当归多糖ASP3的甲基化分析.pdf

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1、Vol.29高 等 学 校 化 学 学 报No.72008年7月CHEM I CAL JOURNAL OF CHI NESE UNI VERSITIES13671370当归多糖ASP3的甲基化分析孙元琳1,3,申瑞玲2,汤 坚3,顾小红3(1.运城学院生命科学系,运城044000;2.郑州轻工业学院食品与生物工程学院,郑州450002;3.江南大学食品科学与技术国家重点实验室,无锡214122)摘要 通过部分酸水解和甲基化分析,结合GC2MS测试手段,对当归多糖ASP3的糖链结构进行了研究.采用012 mol/L三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)对ASP3进行了部分酸

2、水解,对水解前后的多糖组分进行甲基化分析.结果显示:ASP3的糖残基主要由D2GalpA,D2Galp,L2Araf和L2Rhap组成,主链由1,42D2GalpA连接,形成“光滑区”半乳糖醛酸聚糖,由1,42D2GalpA通过O24位与1,22;1,2,42L2Rhap的O22位交替连接形成含有较多分支的“毛发区”鼠李半乳糖醛酸聚糖.5818%的Rhap残基发生O24位取代(1,2,42L2Rhap).由T2,1,52,1,3,52Araf和T2,1,32,1,3,62,1,42,1,4,62D2Galp聚合形成的阿拉伯半乳聚糖、半乳聚糖以及阿拉伯聚糖是ASP3侧链的主要组成,通过Rhap残

3、基的O24位与主链相连.关键词 当归;多糖;甲基化分析;部分酸水解中图分类号 O629 文献标识码 A 文章编号 025120790(2008)0721367204收稿日期:2007211212.基金项目:山西省青年科研基金(批准号:2007021042)、院级重点科研基金(批准号:20060102)和院级学术带头人基金资助.联系人简介:孙元琳,女,博士,副教授,主要从事生物大分子的结构与功能研究.E2mail:当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根,具有补血、活血、调经止痛、润肠通便等功效.近年来的研究发现,当归多糖是其主要的活性成分,具有调节

4、免疫力、抗肿瘤、抗辐射等功效14.果胶多糖是当归多糖的主要组成部分1,其化学组成和糖链结构都比较复杂.甲基化分析是测定多糖分子糖苷键连接方式的有效方法5.对于含有糖醛酸的多糖,如植物果胶或其它酸性多糖,其甲基化分析难度较大.这是因为:(1)甲基化反应在碱性条件下进行,糖醛酸在此过程中易发生 2 消去反应,使与之相连的中性糖产生降解;(2)糖醛酸在酸性条件下不易水解,因此直接甲基化会使糖醛酸以及与其相连的中性糖的信息丢失,影响甲基化分析结果的准确性.由此,本实验采用氘代试剂NaBD4将多糖样品中的Gal A还原为相应的中性糖,同时用氘进行标记(6,6 2d22Gal)以区别于样品中的相应中性糖(

5、Gal),再进行甲基化分析,克服了上述缺陷.1 实验部分1.1 试剂与仪器当归,购自无锡山禾药业有限公司,经鉴定为二级岷归;当归经热水提取,乙醇沉淀,透析,经DEAE2Sepharose CL26B柱层析梯度洗脱,透析,冻干,制得当归多糖ASP3;经Sepharose CL26B柱层析为单一对称峰,表明为分子量相对均一组分1;CMC 12Cyclohexyl232(22morpholinoethyl)2carbodi2imidemethyl2p2toluenesulfonate,Fluka公司;NaBD4,Acpos公司;无水二甲亚砜,Aldrich公司;间羟基联苯,Sigma公司;碘甲烷,浙

6、江海川化学品有限公司;D2O(9919%)、二氯甲烷和三氟乙酸等试剂均为分析纯.Finnigan TraceMS GC2MS分析仪,美国Finnigan公司;GC214A型气相色谱仪,日本Shimad2zu公司.1.2 实验过程1.2.1 部分酸水解 称取约20 mg ASP3于具塞瓶中,分别溶于4 mL 012 mol/L TFA溶液中,于100 水解1 h.水解液对水透析(截留Mw=3500),得到低分子量透过液ASP32PL和高分子量截留液 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights re

