海南粗榧GGPPs基因克隆与诱导表达分析_钱丹.pdf

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1、分子植物育种，2013 年，第 11 卷，第 2 期，第 204-210 页Molecular Plant Breeding,2013,Vol.11,No.2,204-210研究报告Research Report海南粗榧 GGPPs 基因克隆与诱导表达分析钱丹1江雪飞1*乔飞2*1 热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室,海南大学园艺园林学院,海口,570228;2 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室,儋州,571737*通讯作者,;摘要濒危植物海南粗榧富含多种抗癌活性次生代谢产物。为研究这些产物的生物代谢途径和表达调控，通过同源克

2、隆和 RACE 技术获得了海南粗榧紫杉醇生物合成途径中通用前体牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶(GGPPs)基因全长并进行了生物信息学分析。该基因命名为 CmGGPPs(GenBank 登录号:JX971119)，并进一步利用不同激发子诱导研究了该基因对不同逆境信号的响应情况。结果表明：海南粗榧 GGPPs 基因cDNA 全长 1 694 bp，包含一个 1 182 bp 的 ORF 框，编码 393 个氨基酸；预测该基因编码蛋白质分子量为42.91 kD，其等电位为 7.12。通过 BLAST 比对结果分析，海南粗榧 GGPPs 基因全长核苷酸序列与红豆杉科植物的同源性最高可达 91%，氨基酸序列

3、有 89%的相似性。同时，GGPPs 基因氨基酸序列同其他植物也有较高的同源性。用不同类型激发子处理发现，GGPPs 在诱导后表达量均上升，但不同激发子诱导的基因表达强度和速率存在明显区别。关键词海南粗榧,GGPPs 基因,诱导表达,RACE 技术Cloning and Induced Expression Analysis of GGPP Synthase Gene fromCephalotaxus manniiQian Dan1Jiang Xuefei1*Qiao Fei2*1 Key Laboratory of Protection and Development Utilization

4、 of Tropical Crop Germplasm Resources,Ministry of Education/College of Horticultureand Landscape Architecture,Hainan University,Haikou,570228;2 Tropical Crops Genetic Resources Institute,Chinese Academy of Tropical Agricul-tural Sciences,Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancemen

5、t in Southern China,Danzhou,571737*Corresponding authors,;DOI:10.3969/mpb.011.000204AbstractEndangered plant,Cephalotaxus mannii,is known as containing rich and various anti-cancer activesecondary metabolites.In order to study the metabolitic pathway and expression regulation,the geranyl geranyldiph

6、osphate synthase(GGPPs)gene that catalyzes and synthesizes the common precursor in paclitaxel biosyntheticpathway,was cloned from Cephalotaxus mannii by means of homologous cloning approach and RACE technique.The cloned gene was names as CmGGPPs and deposited in GenBank with Accession number JX97111

7、9.Thesequence analysis showed that the cDNA sequence had 1 694 bp in length with a poly A tail,which contains a1 182 bp of open reading frame(ORF)encoding a 393 amino acid residuals.Bioinformatics analysis predicted thatit encodes a 42.91 kD predicted protein with isoelectric point 7.12.Blast result

8、s indicated that the cloned geneshare 91%sequence homology as well as 89%amino acid similarity with the reported GGPPs of other plants in thefamily of Taxaceae Meanwhile,GGPPs gene in Amino acid sequences also shares high homology with otherplants.Through the treatment with different types of elicit

9、ors,the results showed that GGPPs expression levelsincreased after elicitors induction,but there were distinct different strength and rate of the gene expression in three收稿日期：2012-10-19接受日期：2012-11-07网络出版日期：2012-01-25URL:http:/ treatments.KeywordsCephalotaxus mannii,GGPPs gene,Induced gene expressio

10、n,RACE technology海南粗榧(Cephalotaxus mannii)是三尖杉属(Cep-halotaxus)分布最南的种，该属植物主产我国，由于生态幅度较窄以及人为破坏的缘故，其分布区面积在不断缩小，属濒危物种，已于 1987 年列入国家二级重点保护濒危植物(杜道林等,2003,湖南科学技术出版社,1(4):16)。海南粗榧的根、茎、叶以及果实都富含多种具有抗癌活性的生物碱，由于自然资源无法满足需求，生物合成一直以来都是研究的热点(蔡长福,2007)，而克隆和分析这些次生代谢产物相关基因是这些生物碱生物合成的前提和基础(De Lucaet al.,2012)。在三尖杉科植物中已

