音乐电针对抑郁模型大鼠行为学和海马BDNF、c-fos+蛋白.pdf

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1、余瑾 男广州中医药大学康复医学教研室 主任 副教授，硕士研究生导师康复学科负责人 联系电话：13922307233 地址：广州机场路 12 号大院 63802 房510405音乐电针对抑郁模型大鼠行为学和海马音乐电针对抑郁模型大鼠行为学和海马 BDNF、c-fos 蛋白表达的影响蛋白表达的影响余瑾余瑾 1 林小姬林小姬 2 古琨如古琨如 1 廖铭斌廖铭斌 1 唐纯志唐纯志 11 广州中医药大学针灸推拿学院广州中医药大学针灸推拿学院2 广州荣康医院摘要广州荣康医院摘要：目的目的 本研究探讨音乐电针对抑郁模型大鼠行为学、海马 BDNF、c-fos 蛋白表达的影响，旨在阐明音乐电针治疗抑郁症的获效机

2、理。方法方法 清洁级 SD 雄性大鼠 40 只，按体重随机分为正常组、模型组、音乐电针组、百忧解组，每组 10 只。模型组、音乐电针组与百忧解组，每组 10 只，三组均采用多种因素刺激大鼠制备抑郁模型，模型组除造模外不给予任何治疗，音乐电针组在造模的同时开始取“百会”、“三阴交”穴进行音乐电针治疗，每日 1 次，每次 20 分钟，连续 21 天。结果 1.造模后的大鼠在规定时间内的水平运动次数和垂直运动次数正常对照组比较均明显减少，体重增加减慢，而音乐电针组可明显增加水平运动次数和垂直运动次数，减少悬尾后的不动时间，表明音乐电针可以显著改善大鼠的抑郁状态。2.抑郁模型组阳性细胞数量明显减少，且

3、多数细胞呈空泡状，胞浆着色很浅。而音乐电针及百忧解治疗组 BDNF染色明显好于模型组，模型组大鼠海马神经元 c-fos 阳性细胞数明显增加，经音乐电针及百忧解治疗后，大鼠海马神经元 c-fos 阳性细胞数明显减少。结论 1.音乐电针针刺“百会”、“三阴交”穴可以干预抑郁症状的出现，表现出较好的抗抑郁效果。2.音乐电针针刺“百会”、“三阴交”穴可以增加抑郁模型大鼠海马 BDNF 阳性神经元数量，改善神经元形态。提示音乐电针对BDNF 的影响以及对海马神经元的保护作用是电针治疗抑郁症的机理之一。主题词：音乐电针；抑郁症；神经可塑性；脑源性神经营养因子；行为学Influence of Music E

4、lectricalAcupuncture onChanges of Behavior in Depression Ratsand BDNF、c-fos Expression in Rat Hippocampus.Yujin,Linxiaoji,Gukunru,Liaomingbin,TangchunzhiAcupuncture and Tuina College ofGuangZhou University of ChineseMedicineAbstract:ObjectiveAbstract:Objective Our research focused on observing the e

5、ffect of Music electricalacupuncture on changes of behavior in depression rats,furthermore,exploring somepossible mechanisms by investigating the influence of Music electrical acupuncture onBDNF、c-fos expression in rat hippocampus.MethodsMethods Forty male rats were evenlyrandomized into control,mod

6、el and Music electrical acupuncture groups.Depressionmodel was established by using chronic unpredictable mild stress(CUMS)stimulation(forced ice-water swimming,electic shock,tail-clamping,etc)combined with lonelyraising for 21 days.Music electrical acupuncture was applied to Baihui（GV 20）andSanyinj

7、iao(SP6),once daily,continuously for 21 days,The rats body weight,open-fieldtest were recorded on the1stand 21stday during experiments respectively.After the余瑾 男广州中医药大学康复医学教研室 主任 副教授，硕士研究生导师康复学科负责人 联系电话：13922307233 地址：广州机场路 12 号大院 63802 房510405behavior observation,BDNF expression changes of hippocam

