建立体外重建人体皮肤模型刺激试验的验证标准.pdf

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1、建立体外重建人体皮肤模型刺激试验的验证标准文程树军，步犁秦瑶广东出入境检验检疫技术中心食品实验室。广州5 10 6 2 3摘要：科学的验证是替代试验方法从开发到法规接受之间的必然过程，近年来，体外重建皮肤替代物的开发和验证得到了快速的发展，出现了各种标准化程度不同的商用皮肤模型和检测方法，用于代替体内皮肤刺激或腐蚀试验。在遵循验证的普遍规则的基础上，结合皮肤模型及预期毒性终点的特点，有必要建立统一的验证标准，以规范人体皮肤模型的开发。使之成为法规认可的替代方法。并应用于常规检测试验。关键词：皮肤替代物，皮肤刺激，验证，标准V a l i d a t i o nC r i t e r i o n

2、f o rR e c o n s t r u c tH u m a nS k i nM O d e It oS k i nI r r i t a t i o nC H E N GS h u-j u n B uL i Q i nY a oF o o dL a bo f G u a n g d o n gE n t r y-E x i tI n s p e c t i o na n dQ u a r a n t i n eT e c h n o l o g yC e n t e r G u a n g Z h o u5 10 6 2 3。C h i n aA b s t r a c t：F r o

3、 md e v e l o p m e n tt oa c c e p t e db yr e g u l a t i o n so fa l t e r n a t i v em e t h o d s i ti sn e c e s s i t yf o rs c i e n t i f i cv a l i d a t i o np r o c e s s R e c e n ty e a r s t h es t u d ya n dv a l i d a t i o no fr e c o n s t r u c th u m a ns k i nm o d e Ii nv i t

4、r ow a sp r o g r e s s e da n db e u s e df o rr e p l a c es k i ni r r i t a t i o no rc o r r o s i o nt e s ti f lv i v o F o l l o w e dt h eg e n e r a Ip r i n c i p l eo fv a l i d a t i o n。c o m b i n ew i t ht h ec h a r a c t e r i s t i co fs k i ne q u i v a l e n ta n de n d p o i n

5、to fs k i nt o x i c i t y，i ti sn e c e s s i t yt oe s t a b l i s ht h ec o n s o l i d a t e dv a l i d a t i o nc r i t e d o nt or e g u l a t et h er e s e a r c h，s t a n d a r d i z a t i o n，j n t e r-o ri n t r a v a l i d a t i o n a n da c c e p tb yg o v e r n m e n t V a l i d a t e d

6、m e t h o d sc a nb eu s e di nr o u t i n et e s t i n g K e yw o r d s：s k i ne q u i v a l e n t，s k i ni r r i t a t i o n，v a l i d a t i o n，c r i t e r i o n广b 肤刺激性指的是受试物作用于皮肤产生的 o 局部可逆性的毒性反应，皮肤刺激试验是化学物质毒性评价常规项目。传统皮肤刺激试验利用活体动物皮肤进行，不仅要求一定数量和质量的动物，而且试验周期长，个体反应差异大，某些反应造成动物极大的痛苦，不符合3 R 原则uJ。近年来，体

7、外重建皮肤替代物(R H E)的开发和验证得到了快速的发展，并逐渐形成商品和成为制订体外检测标准的依据，如E p i s k i n、E p i d e r m 等睇J。我国人工皮肤的研究虽然起步晚，但近年来也取得了较快的发展，女D A l t S k i n【3 J。为使新开发的试验方法被管理部门认可，需要进行严格的科学验证过程，欧洲、美国在验证方面做了大量的工作，后来的日本基本上参照了欧洲的做法。为适应当前动物试验替代技术发展的国际形势，有必要建立我国替代方法的验证标准，以满足国内的需要并与国际通行做法接轨。本研究拟建立一套完整的皮肤刺激试验的验证标准，以评价试验方法的可靠性和相关性。一替