11、发现的功能次生代谢物有三尖杉酯碱(Harringtonine)和紫杉醇(Paclitaxel,又名Taxol)，其生物合成代谢途径已基本明了(张长河等,1996;Gitterman et al.,1980;Jennewein and Croteau,2001)，但参与合成这些生物碱的基因以及这些次生代谢产物在粗榧中的生物学功能依然还不清楚。牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶(geranyl geranyl diphos-phate synthase,GGPPs)在次生代谢途径中，对于众多次生代谢产物前体的代谢方向起着重要调节作用(Coman,2010)，并且是紫杉醇生物合成途径酶促反应中最上游的酶。因

12、此，本研究拟通过同源克隆的方法获得海南粗榧中 GGPPs 的基因全长，进行基因信息学分析；并进一步利用不同外源激发子刺激，观察 GGPPs 基因表达与外源刺激信号的关系，对海南粗榧功能次生代谢产物的生物合成和产量调节提供理论参考。1结果与分析1.1 GGPPs基因cDNA的克隆及其序列特征分析通过利用已报道其他物种 GGPPs 基因序列所设计的简并引物 GGPPs1，对 RACE 反转录 cDNA模板进行 PCR 扩增，得到一条 219 bp 的扩增片段。根据测序结果分别设计 5-RACE 和 3-RACE 的引物进行 PCR 扩增，获得 1 190 bp 和 504 bp 两条序列，序列拼接

13、后得到 1 694 bp 的 GGPPs 序列，再根据该拼接序列设计引物 GGPPs，将 PCR 产物连接、转化及测序后，结果显示海南粗榧 GGPPs 基因 cD-NA 全长 1 694 bp，与拼接序列一致(图 1)。将该基因提交 GenBank，获得登录号为 JX971119。1.2海南粗榧GGPPs基因cDNA全长核苷酸和氨基酸序列分析经验证所得海南粗榧 GGPPs 基因 cDNA 全长为 1 694 bp，其中开放编码框(ORF)为 1 182 bp，5 非翻译区为 337 bp，3 非翻译区为 175 bp。共编码 393个氨基酸序列，通过 ProtParam 预测得出其分子量为42

14、.91 kD，等电点(pI)为 7.12。1.3海南粗榧GGPPs基因同源性分析和系统进化树分析海南粗榧 GGPPs 基因 cDNA 全长核苷酸序列和氨基酸序列与已报道的红豆杉科植物 GGPPs 基因同源性最高，一致性分别是 91%和 89%。与其他植物的同源性略低，核苷酸序列的一致性在 49%82%之间，氨基酸序列的一致性在 67%71%之间。除了红豆杉科的植物以外，与银杏 Ginkgo biloba图 1 GGPPs 基因 PCR 扩增电泳图注:M:DL2000 marker;1:目的片段;A:GGPPs 基因简并 PCR扩增电泳图;B:GGPPs 基因 5-RACE 扩增电泳图;C:GG

15、PPs基因 3-RACE 扩增电泳图;D:GGPPs 基因 cDNA 全长扩增电泳图Figure 1 The amplification results of GGPPsNote:M:DL2000 marker;1:Purpose extract;A:The degenerat-ed amplification results of GGPPs;B:The 5-RACE amplifica-tion results of GGPPs;C:The 3-RACE amplification results ofGGPPs;D:The full-length cDNA amplification r

16、esults of GGPPs海南粗榧 GGPPs 基因克隆与诱导表达分析Cloning and Induced Expression Analysis of GGPP Synthase Gene from Cephalotaxus mannii205分子植物育种Molecular Plant Breeding(AAQ72786.1)氨基酸序列同源性最高为 71%，其次是云杉 Picea abies(ACA21461.1)、北美冷杉 Abiesgrandis(AAL17614.2)、蓖麻 Ricinus communis(XP_002531191.1)、拟南芥 Arabidopsis thal

