国产球囊导管制作大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型及特.pdf
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1、http:/ 国产球囊导管制作大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型及特性的研究国产球囊导管制作大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型及特性的研究1吴露,张伟,邓常青 湖南中医药大学病理生理实验室,湖南长沙(410007)摘摘 要:目的要:目的 探讨国产2.0F球囊导管取代进口2F Fogarty球囊导管致大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型的特点及可行性。方法方法 用国产2.0F球囊导管建立大鼠主动脉内皮剥脱模型,分别采用组织形态学和免疫组织化学方法,观察大鼠血管内皮剥脱后内膜增生的情况及血管平滑肌细胞(VSMC)表型标志基因SM-肌动蛋白(SM-actin)、增殖细胞核抗原(PCNA)及型胶原(collagen
2、I)的表达活性。结果结果 与假手术组比较,术后模型7天组内膜增生不明显,SM-actin及PCNA表达也均不明显;14天内膜有轻度增厚,SM-actin及PCNA表达均明显增强;21天内膜呈进行性弥漫性增厚,SM-actin表达仍明显增高,但PCNA表达不明显。模型7天、14天、21天组collagen表达与假手术组比较,差异无显著性(p0.05)。结论结论 国产2.0F球囊导管致大鼠主动脉损伤后,血管内膜增生引起再狭窄以1421天较为明显,细胞增殖也明显,表明其可以取代进口2F Fogarty球囊导管运用于血管内膜实验。关键词:关键词:球囊导管;血管平滑肌细胞;形态计量学;SM-肌动蛋白;增
3、殖细胞核抗原;型胶原 经皮冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)能明显减轻心血管疾病的症状,给患者带来福音。但术后的再狭窄(restenosis,RS)发生率仍然居高不下,影响了PTCA的远期疗效。球囊扩张后再狭窄的发生机制包括血管弹性回缩,损伤部位血栓形成,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖、迁移和细胞外基质积聚等1,这些都是PTCA后再狭窄重要的病理生理学基础。目前,有关防治PTCA后再狭窄的发生发展是心血管疾病领域的热点问题。由于进口的球囊导管价格十分昂贵
4、,且很难匹配应用于小动物模型,为建立可靠、价廉的方法,我们采用国产2.0F球囊导管取代进口的球囊导管,建立大鼠主动脉损伤血管内膜增生模型,并对该模型的特点及可行性进行了研究。1 材料和方法材料和方法 1.1 材料材料 1.1.1 动物动物 SD大鼠由湖南省卫生防疫站实验动物中心提供。合格证号:医动字第20010号;1.1.2 球囊导管球囊导管 球囊由天津中拓乳胶科技发展有限公司提供;导管(5针头改装成)由河北医科大学基础医学研究所生物化学室温进坤教授、韩梅教授惠赠。国产2.0F球囊导管由球囊和导管组装而成:将2cm长的球囊套在导管一端,在导管出水孔的上下两个楔形槽分别用细丝线扎紧;导管另一端连
5、接16号注射针并固定好。球囊导管准备好后,在尾端注入生理盐水充盈球囊(黄豆大小),回缩自如即可(见图1)。1基金项目:国家自然科学基金资助项目(No:30572301)作者简介:吴露(1981-),女,硕士研究生,湖南中医药大学病理生理学实验室。通讯作者。电话:0731-8458258。EMail:-1-http:/ B C A D 图1 球囊导管及其装配图示 注:A表示球囊 B表示导管 C表示组装好的国产2.0F球囊导管 D表示球囊导管充盈后(标记处)1.1.3 试剂试剂 增殖细胞核抗原(The proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫组化染色试剂
6、盒、兔抗大鼠型胶原多克隆抗体、兔抗大鼠SM-actin多克隆抗体、DAB显色试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供,SP-9001免疫组化染色试剂盒、多聚赖氨酸由北京中杉金桥生物技术有限公司提供,其他试剂为进口或国产分析纯。1.2 动物模型的建立方法及分组动物模型的建立方法及分组 选用体重30O350g的雄性SD大鼠,水合氯醛麻醉后,作颈部正中切口,手术暴露及游离左颈总动脉11.5cm,远心端结扎,在左颈总动脉近心端用动脉夹阻断后,于颈总动脉远心端剪一“V”形切口,插入国产2.0F球囊导管,仔细操纵导管越过主动脉弓入胸,下至腹主动脉,深度约为67cm。自导管尾端注入生理盐水0.40.6ml充盈