8、代方法验证的通用目的验证是指“为着明确的目的，对特定的试验、方法、程序或评价的相关性和可靠性建立程序的过程”。相关性(r e l e v a n c e)是指试验方法的科学价值，即对于所关注效应的相关程度，以及为了特定的目的，某种方法是否适用和具有科学意义；可靠性(r e l i a b i l i t y)是试验结果的可重复性，即实验室内和不同实验室间能否在一定的准确度内正常使用某种方法，可靠性通过实验室内和实验室间的再现性，以及实验室内的重复性进行评价。验证是联系研究和规则之间的纽带，这种连接要能确保替代方法能被科学地验证，使之能最终被产品审批或安全评价的管理部门接受认可。考虑一个新制订或

9、修订的试验方法对于风险评估管理目的是否有效，一般需要符合基本的验证原则和基准，即S o l n a 原则【3】o=重建人体皮肤模型的要求过去1 0 年中，开发新的毒理学试验的替代方法，包括重建人类皮肤模型得到了快速的发展。但是替代基金项目：检验检疫行业标准制订计划，广东省科技计划项目(2 0 0 9 8 0 6 0 3 0 0 0 1 3)作者简介：程树军，男，博士，副研究员，硕士生导师，研究方向：动物试验替代方法及标准化1 8 6C H I N Ac o s M E T t c sR E v E w方法被管理毒理学所接受的进展却很慢。主要的障碍是存在这样一个事实，管理者认为对于一个新的试验方

10、法，只有与目前所用的动物试验的结果一致，能够对化学品进行分类和标识，这一替代方法才能被接受。而且，O E C D 已表明，只有经过连续的试验验证研究，体外毒性试验才能被认可用于管理的目的。2 0 0 7 年列为o E C D 4 3 l 的皮肤腐蚀试验的人工皮肤模型方法推荐了E p i s k i n 和E p i d e r m 两种皮肤模型，但并没有禁止其它模型的使用，而是提出了模型所应达到的要求。用于皮肤刺激或腐蚀试验的皮肤模型应满足以下基本条件和功能条件：1 皮肤模型应满足的基本条件应使用人体角质形成细胞构建皮肤模型的上皮，功能性的角质层下面应含有多层有活性上皮细胞。皮肤模型可以具有一

11、个基质层。角质层应是含有必需脂质成份的多层结构，以形成功能性屏障抵抗细胞毒性物质的快速渗透。模型的封闭特性应可以阻止角质层周围的物质进入到活性组织内部。理想的皮肤模型其角质层周围应不存在受试物进入活性组织的通道，否则无法模拟皮肤暴露的实际情况。皮肤模型应避免被细菌(包括支原体)和真菌污染。2 皮肤模型的功能性要求包括五个方面：细胞活性：范围可用M T T 或其他代谢转换有关的活体染料进行定量测定；阴性对照的皮肤组织提取或溶解的染料的光密度(D)值至少应是单独使用溶剂提取的D 值的2 0 倍。阴性对照的皮肤组织应能在测试期间保持稳定培养(组织活性保持稳定)。屏障功能：角质层应能充分阻止某些细胞毒

12、性化学物(3 女D 1 T r i t o nX-1 0 0)的快速渗透。该性能可以通过使细胞活性降低5 0(E 1 5 0)的暴露时间来评估(女l l E p i D e r m1 M 和E P I S K I N 模型所需的暴露时间应 2 h)。形态特征：组织学检查重建皮肤模型，应具备表皮(皮肤样)结构，包括功能性角质层。重复性：皮肤模型组织最好在不同实验室问、长时间内显示出良好的重复性；而且，根据所选的试验方案，该皮肤组织应能正确预测已知标准参考化学品的腐蚀性或刺激性。质量控制：每批次的皮肤模型都应满足上述的质控要求，3 女 1 E p i D e r m1 M 模型用l T r i t

