种芦荟样品中蒽醌类成分的分析研究_陈欣霞.pdf

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1、天然产物研究与开发Nat Prod Res Dev2009,21:8172821,848文章编号:100126880(2009)0520817206 收稿日期:2008211210 接受日期:2009207231 基金项目:2005年度广东省中医药管理局计划项目(1050163);2005年度珠海市科技计划项目(PC20051072)3 通讯作者Tel:86220233847966;E2mail:HPLC2DAD和LC2MS/MS法对各种芦荟样品中蒽醌类成分的分析研究陈欣霞1,张宇航2,林 颖1,谢志勇1,万金志131中山大学药学院药物分析实验室,广州510006;2珠海市第五人民医院,珠海5

2、19000摘 要:采用HPLC2DAD和LC2MS/MS对各种芦荟样品中蒽醌类成分进行鉴定,在此基础上建立了同时测定各种芦荟样品中芦荟苷与芦荟大黄素含量的方法。采用Nucleodur2silica色谱柱(250 mm34.6 mm,5m),流动相A为甲醇 2 醋酸(5001.70),B为水 2 醋酸(5001.70),梯度洗脱,流速1.0 mL/min,DAD扫描波长范围为190370 nm,紫外检测波长为254和356 nm。质谱离子源为ESI,采用全扫描一级质谱和选择离子全扫描二级质谱两种方式同时测定。结果表明:各种芦荟样品中主要的蒽醌类成分为芦荟苷A、B与芦荟大黄素,未检测到大黄素、大黄

3、酸、大黄素甲醚、大黄酚;芦荟干粉中所含的芦荟苷含量最高。该法准确、可靠、重现性好,可行性高。关键词:芦荟;芦荟苷;芦荟大黄素;HPLC2DAD;LC2MS/MS中图分类号:R284.1;Q946文献标识码:AAnalysis of Anthraquinones in D ifferent Samples ofAloe with HPLC2DAD and LC2M S/M SCHEN Xin2xia1,ZHANG Yu2hang2,L IN Ying1,XIE Zhi2yong1,WAN Jin2zhi131Laboratory for Phar m aceutical Analysis and

4、 Quality Evaluation,School of Phar maceutical Sciences,Sun Yat2sen University,Guangzhou 510006,China;2The No.5Peoples Hospital of Zhuhai,Zhuhai 519000,ChinaAbstract:A HPLC2DAD and LC2MS/MS method was established not only for the assay of anthraquinones but also forthe determination of aloin and aloe

5、2emodin in different samples of aloe.The analysiswas perfor med on Nucleodur2silicaC18(250 mm34.6 mm,5m)column with a methanol2water(containing 0.4%acetic acid)gradient at ambient tem2perament.The flow ratewas1.0 mL/min,thewavelength scanned from 1902370 nm and the detectionwas at254 nm and356 nm.Th

6、e ionic source ofLC2MSwas ESI.Sampleswere analyzed in t womodes:MS andMS/MS full canmodes.AloinA,B and aloe2emodin were the main anthraquinones in different samples of aloe while rhein,emodin,chrysophanol andphyscion were not found;the aloe powder contained the highest amount of aloin.The method cou

7、ld be used to control thequality of aloe product.Key words:aloe;aloin;aloe2emodin;HPLC2DAD;LC2MS/MS 芦荟属于百合科(Liliaceae)芦荟属(A loeL.)多年生常绿肉质植物,作为药用历史悠久,现代研究表明芦荟具有抗癌、抗炎、抗病毒、抗菌杀虫、清热保肝、增强免疫等功效1。其中库拉索芦荟是最为常用的药用芦荟。芦荟含有多种活性成分,包括:蒽醌类衍生物、糖类衍生物、氨基酸和有机酸类、维生素和甾族化合物、酶类化合物、无机物质和多肽等2。研究表明,存在于芦荟叶片底部及表皮附近的蒽醌类化合物是芦荟最主要