8、pus in Music electricalacupuncture intervened depression model rats were observed.ResultResult Clinical study-bothMusic electrical acupuncture and Fluoxetine were effective in the treatment of majordepression.For relieving endogenous depression,Fluoxetine was better.The score onthe syndrome of anxie

9、ty somatization(SAS)were significantly lower in Music electricalacupuncture group than the Fluoxetine group.The score on Asberg Rating Scale ofFluoxetine group was significantly higher than Music electrical acupuncture group.Since Fluoxetine has more side effects than Music electrical acupuncture,th

10、erefore,the efficacy index of Music electrical acupuncture group is significantly higher thanFluoxetine group.Experiment study-compared with control group,the weight increasewas slow and the activities of rats in open-field test in model group were significantlydecreased.Music electrical acupuncture

11、 can improve behavioral disorder of depressionrats.Musicelectricalacupuncturecanincreasethelevelsofmonoamineneurotransmitter in central nervous system.Immuno-histochemistry results showed thatthe number of Brain-derived neurotrophic factor(BDNF)positive neurons in hippocampusof depressed rats in mod

12、el group was much more than the control group.Music electricalacupuncture can increase the number and improve the appearance of BDNF neurons in thedepressed rats,but decrease the number and influence the appearance of c-fos neuronsin the depressed rats.ConclusionConclusion1.Music electrical acupunct

13、ure at“Baihui(GV 20)and Sanyinjiao(SP6)could prevent or suppress the onset of depreession and raise the volume of srcroseintake in depression rats.2.Music electrical acupuncture at“Bai hui”(GV 20)andSanyinjiao(SP6)could increase the expression of BDNF mRNA in hippocampus of depressionrat,thus protec

14、t the neuron in hippocampus.Key Words:Key Words:Music electrical acupuncture；Depression；Neuroplasticity；BDNF；Behavior随着社会经济的发展，生活节奏加快，人们的压力增加，情感冲击加大，造成抑郁症发病率不断升高。抑郁症终生患病率为 6.1%-9.5%，约 13%-20%的人一生曾有过一次或一次以上抑郁体验，15%的重度抑郁症可因自杀而导致死亡。抑郁症造成的疾病负担列为全球疾病总负担第四位，估计到 2020 年将升至第二位，仅次于冠心病，被称为新世纪健康的第二杀手。因此，寻找有效的治疗

15、方法、阐明其作用机制，是摆在医学科学工作者们面前一项迫切而艰巨的任务。2007年，我们将 40 只清洁级 SD 雄性大鼠，分为正常组、模型组、音乐电针组、百忧解组进行实验，结果发现音乐电针有较好的抗抑郁效果，其对 BDNF 的影响以及对海马神经元的保护作用是电针余瑾 男广州中医药大学康复医学教研室 主任 副教授，硕士研究生导师康复学科负责人 联系电话：13922307233 地址：广州机场路 12 号大院 63802 房510405治疗抑郁症的机理之一。1材料与方法1.1 实验动物清洁级 SD 雄性大鼠 40 只，体重 200-230g，由广州中医药大学实验动物中心提供。1.2 实验器材立柱体

16、敞箱，高 40cm，长宽均为 80cm，周壁为黑色，底面由面积相等的 25 块组成；足底电击器（自制）；冷水游泳大桶；夹子；做昼夜颠倒的黑布；华佗牌 30 号 1 寸毫针；音乐电针治疗仪；帆布手套；计时器。1.3 实验动物分组将实验动物置于 7:00-9:00 光照、19：00-7：00 黑暗的实验室中，驯养 1 周后，按体重随机分为正常组，在同样的环境中饲养；模型组、音乐电针组、百忧解组，每组 10 只。1.4 慢性应激抑郁大鼠模型的制备从第八天起，正常组每笼饲养 4 只，其余组每笼饲养 1 只。除正常组外，其他各组动物开始接受 21 天各种不同的应激，包括电击足底（电流强度 1.0mA,每