7、served.http:/ASP32PH.用N2气除去多余的TFA后,加水复溶,冷冻干燥,得到ASP3部分酸水解产物.1.2.2 羧基还原 称取约5 mgASP3样品,用D2O溶解后,加入CMC充分溶解,调pH=4175;加入NaBD4溶液进行羧基还原;调pH至酸性,对水透析(截留Mw=3500),冷冻干燥后,溶于015 mL水中,除去硼酸根,在N2气氛下挥发至干6.1.2.3 甲基化反应 称取约3 mg经羧基还原的多糖样品于具塞反应瓶中,加入无水DMSO充分溶解后,分别加入NaOH干燥粉末和碘甲烷进行甲基化反应;反应液用二氯甲烷萃取,过Na2SO4柱,收集滤液,在N2气氛下挥发至干7.1.2

8、.4 甲基化产物的水解、还原和乙酰化 将甲基化产物用TFA溶液水解,再用NaBD4进行还原;将还原产物除去硼酸根,在N2气氛下挥发至干;加入015 mL乙酸酐于100 衍生为部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物(PMAA).用二氯甲烷萃取,过Na2SO4柱,收集滤液,进行GC2MS分析810.GC2MS分析条件:OV1701毛细管柱(0125 mm30 m,膜厚0125 mm),程序升温:起始温度150,以3/min的速度升温至250,停留10 min,载气为氦气.EI+源,电子能量70 eV,接口温度250,离子源温度200,检测器电压350 V.2 结果与讨论2.1ASP3及其部分酸水解产物的组成

9、分析ASP3及其部分酸水解产物的单糖组成见表1.结果表明,各级分的单糖组成种类较多,是由不同单糖残基构成的杂多糖.ASP3主要含Gal A,Gal,Ara和Rha以及少量的Man和Glc.由单糖组成可知ASP3是一种酸性果胶多糖.Table 1Sugar composition of fractions from ASP3 by parti al acid hydrolysisFragmentMass fraction of GalA(%)3Molar fraction of the sugar residues(%)RhaAraManGlcGalASP35812711910150140192

10、419ASP32PH76148217012Trace0141912ASP32PL6126Trace311911931462183Content of GalA is calculated.ASP3经012 mol/L TFA水解、透析后,截留液组分ASP32PH的Gal A(76148%)和Rha(217%)的含量较水解前均有所增加,而Ara,Gal,Man和Glc的含量明显下降,表明GalA和Rha位于主链上,不易被弱酸水解;Ara,Gal,Glc及Man位于ASP3多糖分子的支链,水解速度较快.ASP32PH还含有一定量的Gal(1912%),Ara含量极低(012%),表明Gal以较高的

11、聚合度与主链相连,导致其水解速度较慢;而Ara则以还原性末端或低聚寡糖的形式与主链相连或与半乳聚糖末端相连,因此水解比较彻底.透过液ASP32PL中的Gal和Ara含量较高,表明绝大部分的Ara,Gal和Glc已被水解,证明了上述判断.Fig.1Reconstructed total ion chromatograph ofcarboxyl2reduced and methylated ASP32.2ASP3的甲基化分析ASP3经羧基还原及甲基化反应后的P MAA(部分甲基化的糖醇乙酸酯)进行GC2MS分析,GC/MS重构总离子流图谱如图1所示.根据质谱图的质子碎片峰和ASP3的单糖组成,结合

12、标准图谱对各峰进行归属,ASP3的甲基化分析结果见表2.甲基化分析结果表明:(1)ASP3主要由1,42D2GalpA;T2,1,62,1,3,62,1,4,1,4,62D2Galp;T2,1,52,1,3,52Araf以及1,22,1,2,42L2Rhap组成.(2)Rha残基主要以12连接方式存在,其中5818%的Rhap在O24位被取代成为1,2,42Rhap.(3)T2,1,52,1,3,52Araf的摩尔比为62141913181313716%的Araf残基以15连接成为阿拉伯8631高 等 学 校 化 学 学 报 Vol.29 1994-2009 China Academic Jo

13、urnal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/Table 2M ethylation analysis of ASP3LinkagePMAAMolarfraction(%)aMolarfraction(%)btR/min1,223,42Me22Rhap4112121791,2,4232Me2Rhap581816190Total100101176T22,3,52Me32Araf621481441,522,32Me22Araf1913131281,3,5222Me2Araf181316172Total1001013158T2