8、的有机活性成分,其中芦荟苷和芦荟大黄素是最基本的成分之一,这些物质在生物体内具有高度的活性。芦荟不仅作为药材使用,还是食品、化妆品的重要原料,2008年我国卫生部已批准芦荟凝胶作新资源食品,今后各种以芦荟凝胶为原料的食品添加剂将广泛地应用于食品工业中。蒽醌类物质是芦荟的主要标志性成分,特别芦荟苷和芦荟大黄素是评价芦荟品质优劣以及安全性的重要依据。故确定芦荟样品中蒽醌类物质的种类和准确检测其含量具有重要意义。本实验采用HPLC2DAD和LC2MS/MS法对芦荟药材干粉、芦荟叶黄汁冷冻干燥物、库拉索全叶烘干粉、芦荟凝胶等样品中蒽醌类成分进行了定性分析,建立了同时测定各种芦荟样品中芦荟苷与芦荟大黄素

9、的方法,对各种样品中的芦荟苷与芦荟大黄素进行了定量分析。1 仪器与试剂1.1 仪器高效液相色谱仪:Waters1525二元分析泵、Wa2ters2996光电二极管阵列检测器、Waters717自动进样器、Waters柱温箱、Empower工作站;TSQ型三重四极杆液相色谱 2 串联质谱联用仪(美国San Jose公司),Finnigan SurveyorMS泵、Finnigan Surveyor自动进样器、Xcalibur1.3工作站、LC Quan数据处理软件(美国Thermo Finnigan公司)。1.2 试剂甲醇(色谱纯,TED I A公司),95%乙醇(分析纯,上海申翔化学试剂有限公

10、司),超纯水,醋酸(分析纯,广州化学试剂厂),芦荟苷、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚对照品均购自中国药品生物制品检定所,批号分别为1107872200504、1107952200605、1107962200513、1107562200110、07572200206、1107582200509,芦荟叶黄汁冷冻干燥物、三年生新鲜芦荟叶(珠海金志芦荟开发研究有限公司),库拉索芦荟全叶烘干粉(云南元江万绿生物有限公司),芦荟药材粉(云南元江万绿生物有限公司)。2 方法与结果2.1 色谱条件HPLC条件:固定相:Nucleodur2silica色谱柱(250 mm34.6 mm,5m);

11、流动相:A为甲醇 2 醋酸(500:1.70),B为水 2 醋酸(500:1.70),梯度洗脱,洗脱程序为:035 min,20%A80%A,80%B20%B;3650 min,80%A95%A,20%B5%B;5155 min,95%A,5%B;流速:1.0 mL/min;柱温为25,DAD扫描波长范围为190370 nm,紫外检测波长为254和356 nm,进样量为10L。质谱条件:质谱离子源为ESI,雾化气压为35psi,干燥气流量为11 mL/min,干燥温度为350,质谱扫描质量范围为501000。采用全扫描一级质谱和选择离子全扫描二级质谱两种方式同时测定。2.2 对照品溶液的制备分

12、别取芦荟苷、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚对照品适量,精密称定,分别置于10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得一定浓度的各对照品溶液。再分别取芦荟苷、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚对照品溶液适量,置于10 mL的容量瓶中,混匀,得到一定浓度的六种对照品混合溶液。2.3 供试品溶液的制备2.3.1 芦荟甲醇浸膏供试品的制备称取芦荟药材粉适量,置于1000 mL烧杯中,加入适量甲醇(以略高于药粉平面为宜),搅匀,超声30 min后转置自制渗漉筒中,收集渗漉液,所得渗漉液在50 水浴中通过旋转蒸发,得到含有蒽醌类成分的 芦 荟 甲 醇 浸 膏,外 观