17、iana(NP_1953-99.1)、巴西橡胶 Hevea brasiliensis(BAF98302.1)、葡萄 Vitis vinifera(CAN78430.1)、苜蓿 Medicago trun-catula(ADG01841.1)，同源性分别为 70%、70%、70%、69%、68%、67%和 67%(图 2)。其核苷酸序列与已经报道的其他物种 GGPPs基因序列利用 DNAMAN 构建进化树显示(图 3)，12个物种的 GGPPs 基因核苷酸序列可聚为 2 大类群，其中将海南粗榧与红豆杉科植物、银杏 Ginkgobiloba(EF646377.1)、云杉 Picea abies(E

18、U432050.1)等裸子植物聚为一类，它们亲缘关系最近。将拟南芥 Arabidopsis thaliana(AK227130.1)、苜蓿 Medicagotruncatula(GU999999.1)、巴西橡胶 Hevea brasiliensis(AB055496.1)、蓖麻 Ricinus communis(XM_00252505-0.1)和葡萄 Vitis vinifera(AM472791.2)等被子植物聚为另一类。氨基酸序列比对发现裸子植物 GGPPs 均比被子植物 GGPPs 多出一段氨基酸序列(图 2 方框部分)。同时，氨基酸序列比对还发现，蛋白质不同区域表现出不同的相似度，C

19、端的催化功能区高度保守，而 N 端的转运肽区域相似度极小。1.4不同诱导子处理后海南粗榧GGPPs基因表达量分析不同诱导子处理海南粗榧二年生小苗叶片结果发现，处理后叶片中 GGPPs 的基因表达量明显上调。利用 Harpin(50 mg/L)处理后的叶片与对照相比均在 12 h 基因表达量达到最大值，而利用 MeJA(100 mol/L)和 Flg22(1 mol/L)处理后的叶片与对照相比在 24 h 基因表达量达到最大值。其中 MeJA诱导的诱导效果持续时间较长，表达总量较高(图 4)。2讨论本研究首次在海南粗榧中克隆了 GGPPs 基因，并对该 GGPPs 基因从生物信息学角度如相对分子

20、量、等电点等特性方面进行了分析。通过和银杏(Liao et al.,2004)、美洲巨杉(Burke and Croteau,2002)、橡胶树(Takaya et al.,2003)、南方红豆杉(韩飞等,2011)、甘草(Sithitthitha et al.,2001)和曼地亚哥红豆杉(肖明贵等,2004;肖明贵,2004)等植物中的GGPPs 基因对比分析发现，海南粗榧 GGPPs 氨基酸序列具有裸子植物特有的蛋白块(Block)因此推测本研究得到的 GGPPs 基因属于裸子植物类群。尽管裸子植物和被子植物 2 种类群的 GGPPs 从同一祖先平行进化而来(Liao et al.,200

21、4)，并且催化相同底物，但最终产生不同的二萜类化合物。在红豆杉中，GGPPs 可酶促反应催化异戊烯焦磷酸(farnesylpyrophosphate,FPP)与甲基丙烯基焦磷酸(isopent-enyl diphosphate,IPP)缩合反应生成 GGPP，然后在GGPPs 催化作用下 GGPP 再经过一系列环化作用而形成紫杉醇的紫杉烷骨架结构。同源性和系统进化树的分析结果表明，海南粗榧 GGPPs 基因在氨基酸序列和核苷酸序列比对分析下均与红豆杉科植物同源性最高，说明海南粗榧中可能具有紫杉醇合成代谢途径。尽管三尖杉酯碱和紫杉醇由于具有抗癌效果而广泛应用医学领域，但这些次生代谢物质对于植株自

22、身的生物学功能仍未见报道。本研究利用真菌激发子 Flg22、细菌激发子 Harpin 和模拟昆虫取食造成物理伤害的信号物质 MeJA(徐伟和严善春,2005)进行诱导，发现 MeJA 对于 GGPPs 基因的诱导具有持续时间长，强度大的特点，而 Flg22 的诱导效率较低。而这也和众多利用 MeJA 诱导细胞悬系产生紫杉醇的研究相符(Laskaris et al.,1999a;1999b;Nim et al.,2006)。由于诱导后 GGPPs 的表达量与紫杉醇生成量具有线性相关性(Laskaris et al.,1999a)，因此我们推测紫杉醇在抵御逆境胁迫方面有重要作用，但作用形式尚不清楚