13、 o nX-1 0 0 作用，平均可接受E T s o 应为6 7 h，接受范围为4 8 h一8 7 h。E P I S K I N 模型用S L S 作用1 8 h，平均可接受I C 5 0 为2 3 2 m g m I，接受范围为1 0 m g m l 3 0 m g m l。不符合质量要求的不能用于实验。3 重建皮肤模型特征的分析方法重建皮肤模型特征的分析方法有很多，重点应分析模型的组织形态、脂质组成和屏障功能。(1)形态特征分析完整的重建皮肤模型应具有多层的角质细胞构成的表皮结构，它由基底层、棘层、颗粒层和角质层组成。可以分析不同分化标志物的表达获取更详细的信息，如角蛋白、i n v

14、o l u c r i n，l o r i c i n，f i l l a g r i n。采用冰冻断裂电镜技术可较客观地反映角质层细胞间脂质的结构，减少传统电镜标本制作因素的影响。透射电镜观察时，改用四氧化钌固定角质层，可大大提高细胞间隙经透射电镜扫描威像的分辨率，进而提供角质层致密层和颗粒层之间的移行区脂质组织的信息。差示扫描量热量法通过测量加热后样本吸收或释放的热量，以此反映角质层构成成分(脂质和角蛋白)不同状态变迁时所需的能量，不同水合状态的角质层所需能量不同。运用x 射线衍射分析，小角度X 射线衍射可提供脂质片层重复特性的资料，宽角x 射线衍射可提供片层中关于脂质的来源的结构信息。运

15、用傅立叶变换红外分光镜，利用脂质碱基链吸收红外光波长的不同，可获得其微观结构动态特性的资料。(2)屏障功能测定两种方法可用于重建皮肤屏障功能的测定，一种方法是采用M i l l i c e l l-E R S 测定仪检测跨表皮电阻(T E E R)，可用于评价角质层的致密性。另一种方法是用时间一过程测定法来评价，即测定细胞活性减少5 0 所需的暴露时间(测定E T s o 的值)。(3)皮肤表面脂质测定重建皮肤特征的分析重点应放在角质层的结构及其脂类的组成方面。角质层脂类组成的不规则是导致一些皮肤模型的通透性大于正常皮肤的原因。基于高效薄层色谱分析技术(H P T L C)对角质层脂类进行半定

16、量分析是一项有效且相对简单的方法。利用皮脂能在有机溶剂中溶解的特点，将皮脂用有机溶剂(已烷、乙醚等)洗脱下来，待溶剂挥发后，残余物即为皮脂样品，皮脂样品可用称量法定量或用色谱法进行组成分析。三皮肤刺激试验方法的验证标准根据S o l n a 原则，通过对试验方法的验证获得一系列有意义的评价指标，进而得到相关性和可靠性的数据和评价结论。一般来讲，组成一项替代试验方法应包括3 项基本要素，要素l 是方法的独特性，关键步骤描述和质量控制，这些内容可以确保新方法所基于的理念是和预期的目的相一致。要素2 是参考化学物清单，用于评价实验方法的准确性和可靠性。要素3 是可靠性和预测能力(准确性)应达到的目标

17、值，也即当评估使用参考物质最小清单时，实验方法应满足的标准H j。1 8 7C H I N Ac o s M E T t c sR E v|E W1 实验方法的科学原理和局限性体外R H E 皮肤刺激实验的科学原理基于这样一个前提：刺激物质通过扩散穿透角质层细胞，并且对底层细胞产生细胞毒性，而体外重建的人体皮肤模型具有与体内相似的组织结构和屏障功能。可以提供评价刺激性的屏障结构和机制基础【6】。经已验证的方法表明，人体重组皮肤替代物可以将受试物按刺激性和非刺激性正确分类，但不能提供充分的关于皮肤腐蚀性的信息，也不能对G S H 系统所定义的温和刺激物的进行次类划分；R H E 适用于固体，液体