13、棕 黑 色,糊 状,含 水16180%。取该浸膏的样品适量,精密称定,分别置于20mL容量瓶中,加甲醇适量,超声提取15 min,冷却至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得到各浓度的供试品溶液。用0.45m的微孔滤膜滤过,滤液备用。2.3.2 不同芦荟样品供试品的制备分别取芦荟药材粉、芦荟叶黄汁冷冻干燥物和库拉索芦荟全叶烘干粉的粉末状样品适量,精密称定,分别置于20 mL容量瓶中,加甲醇适量,超声提取30 min,超声后离心(3000 r/min)5 min,冷却至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,得到各浓度的供试品溶液。用0.45m的微孔滤膜滤过,滤液备用。取新鲜芦荟叶(三年生)的去皮叶肉组织适量,

14、加入3倍量的95%乙醇,放置过夜后超声30 min,超声后3000 r/min离心5 min,抽取上清于水浴70 挥干,加50%甲醇2 mL溶解,离心。上清用0.45m的微孔滤膜滤过,得芦荟凝胶供试品溶液。3 定性分析3.1 保留时间取2.2项下的对照品混合溶液,按2.1项下色谱条件进样检测,得到各标准物质的保留时间。在相同色谱条件下取2.3供试品溶液进样检测,与对照品溶液的色谱图比较,根据保留时间初步确定供试品中所含的蒽醌种类。3.2 紫外光谱利用二极管阵列检测器对各对照品溶液和各供试品溶液进行检测,在保留时间相同的基础上,对样品中蒽醌类物质的峰进行扫描,与对照品的紫外光谱图进行对比。818

15、天然产物研究与开发 Vol121 结果表明,芦荟苷保留时间为22.8 min(1),芦荟大黄素为30.7 min(2),大黄酸为34.5 min(3),大黄素为38.2 min(4),大黄酚为40.8 min(5),大黄素甲醚为43.8 min(6)。芦荟苷对照品在297、356 nm处有吸收峰,芦荟大黄素在257、286 nm处有吸收峰,与文献3 基本一致。对比样品色谱图和紫外光谱图,确定芦荟药材粉中含有芦荟苷和芦荟大黄素,其余蒽醌类成分未检测到(检测限为0.13g/mL,以芦荟苷计算。);库拉索芦荟全叶烘干粉、芦荟叶黄汁冷冻干燥物和芦荟凝胶中含有芦荟苷,其余蒽醌类成分未检测到;在保留时间为

16、22.0 min处,有一峰浓度与芦荟苷相近,疑为芦荟苷的同分异图3 芦荟苷A、B的全扫描二级质谱图Fig13Full scanMS2spectrum of aloin B,A918Vol121 陈欣霞等:HPLC2DAD和LC2MS/MS法对各种芦荟样品中蒽醌类成分的分析研究构体。保留时间22.0和22.8 min二个峰的紫外光谱见图2。3.3LC/MS/MS分析经LC2MS/MS分析芦荟苷和疑似异构体峰,发现两者分子离子峰、碎片离子相同,确定为芦荟苷异构体。质谱见图3,确定分别为芦荟苷A、B。4 定量分析 根据3项下的结果,针对供试品中所含的芦荟苷与芦荟大黄素建立定量分析方法。按2.3项下制

17、备供试品溶液,测定芦荟药材粉、芦荟叶黄汁冷冻干燥物、库拉索芦荟全叶烘干粉和芦荟凝胶中芦荟苷与芦荟大黄素的含量。4.1 检测限的确证精确量取2.2项下芦荟苷对照品适量,分别配制浓度为13.16、1.32、0.13、0.06g/mL的对照品溶液,按上述色谱条件进样检测,在芦荟苷浓度为0.13g/mL时信躁比为3.11,表明在该色谱条件下芦荟苷的检测限为0.13g/mL。4.2 标准曲线与线性范围分别配制浓度为0.0251、0.0501、0.1003、012005、0.4010、0.8020 mg/mL芦荟苷系列标准溶液和0.0020、0.0040、0.0080、0.0160、0.0320、0108