23、，这些次生代谢产物是否对植株起到有效保护仍有待阐明。由于三尖杉酯碱和紫杉醇多被发现存在于进化地位相对古老的植物中并且含量较低，因此，掌握如何有效激活这些次生代谢途径的方法，以及了解参与这些代谢途径中的关键基因有重要意义，也是我们进一步研究的目标。3材料与方法3.1材料海南粗榧(Cephalotaxus mannii)二年生实生苗新稍叶片。3.2海南粗榧总RNA提取和cDNA合成RNA 提取参照 Axygen 公司总 RNA 小量制备试剂盒说明书方法，并用 1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性。按照 Clontech 公司的 SMARTTMRACE cDNAAmplification Kit 操作完成

24、RACE 反转录 cDNA 模板合成。206图 2 GGPPs 氨基酸序列一致性比较分析注:深灰色表示一致性为 100%;灰色表示一致性75%;浅灰色表示一致性50%;1:海南粗榧;2:加拿大红豆杉;3:曼地亚哥红豆杉;4:北美冷杉;5:银杏;6:云杉;7:巴西橡胶;8:苜蓿;9:蓖麻;10:拟南芥;11:葡萄;12:相同点Figure 2 GGPPs amino acid sequence alignmentNote:Identity level:Darkgray 100%;Gray75%;Lightgray50%;1:Cephalotaxus mannii;2:Taxus canadens

25、is;3:Taxus x media;4:Abies grandis;5:Ginkgo biloba;6:Picea abies;7:Hevea brasiliensis;8:Medicago truncatula;9:Ricinus communis;10:Arabidopsisthaliana;11:Vitis vinifera;12:Consensus海南粗榧 GGPPs 基因克隆与诱导表达分析Cloning and Induced Expression Analysis of GGPP Synthase Gene from Cephalotaxus mannii207分子植物育种Mol

26、ecular Plant Breeding3.3海南粗榧GGPPs基因的PCR扩增、克隆与测序根据 GenBank 上已登录的 GGPPs 基因序列中，利用亲缘关系相对较近的云南红豆杉 DQ364604.1、加拿大红豆杉 AF081514.1、曼地亚哥红豆杉 AY-453404.1 的 CDS 序列保守区，用 Primer Premier 5.0软件设计一对简并引物命名为 GGPPs1，进行RT-PCR 扩增(表 1)。根据 PCR 产物测序结果分别设计 5-RACE 和 3-RACE 的引物，利用单侧寡聚核苷酸巢式 PCR(single oligonucleotide nested PCR,

27、SON-PCR)技术进行两轮 PCR 反应来扩增 GGPPs 基因的 5-RACE 和 3-RACE(表 1)。将获得的 PCR 扩图 3 海南粗榧 GGPPs 基因与已知 GGPPs 基因核苷酸同源性聚类树状图注:1:海南粗榧;2:云南红豆杉;3:加拿大红豆杉;4:曼地亚哥红豆杉;5:云杉;6:北美冷杉;7:银杏;8:拟南芥;9:苜蓿;10:蓖麻;11:巴西橡胶;12:葡萄Figure 3 The phylogenetic tree based on alignment of nucleotideamong Cephalotaxus mannii GGPPs gene and some pr

28、eviouslypublished GGPPs genesNote:1:Cephalotaxus mannii;2:Taxus wallichiana;3:Taxuscanadensis;4:Taxus x media;5:Picea abies;6:Abies grandis;7:Ginkgo biloba;8:Arabidopsis thaliana;9:Medicago truncatula;10:Ricinus communis;11:Hevea brasiliensis;12:Vitis vinifera图 4 不同诱导子处理后 GGPPs 基因表达量随时间的变化Figure 4 T

29、ime course of GGPPs transcript abundance in responseto different elicitor增产物与 PMD-18T Vector 载体连接，并转入大肠杆菌 DH5 感受态细胞中，菌落通过 Amp 抗性筛选和IPTG/X-gal 蓝白斑筛选，挑选阳性克隆送测。根据测序结果设计特异引物，扩增 GGPPs 基因全长(表 1)。引物合成与测序交由英潍捷基(上海)公司完成，大肠感菌菌株 DH5 为本实验室保存，PMD-18T Vector 等试剂均购自 TaKaRa 公司。3.4序列分析及比较利用 DNAMAN 和 DNAUSER 进行序列拼接；基