18、，半固体和蜡。液体可以是水溶性或非水溶性的，固体可溶于水或不溶于水。2 试验过程受试物和对照物的涂抹：固体和液体受试物，必须有足够的接触剂量能将表皮表面均匀覆盖，又要避免涂抹过量，最少应使用2 5ul c m 2 或(2 5 m g c m 2)。固体物质应碾成粉末，涂抹前需将皮肤表面湿润，进行测试。在暴露时间结束后，应用合适的缓冲溶液或0 9 的氯化钠将受试物冲洗掉。建议阳性对照(P C)物是5 的十二烷基硫酸钠，阴性对照物(N C)质是水或P B S。细胞活性检测：组织样本置于合适浓度的M T T溶液中(例如：0 3 一l m g m 1)3 小时。用溶剂(例如：异丙醇或酸性异丙醇)将产生

19、的蓝色甲媵沉淀物从组织中萃取，甲躜浓缩物用带通滤波器在5 7 0 n m 3 0 n m 的波长测定o D 值。化学物质的光学性能或它在M T T 中的化学反应可能会干预实验，导致对活性不真实的估计(因为实验物质可能会阻止或颠倒颜色的产生或导致颜色的产生)。归类于这些干扰的非特定的颜色不应超过阴性对照的3 0。如果该实验物质的非特定实验产生的颜色的O D 值大于阴性对照值3 0 的，可考虑该实验物质不适合该实验方法。实验过程：一个受试物同时在三个复制组织上进行实验，每个实验加入三个组织进行N C 处理，再加三个复制组织进行P C 处理，这样一组称为一个完整“运行”。试验结束对结果解释和作出预测

20、，每个受试物的实验结果必须根据N C 值校正，N C 值设定为1 0 0 细胞活性。结果解释和预测模型：细胞活性百分比值的临界值是用以区分分类(刺激性)和非分类实验物质的依据，如果组织活性在暴露和处理孵育后是等于或者低于5 0 的，该物质可以被认为对皮肤具有刺激性。如果组织活性在暴露和处理孵育后是高于5 0 的，则该实验物质可考虑“无需分类”。实验验收标准：实验和对照物质的验收标准，只有当标准差(S D)从三个或更多同时试验的复制组织1 8 8C H I N Ac o s M E T l c sR E v|E w获得时，并且是在9 5 可信区间内(例如：S D s l 8)，那么这个实验才是有

21、效的。如果每次运行每个实验物质只有两个复制组织在进行验证研究的操作，两个复制组织的差异值必须等于或小于2 0，N C 验收标准，最小活性必须证实在实验验收标准内，o D 值必须不低于历史建立的范围；P C 的验收标准，阳性物必须为已知确认的刺激物，复制组织对刺激物的反应范围必须在已建立的范围内，并且三个复制组织的标准差必须低于已确定的最大值。如果没有达到实验和对照物的验收标准，该实验物质必须进行再次运行；如果没有达到阴性对照和阳性对照的验收标准，整个运行必须重复进行。3 试验方法运行的质控一种受试物在足够数量复制的组织上同时进行实验；同时设P C 和N C，它们也需要在足够数量的复制组织上进行

22、。所有受试物、N C 和P C 的实验一起称为一次“运行”。如果三个实验组成部分其中有一个部分是无效的，那么整个运行都是无效的(称为无效运行程序)，无论是实验部分还是对照部分。如果在一次运行中需要同时测试一个以上的受试物，那么在足够数量的复制组织上运行一组P C、N C 也是可行的。4 参考化学物清单表1 提供了用于皮肤刺激验证的2 0 种参考化学物(R C)的分类，它们的选择是基于以下标准：可由商业途径获得；它可以代表D r a i z e 束0 激评分的所有范围(从无刺激性到强刺激性)；化学结构容易辨认的；它们能代表验证所要求的重现性和预测能力本身不是剧毒物质(例如：致癌物或生殖系统毒性)