18、00 mg/mL芦荟大黄素系列标准溶液,按上述色谱条件分别进样10L,以峰面积(A)为纵坐标,以进样浓度(c)为横坐标绘制标准曲线,得到芦荟苷的回归方程为A=255492+17394470c,r=1.000,线性范围为0.02510.8020 mg/mL,芦荟大黄素的回归方程为A=256526+91803146c,r=1.000,线性范围为0.00200.0800 mg/mL。4.3 精密度试验分别称取芦荟苷、芦荟大黄素对照品适量,按212项下制备对照品溶液,重复进样6次,以峰面积分别计算两种成分的RSD值,芦荟苷为1143%,芦荟大黄素为0177%,精密度良好。4.4 重复性试验称取芦荟甲醇

19、浸膏提取物6份,按213项下制备供试品溶液,进样检测,根据峰面积计算两种成分的RSD值,芦 荟 苷 为0178%,芦 荟 大 黄 素 为1197%,重复性良好。4.5 溶液稳定性试验取213项下芦荟甲醇浸膏提取物于室温下放置,分别于0、2、4、6、8 h进样检测,以芦荟苷与芦荟大黄素的峰 面积分别计 算RSD值,芦 荟苷 为2114%,芦荟大黄素为5141%,证明供试品溶液在8h内稳定。4.6 回收率试验称取芦荟甲醇浸膏提取物共9份,精密称定,置于20 mL容量瓶中,分别加入高、中、低三种浓度的芦荟苷、芦荟大黄素混合对照品各3份(高浓度为供试品溶液中所测物质浓度的120%,中浓度为100%,低

20、浓度为80%),按213项下制备供试品溶液,进样检测,计算回收率及RSD值,得到芦荟苷的平均回收率为9719%,RSD值为1123%,芦荟大黄素的平均回收率为10218%,RSD值为1195%(表1)。表1 加样回收率实验结果Table 1Result of recovery test浓度Content(mg/mL)加入量Added value(mg/mL)测得量Deter mined value(mg/mL)回收率Recovery(%)平均回收率Average recovery(%)RSD(%)芦荟苷Aloin0.16860.03200.163096.797.91.230.24030.040

21、00.235097.80.23920.04810.237099.1芦荟0.00150.00060.0015102.1102.81.95大黄素Aloe2emodin0.00190.00080.0019101.30.00200.00100.0021105.14.7 样品含量测定分别称取不同来源的芦荟样品适量,按2.3项下制备供试品溶液,进样检测,计算含量,结果见表2。芦荟药材粉中芦荟苷的含量远远高于芦荟全叶烘干粉、芦荟叶黄汁冷冻干燥物和芦荟凝胶。以上四种来源的样品中除了芦荟药材粉,其他三种样品都未检测到芦荟大黄素。028天然产物研究与开发 Vol121表2 不同芦荟样品含量测定结果Table 2D

22、etermination results of the samples样品Sample芦荟苷BAloin B芦荟苷AAloin A芦荟大黄素Aloe2emodin含量Content(mg/g)含量Content(mg/g)含量Content(mg/g)芦荟叶黄汁冷冻干燥物1.001.12-库拉索芦荟1.091.50-芦荟药材粉97.58110.716.67芦荟凝胶0.010.03-5 讨论5.1 检测样品的选择由于芦荟蒽醌类成分中含有某些毒性成分(如芦荟大黄素),未经有关部门批准不得用于食品添加。本研究选择了芦荟药材干粉、芦荟叶黄汁冷冻干燥物、库拉索全叶烘干粉、芦荟凝胶进行蒽醌类成分的确定与芦

23、荟苷、芦荟大黄素的含量测定。芦荟叶黄汁冷冻干燥物、芦荟药材干粉是芦荟药用材料,测定其中主要有效成分的含量对控制芦荟的药材质量有重要意义;而芦荟凝胶和全叶烘干粉则常用作食品、保健品的添加剂,测定芦荟凝胶和全叶烘干粉中蒽醌类成分有助于控制芦荟在食品、保健品中的使用,保障消费者的身体健康。5.2 各种样品主要蒽醌类成分的确定本研究根据样品与标准品色谱的保留时间和紫外光谱的比较,基本确定各种芦荟样品中所含的蒽醌类成分主要为芦荟苷与芦荟大黄素。有文献报道在芦荟的冷冻干燥物中检测到芦荟苷异构体A、B4,5,本实验根据LC2MS/MS结果进一步确定除了冷冻干燥物外,在芦荟药材干粉、芦荟汁冷冻干燥物、库拉索全