14、2,3,4,62Me42Galp1419141861,622,3,42Me32Galp3017211011,3,622,42Me22Galp3419251241,422,3,62Me22Galp1213191091,4,622,62Me22Galp71224139Total10010271881,422,3,62Me22Glcp1001018140Total100100173T22,3,4,62Me32Galp(6,6 2d2)710131931,422,3,62Me32Galp(6,6 2d2)931018167Total1001056106a.Relative molar ratio,ca

15、lculated from the ratio of peak areas;b.parentASP3,calculated from the ratio of peak areas.聚糖的主链(1913%的Araf残基为15连接,1813%的Araf残基为13,5连接),其中近一半的Araf残基(4817%)在O23位有分支,表明分支度相对较高;6214%的Araf残基位于非还原性末端,其含量之高表明并非所有的T2Araf残基都连接于阿拉伯聚糖,也可能位于半乳聚糖侧链或直接与主链糖残基相连.(4)T2,1,62,1,3,62,1,4,62,1,42Galp的摩尔比为14193017341971

16、21213,表 明Galp残 基 主 要 为1,62 连 接(7218%),其 中 近 一 半 的Galp残 基(4719%)在O23位有分支;还有1213%的Galp残基以14连接,1419%的Galp残基为非还原性末端.(5)GalpA为ASP3的主要糖单元,其中93%为14连接,7%位于非还原性末端.通过峰面积计算得到的ASP3各单糖含量(表2)与ASP3的组成分析结果(表1)相近,说明羧基还原和甲基化过程都很完全.Table 3M ethylation analysis of ASP32PHLinkagePMAAMolarfraction(%)aMolarfraction(%)btR/

17、min1,223,42Me22Rhap7318121811,2,4232Me2Rhap261216194Total100102143T22,3,52Me32Araf531281471,522,32Me22Araf461813128Total100100134T22,3,4,62Me42Galp4214141891,622,3,42Me32Galp2312211061,3,622,42Me22Galp1212251271,422,3,62Me22Galp1210191131,4,622,62Me22Galp101224142Total10010181861,422,3,62Me22Glcp100

18、1018145Total100100117T22,3,4,62Me32Galp(6,6 2d2)117131951,422,3,62Me32Galp(6,6 2d2)981318175Total1001078124a.Relative molar ratio,calculated from the ratio of peak areas;b.parentASP3,calculated from the ratio of peak areas.2.3 部分酸水解产物ASP32PH的甲基化分析ASP3的甲基化分析提供了糖残基连接方式的总体信息,但它们之间以及主链和支链之间的连接方式还无法确定,因此

19、还需要对ASP3进行部分酸水解,并通过进一步的甲基化分析才能有效地表征其结构1113.ASP3经012 mol/L TFA部分酸水解后得高分子量组分ASP32PH,经羧基还原、甲基化反应后,对PMAA进行GC2MS分析,甲基化分析结果见表3.将ASP32PH与ASP3的甲基化分析结果进行比较,结果显示:(1)ASP32PH的GalpA和Rhap含量(78124%,2143%)较ASP3(56106%,1176%)明显增加,而Araf,Galp和Glcp含量降低,表明部分酸水解使ASP3的大部分中性糖支链水解,使主 链 的GalpA和Rhap含 量 升 高.(2)Rhap残基主要以12糖苷键连接

20、方式存在,其中发生O24位取代的Rhap(1,2,42Rha)占2612%,含 量 较ASP3(5818%)有所降低,表明Araf和Galp等中性糖侧链通过Rhap残基的O24位与主链相连,进而可以推断主链1,42GalpA通过O24位与1,22Rhap及1,2,42Rhap的O22位相连.(3)部分酸水解后,绝大部分Araf和部分Galp残基(主要为1,3,62Galp)被 水 解,含 量 分 别 由 水 解 前 的13158%,27188%(表2)降低到水解后的0134%,18186%(表3).由于T2Araf被大部分水解,同时1,62Galp和1,3,62Galp含量比酸水解前都有所降低