17、隔 1 分钟刺激 1 次，每次持续 10s，共 30 次）、冰水游泳（4，5 分钟）、摇晃（1 次/s，15 分钟）、夹尾（1 分钟）、禁水（24 小时）、禁食（48 小时）和昼夜颠倒等，每天随机安排一种，平均每种刺激使用 2 次。1.5 治疗：在造模的同时开始治疗。音乐电针组：参照李忠仁1主编的实验针灸学（中国中医药出版社，2003 年 1 月）取“百会”、左侧“三阴交”穴，以 30 号 1 寸毫针进行针刺，“百会”平刺 0.3-0.5 寸，“三阴交”直刺 0.5-0.8 寸。针柄接音乐电针治疗仪，选角调音乐（广东民乐“步步高”），刺激强度以局部皮肤肌肉轻微颤动为宜，每日 1 次，每次 20

18、 分钟，连续 21 天。百忧解组：给予百忧解（50mg/Kg/d）灌胃治疗，每日 1 次，连续 21 天。模型组除造模外不给予任何治疗令其自然恢复，正常组既不造模也不给予任何治疗。1.6检测指标和方法1.6.1观察各组大鼠的精神、进食、体重等一般状态。每只动物于造模第 1 天及第 21 天分别称体重。1.6.2 旷场实验(Openfield tes)：木制箱 100cml00cm50 cm，周壁、底面用笔划分成面积相等的 25 块方格，沿墙格称外周格，其余为中央格。将动物放在正中央格，观察 3 min 内活动情况。以动物穿越底面块数为水平活动(crossing)得分，以直立次数为垂直活动(re

19、aring)得分。在实验开始第 1 天和第 21 天分别进行测定。每只动物仅进行 1 次，每次时间为 3 分钟。1.6.3鼠尾悬挂实验将大鼠尾端 1 cm 的部位贴在一水平木板上(木板距离地面约 1 m)，使动物呈现倒挂状。悬挂两侧用木板隔开动物视线，动物为克服不正常的体位而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性“不动”显示“失望”状态。计算 6 min 内大鼠不动的时间(motionlesstime，MT)，并观察大鼠挣扎幅度。余瑾 男广州中医药大学康复医学教研室 主任 副教授，硕士研究生导师康复学科负责人 联系电话：13922307233 地址：广州机场路 12 号大院 63802 房51

20、04051.7 试剂与仪器BDNF、c-fos 免疫组化试剂盒购自中山生物试剂有限公司广州分公司，BDNF、c-fos 一抗工作浓度为 1:100。二抗、三抗、DAB 工作液购自武汉博士德公司。光镜观察各组海马 BDNF、c-fos阳性神经元。各组每只动物取相同序号的 5 张切片，每张随机取 2 个视野，在 400光镜下用北京航空航天大学图像分析仪（2.4 版本）进行分析。1.8 免疫组织化学染色免疫组织化学染色过程：1载玻片经防脱片剂 Poly-Lysine 处理；2切片常规脱蜡；33%H2O2室温作用 10 分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗 3 次；4热修复抗原：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓

21、冲液(PH6.0),微波炉加热至沸后断电，间隔 5-10分钟，反复 1-2 次。冷却后 PBS(PH7.2-7.6)洗涤 2 次；5滴加 5%的 BSA 封闭液，室温 20 分钟。甩去多余液体，不洗；6滴加 1:100 稀释的一抗（抗 BDNF），37放置 1 小时。PBS 洗涤 2 分钟3 次；7滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG，3720 分钟。PBS 洗涤 2 分钟3 次；8滴加试剂 SABC，3720 分钟。PBS 洗涤 5 分钟4 次；DAB 显色：使用 DAB 显色试剂盒（AR1022）。取 1ml 蒸馏水，加入试剂盒中 ABC 试剂各 1 滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时