24、叶烘干粉和芦荟凝胶中均含有芦荟苷异构体A、B。本实验同时检测了购于某药店的药典芦荟,未检测到芦荟苷。市售药典芦荟为芦荟植物叶的汁液浓缩干燥物,可能是制备的手段使原植物中含有的芦荟苷发生了变化,或是所购得的药典芦荟有假。另有文献报道在芦荟样品中发现大黄酚2,本实验并未检测到,可能与生长地域不同有关,具体原因有待进一步探究。5.3 方法的建立与色谱条件的选择本研究建立了同时检测各种芦荟样品中芦荟苷和芦荟大黄素含量的高效液相色谱法。在摸索合适的色谱条件和预试验的过程中,分别对流动相、洗脱方式、检测波长、等条件进行了优化。发现采用甲醇 2 水 2 醋酸的洗脱系统,在35 min之内从20%甲醇线性梯度

25、到80%甲醇,再在15 min之内线性梯度到95%甲醇,并等度洗脱至55 min的洗脱方式能够使不同芦荟样品的各个峰都分开,达到很好的分离效果,且所测目标物芦荟苷峰和芦荟大黄素峰理论塔板数、分离度、拖尾因子等参数均符合要求;而在356 nm处检测芦荟苷峰、在254 nm处检测芦荟大黄素峰则杂质干扰少,灵敏度较高。本方法能使芦荟中的其他物质也得到较好的分离,为日后对其他成分进行含量分析奠定基础。5.4 其他处理方式的尝试本研究对芦荟全叶粉的甲醇、丙酮、乙醇提取物中芦荟苷与芦荟大黄素分别进行含量测定,结果显示丙酮提取物中芦荟苷和芦荟大黄素的含量比较高,初步说明这种提取方法比较有效,提取的芦荟苷、芦

26、荟大黄素比较完全,但考虑到丙酮毒性较大,故仍采用甲醇和乙醇提取;同时分析了新鲜芦荟汁放置后上层溶液与下层沉淀部分中芦荟苷与芦荟大黄素的含量,结果发现新鲜芦荟汁放置后上层溶液干燥物的芦荟苷和芦荟大黄素的含量都比下层沉淀的高;本文也对比过用100%甲醇和用50%甲醇溶解样品,检测发现甲醇的浓度对测得样品中芦荟苷的含量没有多大影响。本文对不同芦荟样品中主要蒽醌类物质进行了定性分析,建立了同时测定芦荟样品中芦荟苷和芦荟大黄素的HPLC法,对比了不同来源芦荟样品中这两种成分的含量差异,为扩大芦荟资源的应用和各种芦荟样品的质量控制提供了一种准确、可靠、重现性好,可行性高的方法。参考文献1Lu ZG(卢朝国

27、),Wang HZ(王红专),Li YH(李燕红),etal.Simultaneous determination of Aloin and Aloe2emodin inAloe by HPLC.J Zhengzhou Univ,M ed Sci(郑州大学学报,医学版),2008,43:5842586.2Chen GH(陈国和),Liu YQ(刘玉鑫),Zhang XS(张新申),et al.Chemical components of aloe and their separationand measurements.Chem Res Appl(化学研究与应用),2002,14(2):133

28、2135.3YangWY(杨文远),Wang TY(王天勇).Simultaneous de2termination of aloe2emodin and emodin inCassiatoraL.byreversed2phase high performanceliquidchromatography.Chin J Anal Lab(分析试验室),1997,16(2):55257.(下转第848页)128Vol121 陈欣霞等:HPLC2DAD和LC2MS/MS法对各种芦荟样品中蒽醌类成分的分析研究3 讨论 半夏在中医临床上有诸多应用,具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结和消肿止痛的功效。现代临

