透射电镜的样品制.ppt

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1、 透射电镜的生物透射电镜的生物 样品制备技术样品制备技术分为两类：分为两类：透射电镜样品的基本制备技术透射电镜样品的基本制备技术 超薄切片技术超薄切片技术 负染技术负染技术生物样品特殊制样技术生物样品特殊制样技术超薄切片技术超薄切片技术概念概念:指制备厚度低于指制备厚度低于100nm100nm的切片技术。的切片技术。特点：特点：是透射电镜生物样品制备技术中最是透射电镜生物样品制备技术中最常见、最基本的技术；常见、最基本的技术；是其他技术方法的基础；是其他技术方法的基础；程序长、操作较复杂、精细。程序长、操作较复杂、精细。生物医学样品的特点：生物医学样品的特点：1、样品多样化，包括组织、细胞、微

2、生物及生、样品多样化，包括组织、细胞、微生物及生 物大分子。物大分子。2、含水量多、质地软、脱水时容易皱缩变形。、含水量多、质地软、脱水时容易皱缩变形。3、机械程度低，对电子束轰击的耐受力差。、机械程度低，对电子束轰击的耐受力差。4、多由低原子序数的元素组成，故导电性能差。、多由低原子序数的元素组成，故导电性能差。5、样品形态对试剂的、样品形态对试剂的PH值及温度较敏感值及温度较敏感主要步骤主要步骤取材取材固定固定脱水脱水浸透及包埋浸透及包埋切片切片染色染色 一一.取材取材从人体、动植物、细胞和微生物的培养物中从人体、动植物、细胞和微生物的培养物中选取电镜观察材料的过程。选取电镜观察材料的过程

3、。在活体取材时要做到：在活体取材时要做到：快快离体离体1 12min2min内放入固定液内放入固定液准准取材部位要准，有代表性取材部位要准，有代表性小小1mm1mm1mm1mm1mm1mm大小，太小时结构少，大小，太小时结构少，太大时固定不充分结构保存不好太大时固定不充分结构保存不好轻轻动作要轻，器械要锋利动作要轻，器械要锋利冷冷0 0 4 4，器械、容器、固定液器械、容器、固定液均需预冷均需预冷二二.固定固定目的目的尽可能保存组织和细胞在生活状态下的结构尽可能保存组织和细胞在生活状态下的结构使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后 的冲洗和脱水等步骤中溶解

4、和流失的冲洗和脱水等步骤中溶解和流失防止细胞内酶活性造成的细胞自溶防止细胞内酶活性造成的细胞自溶 防止外界微生物侵入繁殖而产生腐败致使细防止外界微生物侵入繁殖而产生腐败致使细 胞的超微结构遭受破坏胞的超微结构遭受破坏 方法方法物理方法物理方法快速冷冻法快速冷冻法干燥法干燥法化学方法化学方法浸泡固定法浸泡固定法原位固定法原位固定法灌流固定法灌流固定法常用固定剂常用固定剂戊二醛戊二醛(GlutaraldehydeGlutaraldehyde，GA)GA)无无色色透透明明液液体体，pH=4pH=4，使使用用浓浓度度为为2.52.54 4，使用温度使用温度44。优点优点穿透能力强穿透能力强能能较较好好

5、地地保保存存蛋蛋白白质质、碳碳水水化化合合物物的的结结构构及及酶酶的的活性活性 固定保存时间长固定保存时间长(4(4可达数周至数月可达数周至数月)缺点缺点组织反差不好组织反差不好对脂类无固定作用对脂类无固定作用固定后标本要充分冲洗固定后标本要充分冲洗锇酸锇酸(Osmium tetroxide O(Osmium tetroxide Os s4 4)淡黄色块状结晶，使用浓度淡黄色块状结晶，使用浓度1 14 4，使用温度使用温度44。优点优点对蛋白质和脂类有较好的固定作用对蛋白质和脂类有较好的固定作用可避免组织块收缩或膨胀可避免组织块收缩或膨胀可产生明显的反差可产生明显的反差锇酸锇酸(Osmium