22、间，一般在 5-30 分钟之间。蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染。脱水，透明，封片，显微镜观察。1.9 统计学处理所得数据均以xs 表示，采用 SPSS11.0 统计软件分析数据，采用单因素方差分析：方差齐时采用 LSD 法（最小显著差异法）；方差不齐时采用 Dunnett T3 法。方差分析齐性检验水平10.05,显著性检验水平20.05。2.结果2.1 造模后第 1 天，各组大鼠体重无明显差别。随着造模时间的后移，模型组大鼠饮食、饮水量减少，毛失去光泽，明显消瘦，体重增加不明显。而音乐电针组大鼠体重增加较模型组明显(P0.01)，详见表 1。2.2 各组大鼠 Openfield 行为的测定研究结

23、果显示，模型组与正常对照组比较，水平运动次数和垂直运动次数均明显减少(P0.01)。音乐电针组旷场活动明显增强，与模型组相比，具有显著性差异(P0.05 或 P0.01)，详见表 2。2.3 各组大鼠鼠尾悬挂实验的测定研究结果显示，模型组悬尾后的不动时间明显长于正常对照组和音乐电针组及百忧解组。音乐电针组不动时间有所减少，与模型组相比，具有显著性差异(P0.01)，详见表 3。2.4 各组大鼠海马 BDNF、c-fos 阳性神经元数及平均光密度的测定余瑾 男广州中医药大学康复医学教研室 主任 副教授，硕士研究生导师康复学科负责人 联系电话：13922307233 地址：广州机场路 12 号大院

24、 63802 房510405音乐电针对海马神经元 BDNF、c-fos 蛋白表达的影响,正常对照组大鼠海马结构中，BDNF阳性细胞表达很强。细胞排列密集，着色深，有的有较长的突起。抑郁模型组阳性细胞数量明显减少，且多数细胞呈空泡状，胞浆着色很浅。而音乐电针及百忧解治疗组 BDNF 染色明显好于模型组，经图像分析处理有显著性差异(P0.01)，且与正常组类似。与正常组比较，模型组大鼠海马神经元 c-fos 阳性细胞数明显增加(P0.01)，经音乐电针及百忧解治疗后，大鼠海马神经元 c-fos 阳性细胞数明显减少(P0.01)，并接近正常组(详见表 4、5)。表 1 各组大鼠实验第 21 天体重增

25、加克数的比较(sx)组别n体重增加（克）正常组10121.54 士 10.20模型组1036.178.42*音乐电针组1073.02 土 8.36百忧解组10100.23 土 23.45注：与正常组比较*P0.01；与模型组比较P0.05表 2 各组大鼠 Open-field 行为测定结果比较(sx)组别n水平活动(Crossing)垂直活动(Rearing)正常组1061.06 士 7.3422.085.32模型组1025.768.15*7.36 土 2.02*音乐电针组1053.06 土 6.4321.383.87百忧解组1055.25 土 6.0820.29 土 4.19注：与正常组比较

26、*P0.01；与模型组比较P0.01表 3 各组大鼠鼠尾悬挂实验的测定结果比较(sx)组别ntMT/s正常组10154.28 士 41.07模型组10241.3740.06*音乐电针组10148.28 土 55.21百忧解组10151.71 土 52.36注：与正常组比较*P0.05；与模型组比较P0.01表 4各组大鼠海马 BDNF、c-fos 阳性神经元数的比较(sx)组别例数BDNFc-fos正常组1023.32 士 4.2610.46 土 3.18模型组1011.713.57*28.425.64*余瑾 男广州中医药大学康复医学教研室 主任 副教授，硕士研究生导师康复学科负责人 联系电话

27、：13922307233 地址：广州机场路 12 号大院 63802 房510405音乐电针组1018.22 土 3.7014.253.47药物组1019.15 土 4.1812.954.31注：与正常组比较：*P0.05；与模型组比较：p0.05表 5各组大鼠海马 BDNF、c-fos 阳性神经元的平均光密度(sx)组别例数BDNFc-fos正常组1015.51 士 1.729.24 土 1.67模型组107.351.42*18.241.32*音乐电针组1013.87 土 1.8412.141.26药物组1015.62 土 1.9110.271.35注：与正常组比较：*P0.05；与模型组比