30、因编码区用 ORF Finder 程序预测(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)；上下游引物设计采用 Pri-mer Premier 5.0 软件；核苷酸和氨基酸同源序列搜索通过 NCBI 中在线 BLAST 进行(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；氨基酸序列比对以及相似序列系统进化树分析通过 DNAMAN 构建；蛋白质的相对分子量、等电点用 EXPASy 的 ProtParam tool 在线程序(http:/web.expasy.org/protparam/)进行预测。3.5 GGPPs基因半定量

31、RT-PCR分析根据 RACE 所得结果拼接、验证得到全长序列；用 Primer Premier 5.0 设计引物命名为 GGPPs2，引物序列分别为 GGPPs2-S：CTGATAGGACTTTGAGGGTGA；GGPPs2-A：CCTCCACTCACAACTGAACAT。用 NCBI 上已登录的海南粗榧 18srRNA 基因(JF976-108.1)作为内参基因，根据该基因的 CDS 序列保守区，用 Primer Premier 5.0 设计了另一对引物命名为Cm-18srRNA，引物序列分别为 Cm-18srRNA-S：GCTGAAATGAGCACGAGGTCC；Cm-18srRNA-A

32、：CACGAGATAAAGTTTGCCCACA。分别用MeJA(100mol/L)、Harpin(50mg/L)、Flg22(1 mol/L)对海南粗榧二年生实生苗叶片进行 0、12 h、24 h、36 h、48 h 和 72 h 的 6 个时间段处理，用清水处理作为对照。进行 3 次重复。RNA 提取参照Axygen 公司总 RNA 小量制备试剂盒说明书方法，根据 NEB 公司反转录试剂盒使用说明将 RNA 反转录为 cDNA，通过半定量 RT-PCR 分析，利用凝胶成像系统所得电泳图利用 Image J 软件进行表达分析。处理所用药剂中茉莉酸甲酯(MeJA)购自 Promega 公司，Fl

33、g22 由生工生物工程(上海)有限公司合成，Harpin 购自 EDEN 生物科学公司(Messenger誖)。作者贡献乔飞和钱丹是本研究的实验设计和实验研究的208海南粗榧 GGPPs 基因克隆与诱导表达分析Cloning and Induced Expression Analysis of GGPP Synthase Gene from Cephalotaxus mannii执行人；钱丹完成数据分析，论文初稿的写作；钱丹和乔飞参与实验设计，试验结果分析；江雪飞和乔飞是项目的构思者及负责人，指导实验设计，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。致谢本研究由海南大学青年基金项目(qnj

34、j1217)资助。感谢热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室(海南大学)和农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室给予实验技术和实验设施等帮助。参考文献Burke C.,and Croteau R.,2002,Geranyl diphosphate synthasefrom Abies grandis:cDNA isolation,functional expression,and characterization,Arch.Biochem.Biophys.,405(1):130-136Cai C.F.,2007,Cephalotaxus cell culture and its

35、 harringtoninesecondary metabolism research,Thesis for M.S.,Fujianagriculture and forestry university,Supervisor:Zheng Y.S.,pp.3-10(蔡长福,2007,三尖杉细胞培养及其三尖杉酯碱次生代谢的研究,硕士学位论文,福建农林大学,导师:郑郁善,pp.3-10)Coman D.,2010,Regulation of isoprenoid biosynthesis at branchpoints-the GGPP synthase gene family,Dissertati

36、on for Ph.D.,ETH Zurich,Supervisor:Gruissem W.,pp.3-4De Luca V.,Salim V.,Atsumi S.M.,and Yu F.,2012,Mining thebiodiversity of plants:a revolution in the making,Science,336(6089):1658-1661表 1 PCR 扩增程序Table 1 The processes of PCRPCR 名称PCR code简并 PCRDegenerated PCR5-末端扩增5-RACE3-末端扩增3-RACE全长验证Full-lengt

