酵母核糖核酸的提取及组分鉴定卢忠燕.ppt

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1、Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technologyBiochemical experimental technologyBiochemical experimental technology实验七实验七 酵母核糖核酸的提取酵母核糖核酸的提取Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology核核 酸酸(nucleic acid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。分

2、子，携带和传递遗传信息。Nucleic Acid基因的化学本质核酸Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology核酸的分类及分布核酸的分类及分布 90%90%以以上上分分布布于于细细胞胞核核，其其余余分分布布于于核外核外如线粒体，叶绿体，质粒等。如线粒体，叶绿体，质粒等。分布于胞核、胞液。分布于胞核、胞液。(deoxyribonucleic acid,DNA)(ribonucleic acid,RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个携带遗传信息，决定细胞和个体的基

3、因型体的基因型(genotype)。是是DNA的转录产物，参与细胞的转录产物，参与细胞内内DNA遗传信息的表达。遗传信息的表达。除RNA病毒以外，所有有机体的遗传物质（基因）都是DNA。Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology一、实验目的一、实验目的 1.掌握从酵母中提取核糖核酸的原理。掌握从酵母中提取核糖核酸的原理。2.学会核糖核酸提取的基本操作。学会核糖核酸提取的基本操作。Biochemical experimental technologyBiochemical experimental

4、technology二、实验原理二、实验原理 酵母，即酵母菌，是一些单细胞真菌，是人酵母，即酵母菌，是一些单细胞真菌，是人类文明史中被应用得最早的微生物，繁殖速度快，类文明史中被应用得最早的微生物，繁殖速度快，生长周期短，其细胞质中的核酸大部分是生长周期短，其细胞质中的核酸大部分是RNARNA，而，而DNADNA很少；很少；RNARNA提取液与菌体分离比较容易，所以提取液与菌体分离比较容易，所以生产中常选用酵母作为生产中常选用酵母作为RNARNA提取的原材料。提取的原材料。Biochemical experimental technologyBiochemical experimental t

5、echnology 工业上提取工业上提取RNARNA的方法主要有三种，包括的方法主要有三种，包括稀碱稀碱法、浓盐法和自溶法法、浓盐法和自溶法。本实验采用的是。本实验采用的是稀碱法稀碱法。稀。稀碱法是利用碱法是利用RNARNA可溶于碱性溶液的性质，先使可溶于碱性溶液的性质，先使RNARNA溶溶于稀于稀NaOHNaOH溶液中，然后再利用核酸不溶于乙醇的性溶液中，然后再利用核酸不溶于乙醇的性质，向溶液中加入酸性的乙醇溶液，从而使质，向溶液中加入酸性的乙醇溶液，从而使RNARNA沉淀沉淀出来，如此得到的即是出来，如此得到的即是RNARNA的粗制品；再用乙醇、乙的粗制品；再用乙醇、乙醚等有机溶剂洗涤脂类

6、杂质，即得到纯化的醚等有机溶剂洗涤脂类杂质，即得到纯化的RNARNA。Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology三、三、实验步骤实验步骤1.酵母酵母RNA的提取的提取(1)(1)准确称取准确称取15g15g酵母，加入干净的研钵中酵母，加入干净的研钵中,加入适加入适量石英砂；然后，向研钵中加入量石英砂；然后，向研钵中加入30-40mL0.04M30-40mL0.04M的的NaOHNaOH溶液，并用力研磨约溶液，并用力研磨约10min10min。(2)(2)待研磨均匀后，将钵中溶液倒入锥形瓶中，并待研

7、磨均匀后，将钵中溶液倒入锥形瓶中，并再取再取30-40mL0.04MNaOH30-40mL0.04MNaOH溶液洗涤研钵，一并转入溶液洗涤研钵，一并转入锥形瓶中，然后放于沸水浴中加热锥形瓶中，然后放于沸水浴中加热20-30min20-30min，取，取出冷却。出冷却。Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology2.酵母酵母RNA分离及沉淀分离及沉淀 将锥形瓶中溶液转移到将锥形瓶中溶液转移到100ml100ml离心管离心管中，在中，在4200rpm4200rpm离心离心8-15min8-15min后，

8、将上清液后，将上清液缓缓倾入缓缓倾入30ml30ml酸性乙醇溶液中，边倾倒边酸性乙醇溶液中，边倾倒边轻轻搅拌，待轻轻搅拌，待RNARNA沉淀完全后，沉淀完全后，3500rpm3500rpm离离心心3-5min3-5min，弃上清，沉淀即为，弃上清，沉淀即为RNARNA粗制品。粗制品。Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology3.洗涤及干燥洗涤及干燥（1 1）向离心管中加向离心管中加15-20ml15-20ml的的95%95%乙醇，轻摇后，乙醇，轻摇后，静置静置3-5min,3500rpm3-5mi

