下使用，可检测 http:/www.molgen.(Weckx等,2005)Linux INDELS，操作相对简单 ua.ac.be/bioinfo/novosnp/SOAPsnp Linux 本地 Phred 47 无 基于新一代测序技术，需要参 http:/soap.genomics.(Li等，2009)考序列，准确性高 Linux 本地 Phred/Phrap/Consed 331 无 需要测序峰图，能处理较多数 http:/bioinformatics.(Marth等，1

19、999)据，可判断INDELS bc.edu/marthlab/SoftwaressahaSNP Linux 本地 Phrap 388 无 需要测序峰图，可判断INDELS http:/www.sanger.(Ning等，2001)ac.uk/resources/software/ssaha/InSNP Windows 本地 无 25 有 需要测序峰图，正反引物序列，http:/www.mucosa.(Manaster等，2005)参考序列 de/insnp/SNP-PHAGE Linux 本地 Perl/Phred/25 无 需要测序峰图，结果为Web界面，http:/bfgl.anri.b

20、arc.(Matukumalli等，2006)Phrap/Consed 可查找STS usda.gov/ML/snp-phage/index.shtmlMAQ Linux 本地 Phred 610 无 基于新一代测序技术，需要参考 http:/maq.source-(Li等，2008)序列，准确性高 Linux 本地 BLAT/cross_match 13 无 基于新一代测序技术 http:/www.hgsc.bcm.(Shen等，2010)tmc.edu/cascade-tech-software-ti.hgscAutoSNP Linux 本地 Perl/d2cluster/cap3 100

21、 无 脚本文件，体积小，无需太多运 http:/www.cerealsdb.(Barker等,2003)行口令，结果为HTML格式 Windows/在线 无 31 有 无需下载，操作简便 http:/hornbill.cspp.(Savage 等，2005)Linux latrobe.edu.au/snpdiscovery.htmlQualitySNP Linux 本地 C+/Perl/cross_match/35 无 比较精确，可分析非同义SNP，http:/www.bioinfor-(Tang等，2006)cap3/FASTY(非必要)运行口令多，结果含单体型信息 matics.nl/to

22、ols/snpweb/HaploSNPer Windows/在线 无 10 有 无需下载，操作简单 http:/www.bioinfor-(Tang等，2008)Linux matics.nl/tools/haplosnper/生命的化学2011 年 31 卷 6 期CHEMISTRY OF LIFE 2011，31(6)910 Technique and Method3.讨论利用生物信息学软件进行SNP的开发及筛选，其中最关键的问题就是筛选的假阳性率问题，在开发的过程中，研究者要确认所开发的SNP是真实存在的序列变异，而不是由聚类错误或拼接错误等引起的25。因此，在筛选SNP时应当注意以下几

23、点：(1)对低质量重叠区域进行聚类时，连续碱基不配对的现象时常发生，因此要尽量选择两侧有一定数量碱基严格配对的SNP；(2)碱基判读质量与其所在的位置相关，但测序所得的序列前区段质量普遍偏低，因此可选择序列100 bp以后的候选SNP；(3)聚类时，为得到高的比对分值，经常需要在一条序列中加入空格，但这样会被误判为插入与缺失，为避免这种情况，在处理结果时甚至可以不考虑插入或缺失的SNP，只分析替换类型；(4)在同一碱基位置上发生两次错误的概率较低，为得到高质量SNP，可在重叠区域规定SNP位点必须出现在两条或两条以上的序列中。Dong等26对葡萄SNP的开发表明，如果仅是比较2个品种的基因组序

24、列，则其开发出的SNP频率仅能代表这两个品种；若比对更多品种的基因组序列，就会有更多不同位点的SNP被发现。因此，SNP的开发频率与其所使用的品种数量有关，开发时所利用的品种数量越多，则开发出的SNP频率越高。在无测序峰图的EST序列中开发SNP时，研究者应当尤其注意影响SNP开发质量的各种筛选参数。其中最主要的因素为重叠群的规格(重叠群所包含EST序列的数量)和次要等位基因(等位基因中出现次数较少的碱基)的出现次数27。笔者通过QualitySNP对26,173条葡萄EST序列进行候选SNP位点分析时发现，为了得到高质量的候选SNP位点，应在拼接后重叠群的数量不小于4，且次要等位基因出现次数

25、至少为2的重叠群中进行SNP位点的挖掘。这是因为，错配仅出现一次的话很可能是由于序列差错引起，而同一碱基位置上发生两次序列差错的概率却很小，因此在规格为4，主次等位基因出现次数比为1:1，即次要等位基因出现2次的重叠群中开发的候选SNP，其可靠度较高。而在规格大于4的重叠群中，也应当尽量保证主次等位基因出现次数比近似为1:1，即在规格为5-6的重叠群中，次要等位基因应至少出现2次，规格为7-8的重叠群中，次要等位基因应至少出现3次，规格9-10的重叠群中应至少出现4次，依次类推。但随着重叠群规格的增加，符合要求的次要等位基因却在减少，主次等位基因出现次数比往往是5:1左右，而这些位点很有可能是