37、h verifi-cationPCR 引物及其序列Primer sequenceGGPPs1-S:ACAATAGGCTCTCAAGGGCTGGPPs1-A:CTGAAACAGAAGCCCCACACGGPPs-5O:CAGGTCCACATTAGCATCCCUPM:CTAATACGACTCACTATAGGGCGGPPs-5I:CCTTGAGAGCCTATTGTCTTACCNUP:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGPPs-3O:TGTTCAGTTGTGAGTGGAGGGAUPM:CTAATACGACTCACTATAGGGCGGPPs-3I:TGGTGGTGCTACAGAGGACGAN

38、UP:AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGPPs-S:CAAGAGCAGCAATCATCCAGGPPs-A:AGGCAATAGAAGATGGCTPCR 程序PCR procedure94 5 min,94 45 s,55.6 45 s,72 1.5 min,34 cycles,72 10 min,4 pause94 5 min,94 45 s,57.5 45 s,72 1.5 min,25 cycles,72 10 min,4 pause94 5 min,94 45 s,57.3 45 s,72 1.5 min,37 cycles,72 10 min,4 pause94 5 mi

39、n,94 45 s,60.2 45 s,72 1.5 min,25 cycles,72 10 min,4 pause94 5 min,94 45 s,61.2 45 s,72 1.5 min,37 cyecles,72 10 min,4 pause94 5 min,94 45 s,54.6 45 s,72 2 min,34 cycles,72 10 min,4 pauseGitterman A.,Parry R.J.,Dufresne R.F.,Sternbach D.D.,and Ca-belli M.D.,1980,Biosynthesis of the Cephalotaxus alka

40、loidsinvestigations of the biosynthesis of deoxyharringtonine,isoharringtonine,and harringtonine,Journal of the AmericanChemical Society,102(6):2074-2081Han F.,Kang L.Z.,Guo L.Q.,Chen X.Y.,and Lin J.F.,2011,Molecular cloning and sequence analysis of geranyhlgeranypyrophosphate systhase from Taxus wa

41、llichiana var.Mairei,Shipin Yu Shengwu Jishu Xuebao(Journal of Food Scienceand Biotechnology),30(5):728-733(韩飞,康林芝,郭丽琼,陈晓阳,林俊芳,2011,南方红豆杉 GGPP 合酶基因的克隆与生物信息学分析,食品与生物技术学报,30(5):728-733)Jennewein S.,and Croteau R.,2001,Taxol:biosynthesis,mole-cular genetics,and biotechnological applications,Appl.Mi-cro

42、biol.Biotechnol.,57(1-2):13-19Laskaris G.,De Jong C.F.,Jaziri M.,Van Der Heijden R.,Theodoridis G.,and Verpoorte R.,1999a,Geranylgeranyldiphosphate synthase activity and taxane production inTaxus baccata cells,Phytochemistry,50(6):939-946Laskaris G.,Bounkhay M.,Theodoridis G.,Vander Heijden R.,Verpo

43、orte R.,and Jaziri M.,1999b,Induction of geranylge-ranyl diphosphate synthase activity and taxane accumulationin Taxus baccata cell cultures after elicatition by methyl jas-monate,Plant Science,147(1):1-8Liao Z.H.,Chen M.,Gong Y.F.,Guo L.,Tan Q.M.,Feng X.Q.,Sun X.F.,Tan F.,and Tang K.X.,2004,A new g

44、erany-lgeranyl diphosphate synthase gene from Ginkgo biloba,which intermediates the biosynthesis of the key precursorfor ginkgolides,DNA Seq.,15(2):153-158Nim E.,Dubois C.P.,Robert S.C.,and Walker E.L.,2006,Expre-209分子植物育种Molecular Plant Breedingssion profiling of genes involved in paclitaxel biosyn

45、thesisfor targeted metabolic engineering,Metabolic Engineering,8(5):385-394Sithitthitha W.,Kojima N.,Viroonchatapan E.,Suh D.Y.,IwanamiN.,Hayashi T.,Noji M.,Saito K.,Niwa Y.,and SankawaU.,2001,Geranylgeranyl diphosphate synthase from Scopa-ria dulcis and Croton sublyratus.Plastid localization andcon

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