利用SSR标记分析一年生黑麦草遗传多样性的取样策略_罗.pdf

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1、 草业科学 卷 期 ，櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧櫧毥毥毥毥植物生产层利用 标记分析一年生黑麦草遗传多样性的取样策略罗永聪，马 啸，张新全（四川农业大学草业科学系，四川 雅安 ）摘要：一年生黑麦草（）为异花授粉植物，其 多态性研究的取样策略与遗传多样性分析的可靠性和效率直接相关。从一年生黑麦草国家审定品种“长江号”和“特高”中，分别提取 个单株，同时提取、和 个单株叶片混合样本的，利用 标记进行遗传多态性分析。研究结果表明，取样梯度间多态性信息含量指数（）差异不显著（），但当混合单株样本为 株时，达到最高值；平均等位基因数和单个 座位上等位基因种类随样品内单株混合数目增加而增加，当取样量在 株及

2、以上时，等位基因数和等位基因种类趋于稳定，电泳图谱表现基本一致；不考虑稀有等位基因（基因频率）的漏检，采用 株混合样本能够最大限度保持检出较高频率（）等位基因，且重演性较好。鉴于此，利用 标记分析一年生黑麦草遗传多样性时采用 个单株混合样提取的 样本能够有效反映群体间差异。关键词：一年生黑麦草；标记；遗传多样性；混合样本；取样策略中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）一年生黑麦草（）又名意大利黑麦草、多花黑麦草，是具世界栽培意义的禾本科牧草，具有产量高和品质好的优点，被广泛用于建植人工草地、割草地和放牧地。一年生黑麦草栽培品种多为人工选育的同源四倍体（），加之以异花授粉的繁育特性，造成其种质

3、资源遗传结构复杂，品种遗传基础表现出相当大的异质性，即品种中的个体间存在较大的遗传变异。在分析异质杂合植物群体间和群体内变异时，一般对品种和生态型群体进行个体取样分析，而最佳的群体取样数量主要取决于最小的共享等位基因或基因型的频率。例如，要分析不小于 的等位基因频率，群体取样量为 株左右，而分析不小于的等位基因频率，群体取样量为 株左右。为了分析更多的基因型，混合单株策略成为一种常见的方法，它在分析扫描基因库种质资源的遗传多样性或进行品种鉴定及种子批纯度鉴定时发挥了重要作用。利用 标记分析一些常见异交牧草和草坪草品种群体的最佳混合样本量，苜蓿（）为株，红三叶（）和海滨雀稗（）各为 株，而多年生

4、黑麦草（）为 株，对白三叶（）品种群体的 分析发现，随机选取品种内的 个单株混合提取的 样本可有效地分析品种间的遗传关系，并且同一品种群体内单株具有的 的条带会在混合样本中重现，丢失的条带都是一些稀有条带。（）又名微卫星（），是一类具有高度多态性的分子标 记，目 前 已 广 泛 应 用 于 植 物 遗 传 育 种 研究。在用 进行遗传多样性或品种指纹鉴定分析时首先考虑的是样本数量问题，采集的样本数量应该能代表某一群体的总体遗传多样性水平。目前国内尚未见利用 标记分析一年生黑麦草遗传多样性的取样策略的研究报道，本研究以两个一年生黑麦草国家审定品种为材料，通过对不同混合单株梯度下样本间遗传多样性的

5、差异分析，探讨进行一年生黑麦草遗传多样性分析时的科学取样策略。材料与方法 试验材料以“长江号”和“特高”两个一年收稿日期：接受日期：基金项目：国家科技支撑计划项目（）；国家现代牧草产业技术体系（）作者简介：罗永聪（），女，四川绵阳人，在读硕士生，研究方向为草种质资源创新与育种。：通信作者：张新全（），男，四川雅安人，教授，博士，研究方向为草种质资源创新与育种。：草业科学（第 卷 期）生黑麦草品种为材料，分别从两个群体中提取 个单株 ，同时提取、和 个单株叶片等质量混合后样本的 ，混合样本中的单株取自单株样本。其中，单株 样品（共 个样本）用 表示，、和 株叶片混合提取的 （均为 个混合样本）分

6、别用、和 表示，株叶片混合提取的（共个混合样本）用表示，株叶片混合提取的（共个混合样本）用表示，株叶片混合提取的 （共个混合样本）用表示，每个品种共获得 个 样本。试验所用的对一年生黑麦草 引物信息 见表，引物均由上海生工生物技术有限公司合成。试验方法 提取用 法提取基因组，通过采用 琼脂糖电泳和 微量紫外分光光度计检测 纯度和浓度，合格的 样品于 冰箱内保存备用。将 样品取出一部分稀释至 ，放于冰箱保存备用。扩增反应和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 扩增反应总体积为，其中 ，模板 （），正、反向引物各（），酶 （），补足体积。孔板用硅胶盖覆盖密封，扩增在 仪上进行。反应程序采用 模式，即 预变性