26、假阳性的。根据Wang等28的研究，在规格为4，次要等位基因出现2次的重叠群中挖掘的候选SNP为真实SNP的概率较高，为70.5%。这也说明，在规格较小，且次要等位基因出现次数较多的重叠群中开发的候选SNP，具有较高的真实率。但是，SNP假阳性率降低的同时，其假阴性率会随之升高，很有可能在规格小于4，或次要等位基因出现1次的重叠群中，也存在真实的SNP，这就需要大量的试验去验证这些位点，才能得到真实的，客观存在的SNP。SNP位点两侧的序列质量也会影响候选SNP的准确性。当在一小段序列内存在大量连续的SNP时，这一小段序列就被称为SNP的热点区域(hot spots of SNP)，而这种情况

27、很有可能是序列错误造成的，因此为提高试验效率，位于热点区域的SNP应当被过滤掉。在开发SNP时，SNP位点两侧应当保证至少56 bp的碱基是完全严格匹配的。4.结语目前，大多数的EST-SNP开发软件都不支持Windows的操作环境，这对相当多的使用者造成困扰，因此，如果软件能适应更多的操作系统，则会节省很多时间，提高科研效率。与需要测序峰图的SNP开发软件相比，不需要测序峰图的软件不能对原始的峰图进行处理，因而就不能分析杂合现象，更无法根据峰图进行人工校正。因此，使用此类的SNP开发软件需要研发者和使用者更多的耐心和客观的分析，才能得到高质量可靠的SNP。况且，并不是每个实验室都有条件进行大

28、规模的DNA测序分析，随着公共数据库中EST数目的急剧上升，对EST序列直接进行SNP开发的方法更加简便，快捷，高效，将得到更广泛的应用。参 考 文 献1 Brookes AJ.The essence of SNPs.Gene,1999,234:177-1862 Hyten DL et al.A high density integrated genetic linkage map of soybean and the development of a 1536 universal soy linkage panel for quantitative trait locus mapping.C

29、rop Sci,2010,50:960-9683 Inghelandt DV et al.Population structure and genetic diversity in a commercial maize breeding program assessed with SSR and SNP markers.Theor Appl Genet,2010,120:1289-1299 生命的化学2011 年 31 卷 6 期 911 技术与方法CHEMISTRY OF LIFE 2011，31(6)Characteristics and comparison of the EST-SNP

30、 mining softwares LI Meng1,GUO Dalong1,Liu Chonghuai2,ZHANG Guohai11College of Forestry,Henan University of Science&Technology,Luoyang 471003,China 2Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450009,ChinaAbstract In recent years,the development of SNP marke

31、rs from EST sequences employing the bioinformatics softwares is the method commonlyusedanditissimpleandefficient.Numeroussoftwaresareavailableatpresent,andtheycouldbeclassifiedintotwotypes:onereliesonthesequencingpeakfigures,andtheotherdoesnt.Theproceduresinvolvedarefewerandtheresultsaremoreaccurate

32、whenthesequencingpeakfigureswereused.However,themethodwithoutsequencingpeakfiguresiscost-savingandhasthecapacityof dealing with large-scale data.In this paper,the two types of softwares were analyzed and compared and the EST-SNP development process was also discussed.SNP development process based on

33、 the EST sequences from public databases and the parameters in the SNP development process were comprehensively described.The purpose of this paper is to provide a reference for EST-SNP developonent and improvedtheefficiencyinEST-SNPdevelopmentprocess.Key words SNP;software;sequencingpeakfigures;EST

34、4 Jiang D et al.The mining of citrus EST-SNP and its application in cultivar discrimination.Agri Sci in China,2010,9:179-1905 Singh A et al.SNP haplotypes of the BADH1 gene and their association with aroma in rice(Oryza sativa L.).Mol Breeding,2010,26:325-3386 Kim S et al.SNP genotyping:technologies

35、 and biomedical applications.Annu Rev Biomed Eng,2007,9:289-3207 Liu S et al.Generation of genome-scale gene-associated SNPs incatfishfortheconstructionofahigh-densitySNParray.BMC Genomics,2011,12:538 Stickney HL et al.Rapd mapping of zebrafish mutations with SNPs and oligonucleotide microarrays.Gen

36、ome Res,2002,12:1929-19349 Nickerson DA et al.PolyPhred:automating the detection and genotypingofsinglenucleotidesubstitutionsusingfluorescence-based resequencin.Nucleic Acids Res,1997,25:2745-275110 Zhang J et al.SNPdetector:a software tool for sensitive and accurate SNP detection.PLoS Comput Biol,

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