21、,且1,3,62Galp相对于1,62Galp其含量降低幅度较大,所以推测,T2Araf除了与主链Rhap残基的9631No.7孙元琳等:当归多糖ASP3的甲基化分析 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/O24位相连外,还连接于1,62Galp的O23位.因其在酸水解过程中糖苷键最容易被水解,进而使T2Galp的含量(4214%)较酸水解前(1419%)增加,其它Araf则可能以15或13,5连接成短链;1,42 和1,4,62Galp含量在部分酸水解前后变

22、化不大,说明在酸水解过程中较稳定.由此,可以推断,ASP3的侧链包括两种中性聚糖,一种是以1,62Galp为主单元,且部分在O23位(1,3,62Galp)高度分支,以T2Araf残基为末端的阿拉伯半乳聚糖;另一种是以1,42Galp为主单元,部分在O26位(1,4,62Galp)取代的半乳聚糖.(4)GalpA为ASP32PH的主要糖单元,其中9813%的GalpA为14连接,117%为非还原性末端.与ASP3(710%)相比,T2GalpA含量减少,表明T2GalpA位于支链,在部分酸水解过程中其中一部分被水解.加拿大农业部食品研究所的崔武卫教授在甲基化分析过程中给予了指导和帮助,特此致谢

23、!参 考 文 献 1 Sun Y.L.,Tang J.,Gu X.H.,et al.Int.J.Biol.Macromol.J,2005,36:283289 2 Haruki Yamada.PlantaMedicaJ,1990,56:182186 3 Kumazawa Y.,Mizunoe K.Otsuka Y.,et al.Chem.Phar m.Bull.J,1985,33:53515354 4 Lee S.E.,Yang T.A.Am.J.Chin.Med.J,1999,27:387396 5 DellA.Methods in EnzymologyJ,1990,193:647660 6

24、Taylor R.L.,Conrad H.E.Biochem.J,1972,11:13831388 7 Ciucanu I.,Kerek F.Carbohydr.Res.J,1984,131:209217 8 W illatsW.G.T.,McCartneyL.,MackieW.,et al.PlantMol.Biol.J,2001,47:927 9 CuiW.W.,EskinM.N.A.,Biliaderis C.G.,et al.Carbohydr.Res.J,1996,292:17318310Bushneva O.A.,Ovodova R.G.,ShashkovA.S.,et al.Bi

25、ochem.(Moscow)J,2003,68:1360136811Habibi Y.,MahrouzM.,VignonM.R.Carbohydr.Polym.J,2005,60:20521312Wang X.S.,Liu L.,Fang J.N.Carbohydr.Polym.J,2005,60:9510113YU Guang2Li(于广利),WANG Ying(王莹),ZHAO Xia(赵峡),et al.Chem.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)J.2007,28(1):8791M ethylation Analysis of Polysaccharide

26、 ASP3 fromAngelica sinensis(O liv.)D ielsSUN Yuan2Lin1,33,SHEN Rui2Ling2,TANG Jian3,GU Xiao2Hong3(1.Department of Life Science,Yuncheng University,Yuncheng044000,China;2.College of Food and B iological Engineering,Zhenzhou Institute of Light Industry,Zhengzhou450002,China;3.State Key Laboratory of F

27、ood Science and Technology,Jiangnan University,W uxi214122,China)AbstractThe structural featuresof polysaccharide ASP3 were studied by partial acid hydrolysis and methyla2tion methods,combined with GC2MS instrument.ASP3 was hydrolyzed with 012 mol/L trifluoroacetic acidand methylation analysismethod

28、were conducted on the samples.The results indicate that the residuesof sugarconstituents were mainlyD2GalpA,D2Galp,L2ArafandL2Rhap.ASP3 contained the main part of homogalac2turonan fragments as“s mooth regions”with 1,42D2GalpA and rhamnogalacturonan segments as“hairy re2gions”.A total of 5818%Rhapre

29、sidues in the backbone were substituted atO24 position by side chains.T2,1,52,1,3,52Arafand T2,1,62,1,3,62,1,42,1,4,62D2Galpwere linked as arabinogalactan,galactan andarabinan,which were the mainly constitution of the branch.KeywordsAngelica sinensis;Polysaccharides;Methylation analysis;Partial acid hydrolysis(Ed.:H,J,Z)0731高 等 学 校 化 学 学 报 Vol.29 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/