7、 ；个降落 循环：变性，退火温度由 开始，每个循环降低 ，直至 ，退火，延伸 ；个循环：退火温度为，变性和延伸温度同上；延伸 ，保存。扩增产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上进行检测。每样品上样，以 为分子量标准，恒压下预电泳 ，后在 恒压下电泳 ，再用 的 进行银染和在 溶液中显色，凝胶用数码相机照相保存。表对 引物信息 引物编号 基序 目标片段 连锁群 正反向引物 （）（）（）（）数据处理参照每对引物的期望扩增片段大小，对每对 引物（即每个标记位点）的扩增产物，按照扩增带的分子量从大到小编号和读取，仅统计期望扩增片段 范围内的片段（此范围外的片段极有可能是非特异产物）。在相同迁移率位置上，有带记为，

8、无带记为，建立原始数据库。每个 位点的多态性信息量（，）按 等 的方法计算，即 ，其中为位点的基因频率，基因频率 某一等位基因数总等 位 基因数；每 个 位点的平均等位基因数总等位基因数（为混合样本单株数）。采用完全随机设计的单因素方差分析，对不同取样量获得的平均等位基因进行多重比较（法）。结果与分析 多态性信息量指数比较针对不同混合样本的电泳图进行人工计带，统计等位基因（等位片段）的种类和频率（图），进而计算 值。对不同取样水平下两个一年生黑麦草品种 分个取样梯度进行统计分析表明，随着单株取样数目的增加，指数逐步趋于稳定。“长江号”和“特高”的变幅分别为 和 （表）。经 法检验，取样梯度间

9、差异不显著（），这与异花授粉植物群体内个体有较高差异有关。但当混合样本为 株时，达到最高值，表明采用此样本能较好地反映出供试品种群体在个 座位上的多态性。等位基因数量差异分析从 电泳图谱 （，）图引物 对“特高”不同 混合样本的扩增结果 注：目的条带区间为 。：表不同混合单株梯度下 多态性信息量比较 材料 引物 单株 混合取样株数 长江号 平均 特高 平均 总体来看，一年生黑麦草两个品种依所取单株数量的多少，在个 座位上扩增出的平均等位基因数量上变化显著。两个品种均以单株 样本获得的平均等位基因数最小，以、和 株混合样本扩增获得的平均等位基因数最大；“长江号”、株混合样本获得的平均等位基因数差

10、异不显著（）；但“特高”的 株和 株混合样本获得的平均等基因位数差异显著（），且 和 株混合样本的平均等位基因数较 株有所下降，这可能与 扩增过程中不同基因型 的量会影响其扩增产物的数量有关。平均等位基因数的变化趋势表明，当各取样水平样本数一致时，等位基因数随样品内混合单株数目的增加而增加，当取样株数增至 株及以上时，取样梯度间无显著差 草业科学（第 卷 期）异，说明 株的样本量即能代表该品种的整体遗传状况（表）。单个 座位上等位基因种类和缺失等位基因频率的比较单株样本获得的等位基因种类最多，以其为参照标准比较混合样本，等位基因种类随取样株数增加而增加，并在取样株数 株后趋于稳定，这表明、和

11、株混合 样本对等位基因扩增的重演性更好。混合叶片 样本均未能检出稀有（基因频率）等位基因，而对于高频率（基因频率）等位基因的漏检数目随混合取样株数的增大而降低（表）。但若用引物 扩增“特高”和 株混合 样本时，未能检测到的等位基因有个，其中包括频率分别为 、和 的个高频等位表不同混合单株梯度下平均等位基因数差异比较 材料 单株 混合取样株数 长江号 特高 注：同行不同小写字母表示在 水平下差异显著。：表“长江号”一年生黑麦草单个 座位上等位基因种类和缺失等位基因频率的比较 引物 合计 平均 注：单株 样品用表示，、和 株叶片混合提取的 分别用、和表示，、和表示相应的混合单株样本缺少的等位基因频

12、率。下同。：，（，）表“特高”一年生黑麦草单个 座位上等位基因种类和缺失等位基因频率的比较 引物 合计 平均 基因（表）。、和 株混合 样本扩增获得的等位基因种类最少，未能检测到的等位基因数目最多，且某些较高频率的等位基因也被漏检，因此不可取。综上，不考虑稀有等位基因（基因频率）的漏检，采用 株混合单株样本能够最大限度检出较高频率（基因频率）的等位基因，可以代表整个群体（表、表）。讨论与结论基于分子标记的单株混合法已经成功运用于一些异花授粉的牧草或草坪草上 。虽然超过个单株的混合样本具有丢失某些个体具有的条带（稀有或低频率基因片段）的风险，但是单株数量较大的混合样本能在次试验中检测到特定群体的