7、球囊,使球囊膨胀至回拉时有较明显的阻力感,保持阻力一致回拉导管至主动脉弓处,如此重复3次,旋转180使球囊转至血管腔的另一面,依上法再重复3次,充分剥脱内皮。完成后撤出导管,结扎左颈总动脉近心端血管以止血,逐层缝合肌肉、皮下层及皮肤层。术后腹腔注射青霉素(PNC)20万单位消炎抗菌,连用3天。将动物随机分为假手术组、模型7天组、模型14天组和模型21天组。假手术组只进行手术操作,但不插入球囊损伤。分别于术后不同时间点取损伤部位胸主动脉段进行形态学观察及SM-actin、PCNA及collagen免疫组化检测。1.3 形态学及血管形态学计量指标的测定形态学及血管形态学计量指标的测定 大鼠麻醉后,
8、放血处死,打开胸腔,在内皮剥脱段相同部位取血管1cm,4多聚甲醛固定24小时,乙醇梯度脱水,石蜡垂直定向包埋,每段血管间断均匀切片810张后,常规HE染色,每只大鼠标本不同时间点各随机取3片进行光镜观察、照相和图像分析。按组织学划分,内弹力膜以内为内膜,内弹力膜与外弹力膜之间为中膜。以MIAS医学图像分析系统分别测量外弹力膜内面积、内弹力膜内面积、管腔面积、外弹力膜周径、内弹力膜周径以及管腔周径。并在此基础上计算出中膜面积=(外弹力膜内面积-内弹力膜内面积)、内膜面积=(内弹力膜内面积-管腔面积)、中膜厚度=(外弹力膜周径-内弹力膜周径)/2、内膜厚度=(内弹力膜周径-管腔周径)/2、内膜面积
9、增生比率=(内膜面积)/(内膜面积+中膜面积)100、内膜厚度增生比率=(内膜厚度)/(内膜厚度+中膜厚度)100、内膜中膜面积比、内膜中膜厚度比。-2-1.4 免疫组织化学分析免疫组织化学分析 分别对SM-actin、PCNA及collagen进行免疫组织化学染色,镜下观察相关抗原的表达变化,以细胞内出现棕黄色颗粒为阳性表达信号。每个指标在假手术组、模型7天组、模型14天组和模型21天组都设立一个阴性对照(阴性对照以PBS替代一抗)。用图像分析系统对表达信号进行分析。结果以灰度值表示,灰度值越小,表示相关的抗原表达越强。1.5 统计学分析统计学分析 应用 SPSS11.5 统计学软件进行分析
10、,实验结果所有数据均采用均数标准差(x)表示,多组间均数比较用单因素方差分析,组间两两比较方差齐者用 LSD 检验,方差不齐者用 DunnettT3检验。2 结果结果 2.1 国产球囊致大鼠主动脉损伤内皮剥脱后血管形态学变化国产球囊致大鼠主动脉损伤内皮剥脱后血管形态学变化 假手术组大鼠主动脉壁各层结构完整,管腔面积无缩小,内膜光滑无增生,中膜VSMC排列整齐。手术后7天模型组增生不明显;14天内膜有增厚,管腔面积有缩小;21天内膜呈进行性弥漫性增厚,管腔面积明显缩小,增厚的内膜中以VSMC为主,中膜细胞排列紊乱,表明内皮剥脱后21天已形成典型的血管再狭窄动物模型(见图2)。AB C D 图2
11、血管形态 注:A假手术组;B模型7天组;C模型14天组;D模型21天组(HE染色,100)。2.2 血管形态学计量指标比较血管形态学计量指标比较 各组中膜面积和中膜厚度差异均无显著性意义(P0.05)。模型7天组内膜面积、内膜厚度、内膜面积增生比率、内膜厚度增生比率、内膜/中膜面积比、内膜/中膜厚度比与假手术组比较差异均无显著性意义(P0.05)。模型14天组上述各指标均有所增加,但与假手术组和模型7天组比较差异均无显著性意义(P0.05)。模型21天组内膜显著增生,其内膜面积、内膜厚度、内膜面积增生比率、内膜厚度增生比率、内膜/中膜面积比、内膜/中膜厚度比均显著高于假手术组和模型7天、14天
12、组(P0.01)。见表1。表1 血管形态学计量指标的各组比较(x)指标 假手术组(n=5)模型7天组(n=4)模型14天(n=5)模型21天组(n=4)中膜面积(m2)11934.11815.9 14194.01852.2 14800.33110.3 11801.01503.6 内膜面积(m2)0.00.0 0.00.0 1206.81593.2 4146.11079.4 中膜厚度(m)15.92.6 18.22.6 17.01.2 15.82.2 内膜厚度(m)0.00.0 0.00.0 2.22.3 5.42.7 内膜面积增生比率()0.00.0 0.00.0 7.09.2 25.85.5
13、-3-http:/ 内膜厚度增生比率()0.00.0 0.00.0 10.010.3 24.911.7 内膜/中膜面积比 0.00.0 0.00.0 0.10.1 0.40.1 内膜/中膜厚度比 0.00.0 0.00.0 0.10.1 0.40.2 注:与假手术组比P0.01,与7天模型组比P0.01,与14天模型组比P0.01。2.3 各组各组PCNA表达的比较表达的比较 假手术组未见到阳性细胞;模型7天组仅可见到极少量的阳性细胞;模型14天组可见到大量的阳性细胞,PCNA表达非常明显,分布在新生内膜和中膜中;模型21天组仍可见到较多的阳性细胞,但不及模型14天组显著(见图3)。各组定量比
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