9、n,3500rpm离心离心3-5min3-5min，弃上清，留沉，弃上清，留沉淀。淀。（2 2）再加入）再加入15-20ml15-20ml乙醚，轻摇后，静置乙醚，轻摇后，静置3-5min,3-5min,3500rpm3500rpm离心离心3-5min3-5min，弃上清，沉淀即为酵母，弃上清，沉淀即为酵母RNARNA。Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology四、四、实验结果实验结果 将提取的将提取的RNARNA在空气中或用吹风机风干，称在空气中或用吹风机风干，称重，计算重，计算RNARNA的含量

10、。的含量。参考公式如下：参考公式如下：Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technologyBiochemical experimental technologyBiochemical experimental technology实验八实验八 核糖核酸的组分鉴定核糖核酸的组分鉴定Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology核酸核酸(DNA和和RNA)核苷酸核苷酸核苷和脱氧核苷核苷和脱氧核苷磷酸磷酸戊糖戊糖碱基碱基

11、嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶核糖核糖脱氧核糖脱氧核糖n核酸组成核酸组成 Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology分子组成分子组成碱基碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱：嘌呤碱，嘧啶碱戊糖戊糖(pentose)：核糖，脱氧核糖：核糖，脱氧核糖磷酸磷酸(phosphate)核苷酸是构成核酸的基本组成单位核苷酸是构成核酸的基本组成单位碱基碱基苦苦碱基碱基甜甜戊糖戊糖酸酸磷酸磷酸Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology

12、一、实验目的一、实验目的1.1.掌握核糖核酸组分鉴定的原理。掌握核糖核酸组分鉴定的原理。2.2.学会鉴定核糖核酸组分的方法。学会鉴定核糖核酸组分的方法。Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology二、实验原理二、实验原理1.1.核糖核酸的组成成分主要包括核糖核酸的组成成分主要包括核糖、磷酸和碱基核糖、磷酸和碱基。2.2.在碱性环境下，嘌呤碱能与银离子反应形成沉淀，在碱性环境下，嘌呤碱能与银离子反应形成沉淀，但此处碱性环境不能用一般的强碱，否则强碱会与但此处碱性环境不能用一般的强碱，否则强碱会与银离子

13、反应产生沉淀而干扰结果判定。银离子反应产生沉淀而干扰结果判定。Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology3.核糖核酸与浓盐酸共热时，会发生降解，形成的核核糖核酸与浓盐酸共热时，会发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者可与糖继而转变成糠醛，后者可与3 3，5-5-二羟基甲苯二羟基甲苯（地衣酚）反应，在（地衣酚）反应，在FeFe3+3+或或CuCu2+2+催化下，生成绿色催化下，生成绿色复合物。复合物。4.4.磷酸组分可与定磷试剂在酸性环境中反应，生成磷酸组分可与定磷试剂在酸性环境中反应，生成蓝色物

14、质。因此，可以根据以上性质，设计实验蓝色物质。因此，可以根据以上性质，设计实验对各组分进行鉴定。对各组分进行鉴定。Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology三、三、实验步骤实验步骤1.取取200-500mg200-500mg实验七中提取的酵母实验七中提取的酵母RNARNA，加入，加入1.5M H1.5M H2 2SOSO4 4溶液溶液10mL10mL，在沸水浴中加热，在沸水浴中加热10-2010-20分分钟，使核酸充分水解后，用于对各组分的鉴定。钟，使核酸充分水解后，用于对各组分的鉴定。2.2.磷

15、酸组分鉴定：取水解液磷酸组分鉴定：取水解液1mL1mL，加入干净的试，加入干净的试管中，再加入等体积的新配制的定磷试剂管中，再加入等体积的新配制的定磷试剂1mL1mL，混匀后，在混匀后，在4545左右的水浴中加热左右的水浴中加热15-30min15-30min，观察颜色变化。观察颜色变化。Biochemical experimental technologyBiochemical experimental technology3.3.嘌呤碱的鉴定：取水解液嘌呤碱的鉴定：取水解液1mL1mL，加入干净的试管，加入干净的试管中，加入过量的浓氨水，再加入中，加入过量的浓氨水，再加入1mL1mL的的0.1M0.1M的硝酸的硝酸银溶液，观察沉淀的生成。银溶液，观察沉淀的生成。4.4.核糖的鉴定：取水解液核糖的鉴定：取水解液1mL1mL，加入干净的试管中，加入干净的试管中，再加入再加入2mL2mL三氯化铁三氯化铁-浓盐酸溶液和浓盐酸溶液和0.2mL0.2mL苔黑酚苔黑酚-乙醇溶液，放置在沸水浴中加热乙醇溶液，放置在沸水浴中加热10-30min10-30min，观察，观察颜色变化。颜色变化。