29、床研究证明,半夏对多种肿瘤细胞有增殖抑制作用2。一些丝氨酸蛋白酶抑制剂具有良好的抗肿瘤活性7,定性(图5)与定量(表4)检测结果表明,RPTI具有抑制人低分化胃腺癌BGC2823增殖的活性,由此判定,RPTI是半夏的一种抗肿瘤活性成分。但是,RPTI对肿瘤细胞BCAP237(乳腺癌)、A549(肺癌)、Hela(宫颈癌)、S MCC27721(肝癌)、T24(膀胱癌),以及对非肿瘤细胞人正常成纤维细胞的增殖均无明显影响(数据未展示)。RPTI的N端前6个氨基酸残基顺序与慈菇丝氨酸蛋白酶抑制剂的N端序列高度同源,同源性达83%以上;RPTI对胰蛋白酶活性具有较强的抑制作用,摩尔抑制比约为12.8

30、2,表明RPTI与胰蛋白酶之间有较强的亲和力。由此判定,RPTI是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。机体的多种消化酶为丝氨酸蛋白酶,这类酶的活性一旦受到抑制,常常引起腹胀、呕吐、水泻等症状,与生半夏毒副作用的临床症状相似。由此推断,RPTI为半夏的毒性成分之一,也是一种降逆止呕的药效成分。因为,适当的抑制消化酶活性,可以适度调理和改善机体的消化功能,减轻消化酶对消化道病变部位的进一步消化损伤。多种半夏蛋白的精氨酸或赖氨酸残基可与胰蛋白酶疏水性口袋底部的天冬氨酸残基结合,可以降低以胰蛋白酶为配体的亲和层析的特异性和分辨率。鉴于RPTI与胰蛋白酶之间具有较强的亲和力,亲和层析时先用高浓度的盐溶液(1 mol

31、/LNaCl)洗柱,可以洗掉大部分非特异性结合的杂蛋白,然后用酸水洗脱吸附的RPTI组分,能够显著提高以胰蛋白酶为配体的亲和层析法分离RPTI的分辨率。Sephadex G250生成的p1和p2活性峰没有分开,仅p1峰前半部分,即1012号试管的合并组分经SDS2PAGE检测显示基本均一的条带,将纯化的RPTI组分进一步电泳后转膜,剪下主带测序,以保证RPTI的纯度。丝氨酸蛋白酶抑制剂在抗肿瘤的临床应用中显示了良好前景。但是,以亲和层析为主从生半夏中分离纯化RPTI的方法难以实现产业化。课题组将进一步根据RPTI的N端氨基酸序列设计兼并引物,从鲜品半夏中克隆其成熟肽的cDNA序列,完成RPTI

32、基因工程表达生产与更加深入的结构和功能分析。参考文献1Kobayashi K,Gotoh J,Hirashima Y,et al.Inter2 2trypsin in2hibitor bound to tumor cells is cleaved into the heavy chainsand the light chain on the cell surface.B io Chem,1996,217:11362211367.2Yoon JS,Seo JC,Han S W.Pinelliae rhizoma herbal2acupunc2ture solution induced apopt

33、osis in human cervical cancercells,SNU217.Am J Chin M ed,2006,34:4012408.3Ausubel F,Brent R,et al.Concise Guidebook of ExperimentMolecularBiology.Beijing:Science Press,1995.4Lowry OH,Rosebrough NJ,et al.Protein measurement withfolin phenol reagent.J B iochem,1951,193:2652275.5Wang J(王竞),Kang Z(康庄),D

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35、 Dev(天然产物研究与开发),2005,17:1432146.7Kobayashi H,Shinohara H,Cotoh J,et al.Anti2metastastictherapy by urinary trypsin inhibitor in combination with ananti2cancer agent.B r J Cancer,1995,72:113121137.(上接第821页)4Park MK,Park JH,Kim NY,et al.Analysis of 13 phenoliccompounds inA loespecies by high performanc

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