23、，无需高昂处理费。表中所列的参考化学物是试验方法满足科学验证的可靠性的最低要求。表2 所列参考化学物代表不同的化学分类，并且也代表了D r a i z e Y F l J 激评分的所有范围(从无刺激到强刺激)。这些化学物包括1 0 个由G H S 分类为2 类的化学物和1 0 个无分类的化学物喁J。5 可验证的评价指标反应验证评价的最可靠的两个指标是可信度和预测能力(准确性)，其数值的得出必须符合科学的条件和准则。验证的过程：对可信度和准确度进行估计的前提是必须将R H E 模型的批次差异控制在合理的范围，这样才能保证操作在长时间内的重现性。验证过程是采用2 0 种参考物质在三个不同实验室进行

24、，验证标准需符合以下三条要求：(1)所有2 0 种参考化学物至少需完成一个完整的运行(即受试物、N C 和P C 一起的一次试验过程)；(2)在至少3 个参与实验室中，每个实验室最少需完成8 5 的运行程序(即对于2 0 种化学物，化学物C A S 编号物理性状体内评分G H S 体内分类1 一溴4 氯丁烷6 9 4 0-7 8 9液体O尤分类酞酸：已酯8 4-6 6 2液体O无分炎萘己酸8 6 墙7 3网体O尤分类苯氧琏乙酸烯内酯7 4 9 3 7 4 5液体0-3尢分类异内醇6 7 6 3 0液体O 3尢分类4 一f F 雏硫代笨甲醛3 4 4 6-8 9 7液体l尤分类碗脂酸 I 酯1

25、1 2 6 1-8【】体l无分类庚J。5 8 7 0 9 3 9液体1 7尤分类水杨陵已酯6 2 5 9 7 6 3液体2尤分类肉村醛1 0 4 5 5 2液体2尢分类j】：癸酣1 1 2-3 0 l液体2 _ 32 类兔耳草醛10 3 9 5 7液体2 32 类溴己烷1 1 1 2 5 1液体2 72 类2 一氯甲基一3。5 一二甲基一4 一甲氧8 6 6 0 4-7 5 3固体2 72 类基吡啶赫酸虢一+内琏硫6 2 9 19 6液体32 类碳酸氧钾(5 a q)1 3 1 0 5 8 3液体32 类苯硫酚，5 一(1。1-二甲基)7 3 4 0-9 0-l液体3 32 类2 甲肇1 一甲

26、肇一3 一苯基一1 一哌嗪5 2 7 1 2 7 2围体3 32 类庚酶1 1 1 7 1 7液体3 42 类四氯乙烯1 2 7 1 8-4液体42 类允许一个实验室中出现3 个无效运行程序)；(3)至少三个实验室中的所有运行程序最少需完成9 0(即参与验证的3 个实验室测试2 0 种化学物，允许不超过6 个无效运行程序)。可信度(重现性)和预测能力(准确度)的计算条件：只有从完整运行程序中得出的数据才有资格进行计算，以求出实验方法的实验室内变异范围(W L V)，实验室间变异范围(B L V)和预测能力(准确性)；只有在所有参与实验室内完成运行程序的化学物的数据库才有资格进行实验方法的B L

27、 V 的计算；准确度是在从不同的参与实验室获得2 0 种R C 的独立实验室预测的基础上计算的。可信度：通过实验室的重现性(wL V)和实验室间的重现性(B L V)来表述，实验方法的w L V 的计算是在验证研究期间，在R C 实验的基础上，每个参与的实验室独立计算出的，在单个实验室中独立运行2 0个R C 的分类的一致性必须等于或高于9 0。实验方法的B L V 的计算是在验证研究期间，在数据符合运算条件的前提下，对于2 0 个R C 的最终分类的一致性是通过不同的参与实验室(最少3 个)获得的，其值必须等于或高于8 0。预测能力(准确性)：通过计算灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率和总精