13、大部分遗传信息，这对于比较异质群体的遗传关系非常有用。对于品种鉴定或构建品种指纹时，需要获得的重要信息是品种群体的高频率特异等位基因，因为低频片段不能代表整个品种群体内的大部分单株的遗传状况。另外，有研究，表明等位基因数随混合单株数的增加而增加后趋于稳定，本试验用对引物对“长江号”的扩增结果也吻合了这一点。但“特高”采用、株混合单株样本时，平均等位基因数较 株却略有下降，且对一些高频率等位基因的漏检也有所增加。利用 标记研究玉米（）群体遗传变异时发现，混合样本中的单株数目越多，电泳效果则越不好，也就越不容易区分带型。本研究发现，和 株叶片混合的 样本扩增效果不及 株，这可能与 扩增过程中不同基

14、因型 的量会影响其扩增产物的数量有关。在混合单株样本中，每个单株（基因型）的 量显著少于常规提取的单株，对某些具有低频等位基因的基因型而言，大部分引物将被扩增高频片段的位点结合，导致低频片段的产生效 草业科学（第 卷 期）率很低且信号微弱，很难被常规的凝胶染色检测出来。同时不同单株 间还可能相互竞争同一引物的结合位点，因此会出现、株或更多单株叶片混合的样本扩增效果不及 株的结果。综合 、等位基因数量、等位基因种类及对高频等位基因的漏检情况等的综合分析，本试验得出：利用 标记进行一年生黑麦草遗传多样性分析时的最佳样本容量为 株，这对于分析一年生黑麦草品种鉴定和品种间遗传关系分析具有重要的方法学指

15、导意义。合理的取样策略更是遗传育种和保护生物遗传资源多样性的基础，以上研究结果可为一年生黑麦草种质资源评价和分子育种提供科学依据。参考文献王宇涛，辛国荣，杨中艺，等多花黑麦草的应用研究进展草业科学，（）：季杨，张新全，马啸，等多花黑麦草品种（系）间杂交及其杂种 后 代 遗 传 分 析 草 业 学 报，（）：，：（）：，：，：，：，（），：，（），：，：，：，（），：王红梅，张正英，陈玉梁，等 标记技术及其在植物遗传学中的应用 西北师范大学学报（自然科学版），（）：刘树兵，王洪刚 植物的微卫星标记及其应用 山东农业大学学报（自然科学版），（）：徐莉，赵桂仿微卫星 标记技术及其在遗传多样性研究中的

16、应用 西北植物学报，（）：金燕，卢宝荣 遗传多样性的取样策略 生物多样性，（）：，（）（），：梁宏伟，王长忠，李忠，等 聚丙烯酰胺凝胶快速、高效银染方法的建立遗传，（）：，（），：，：，：，（），（）：，：郭海林，刘建秀，高鹤，等 结缕草属优良品系 指纹图谱的构建草业学报，（）：赵茹野生大豆保护遗传学研究上海：复旦大学，刘雪，李明顺，李新海，等 利用 标记分析玉米群体遗传变异的取样方法 作物学报，（）：（，），（，）：（），（），（），（），（）：；：櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊

17、櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊櫊殸殸殸殸 年月国内市场主要畜产品与饲料价格分析猪肉批发价格东部分别高于中、西部、；牛肉批发价格西部分别高于东、中部、；羊肉批发价格中部分别高于东、西部、；鸡肉批发价格西部分别高于东、中部 、；鸡蛋批发价格中部分别高于东、西部、。进入月份，国内猪肉和鸡蛋批发价格有所下降，环比分别下降 和，牛肉、羊肉和鸡肉批发价格持续小幅上涨，环比分别上涨、和。玉米价格西部分别高于东、中部 、；大豆价格中部分别高于东、西部、；豆粕价格中部分别高于东、西部、；棉粕价格东部分别高于中、西部、。进入月份，玉米批发价格环比上涨，大豆、豆粕和棉粕批发价格环比分别下降、和。表月国内市场主要畜产品批发价格元 畜产品东部地区中部地区西部地区平均猪肉 牛肉 羊肉 鸡肉 鸡蛋 表月国内市场主要饲料价格元饲料东部地区中部地区西部地区平均玉米 大豆 豆粕 棉粕 （兰州大学草地农业科技学院王 化）