28、较：p0.053.讨论3.1 音乐电针治疗抑郁症选用音乐的依据角音（3-Mi）是将舌缩发音，有舒畅中正的韵味，属木，配合肝脏。角调类音乐就是指以角音为主旋律音调的音乐，其性条达，具有悠扬舒畅、生气蓬勃的特点，给人以兴奋、激情、勇往直前的感觉，代表乐曲如草木青青、绿叶迎风、梅花三弄、平沙落雁、步步高、行街、春风得意、江南好以及江苏民歌一粒下土万担收等。类经附翼云：“角音，羽所生。其声在长短、高下、清浊之间。”角调，为春音，在五行中属木，主生，主怒，色青，与人体肝与胆相通，有益于肝藏血，具有疏理肝气，促进体内气肌伸展条达、舒畅情志之功效，故对肝郁不舒的诸种症状作用尤佳，诸如胁肋疼痛、胸闷、脘腹不适

29、等等。晋书律历上云：“闻其角声，使人侧隐而仁爱。”角调类音乐能疏导发泄情绪1。3.2 音乐电针治疗抑郁症的选穴依据本实验选取的百会、三阴交两穴是临床验证治疗抑郁症有效且最常使用的主穴。百会为手足三阳经与督脉及足厥阴肝经之会，为督脉之要穴，百脉聚会之处，且位于头部巅顶，故可调补中气，健脑宁神，是宁心调神之要穴。三阴交穴，为肝、脾、肾三阴经交会之处，有补虚的功效，抑郁症病程长，中医学认为久病多虚，因此调节三阴交可以增强人体机能，并对五脏六腑的功能均有影响，我们针刺百会，三阴交等穴治疗模型大鼠，可以调节髓海机能、增进机体“五脏化区气”的功能，使紊乱神机恢复正常，起到抗抑郁效应。基于上述文献和临床研究

30、，实验中我们选取百会、三阴交进行实验研究。实验结果显示两穴配用可以调整抑郁大鼠之情绪障碍，且经音乐电针治疗的大鼠甚至未出现活动性和探究行为的降低以及快感的缺乏，表现出了音乐电针的干预对抗作用。3.3 音乐电针对抑郁模型大鼠海马 BDNF、c-fos 蛋白表达的影响脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是神经营养因子（neurotrophin）家庭的重要成员。大量研究证明，BDNF 对多种类型的神经元具有分化、增殖、余瑾 男广州中医药大学康复医学教研室 主任 副教授，硕士研究生导师康复学科负责人 联系电话：13922307233 地址：

31、广州机场路 12 号大院 63802 房510405营养、成熟的作用。它能增强突触关系，影响神经元的可塑性和神经递质、神经营养因子的合成，且与长时程增强效应（LIP）及学习、记忆功能有关2。即时反应基因 c-fos 和 c-jun 作为一组非特异的转录调控因子，近年来被应用到研究精神药物调节靶基因的作用机理中。在本研究慢性给药和音乐电针治疗过程中，使大鼠对抓捉、灌胃等刺激产生了适应性，从而排除了这些应激对 c-fos 表达的诱导作用。本研究结果与其他研究的结果一致，提示音乐电针抑制及早基因 c-fos 在中枢神经系统的表达可能也是其治疗抑郁症的机理之一。参考文献参考文献1 李潮坤.刍议五音音乐疗法的辩证用乐模型.广东省中医药学会音乐治疗专业委员会 2007年学术交流大会2Urea VS,Gomez,Andrca ME.et al.Shuule-box,dcjic-its induced by chronic variablestress:reversal by imipramine administeation.Pharmacol BiochemBehavJ,1991;38:125-130