28、度来验证的。灵敏度应该等于或高于8 0；特异性应等于或高于7 0；总精确度应等于或高于7 5。随着细胞培养和组织工程技术的发展，体外重建皮肤替代物已不再是十分困难的工作，工业化生产的皮肤模型已经达到相对成熟(如可用性、标准化和价格)，但这些皮肤模型的制备成功并不意味着它们可代替动物试验用于毒性评价，特别是用于法规监管目的还需完成科学的验证程序。目前已完成验证并被法规认可的皮肤替代模型也只有3 5 种，因此，对于皮肤替代物的应用，一方面是需要加快模型的验证速度，另一方面是需要严格执行验证程序。对于我国方兴未艾的皮肤模型研究热潮，应尽快建立相应的验证程序，以保证替代方法研究的严肃性和科学性。圜参考

29、文献：f 1 I 程树军，焦红皮肤毒性检验中替代模型的研究进展和应用评价U 1 毒理学杂志2 0 0 6：2 0(4)：2 5 4-2 5 6 f 2 F l e t c h e rS T，B a k e rV A，F e n t e mJ H，e ta 1 G e n ge x p r e s s i o na n a l y s i so fE p i d e r mf o l l o w i n ge x p o s u r et OS L Su s i n gc D N Am i c r o a r r a y sU】T o x i c o l i nV i t r o，2 0 0 1

30、，15(4-5)：3 9 3 3 9 8【3 I 程树军，黄锦桃，李海标，等体外构建的皮肤模#_ 9 2 I n s p e c t s k i nI 修复裸鼠全层皮肤缺损U】中山大学学报(医学科学版)，2 0 0 9，3 0(2)：1 3 2-13 5 f 4 H a r t u n gT，B r e m e rS，C a s a t iS，e ta 1 Am o d u l a ra p p r o a c ht Ot h eE C V A Mp r i n c i p l e so nt e s tv a l i d i t y A l t e r n L a b A h i m，2 0

31、 0 4，3 2，4 6 7-4 7 2 f 5 1 F e n t e mI H，A r c h e rG E B，B a l l sM，e ta 1 T h eE C V A Mi n t e r n a t i o n a lv a l i d a t i o ns t u d yo ni nv i t r ot e s t sf o rs k i nc o r r o s i v i t y 2 R e s u l t sa n de v a l u a t i o nb yt h eM a n a g e m e n tT e a m T o x i c o l o g yi nV

32、i t r o，1 9 9 8，1 2，4 8 3 5 2 4 f 6 1 O E C D2 0 0 4 G u i d e l i n e sf o rt h eT e s t i n go fC h e m i c a l s，N O 4 3 1：I nV i t r oS k i nC o r r o s i o n：H u m a nS k i n M o d e lT e S t P a r i s，F r a n c e：O E C D，8P7 S p i e l m a n nH，L i e b s c hM V a l i d a t i o nS u c c e s s e

33、s：C h e m i c a l s A T L A，2 0 0 2，3 0，S u p p l e m e n t2，3 3 4 0，8 j W o r t hA P，B a l l sM T h ei m p o r t a n c eo ft h ep r e d i c t i o nm o d e li nt h ed e v e l o p m e n ta n dv a l i d a t i o no fa l t e r n a t i v et e s t s A T L A，2 0 0 1，2 9，1 3 5 1 4 3 f 9 W o r t hAP，B a l l

34、sM T h er o l eo fE c V A Mi np r o m o t i n gt h er e g u l a t o r ya c c e p t a n c eo fa l t e r n a t i v em e t h o d si nt h eE u r o p e a nU n i o n A k e r n L a b A n i m 2 0 0 1，2 9，5 2 5-5 3 5 1 8 9c H i Ac o s M E T|c sR E v|E w建立体外重建人体皮肤模型刺激试验的验证标准建立体外重建人体皮肤模型刺激试验的验证标准作者：程树军，步犁，秦瑶作者单位：广东出入境检验检疫技术中心食品实验室,广州 510623 本文链接：http:/