6、tetroxide O(Osmium tetroxide Os s4 4)缺点缺点分子量大，穿透能力差分子量大，穿透能力差对碳水化合物和酶固定效果不好对碳水化合物和酶固定效果不好固定时间较长易引起组织变脆固定时间较长易引起组织变脆有强烈的刺激味对角膜、鼻粘膜有毒性作用有强烈的刺激味对角膜、鼻粘膜有毒性作用光热作用时易发生变化光热作用时易发生变化多聚甲醛多聚甲醛(Paraformaldehyde)(Paraformaldehyde)白色粉末，使用浓度为白色粉末，使用浓度为4 4优点优点对组织的浸透力强对组织的浸透力强保存抗原性物质，多用于免疫电镜技保存抗原性物质，多用于免疫电镜技术中术中缺点缺点

7、高浓度时可使组织结构流失，多不单高浓度时可使组织结构流失，多不单独使用独使用常用缓冲液常用缓冲液用于配制固定液和漂洗用于配制固定液和漂洗 0.2M0.2M磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液:较常用较常用0.2M0.2M二甲砷酸盐缓冲液二甲砷酸盐缓冲液:用于电镜细胞化学用于电镜细胞化学浸泡固定法浸泡固定法 是将所取样品直接放入预冷固定液内固定是将所取样品直接放入预冷固定液内固定的方法，适用于大多数组织器官。最常用的是的方法，适用于大多数组织器官。最常用的是戊二醛、锇酸双重固定。戊二醛、锇酸双重固定。操作步骤操作步骤:前固定：前固定：2.5%-4%2.5%-4%戊二醛戊二醛 4 1-2h4 1-2h或数月或

8、数月漂洗：用配固定液的缓冲液漂洗：用配固定液的缓冲液 4 2-4h4 2-4h 中间换中间换3 3次次后固定：后固定：1%1%锇酸锇酸 4 1.5-2h4 1.5-2h（培养细胞（培养细胞 30min30min）漂洗：漂洗：蒸馏水蒸馏水 4 10min4 10min 原位固定法原位固定法多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或对多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或对缺氧比较敏感的组织。以保证器官的血液缺氧比较敏感的组织。以保证器官的血液供给，避免缺血造成的组织损伤或自溶。供给，避免缺血造成的组织损伤或自溶。操作步骤操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件下，在动物麻醉后保持血液供应的条件下，边解剖边在

9、取材的部位局部滴加固定液，边解剖边在取材的部位局部滴加固定液，直至组织达到适当的硬度为宜。直至组织达到适当的硬度为宜。灌流固定法灌流固定法 指通过血液循环途径，将固定液灌指通过血液循环途径，将固定液灌注到组织器官内，进行固定后再取材的注到组织器官内，进行固定后再取材的方法。常用于对缺氧敏感，死后变化快方法。常用于对缺氧敏感，死后变化快的组织器官，如中枢神经系统、心脏、的组织器官，如中枢神经系统、心脏、胃肠道、视网膜和肾脏等。也可用于所胃肠道、视网膜和肾脏等。也可用于所取组织的种类较多以及解剖关系比较复取组织的种类较多以及解剖关系比较复杂、难以渗透的组织器官。杂、难以渗透的组织器官。包括全身灌流

10、固定法（适用于小动包括全身灌流固定法（适用于小动物）和器官灌流固定法（适用于大动物）。物）和器官灌流固定法（适用于大动物）。操作步骤（操作步骤（以全身灌流固定法为例）以全身灌流固定法为例）麻醉要进行灌流的动物麻醉要进行灌流的动物,将动将动物固定于实验台上物固定于实验台上,打开胸腔暴露打开胸腔暴露心脏心脏,将针头刺入左心室，剪开右将针头刺入左心室，剪开右心耳以引出血液和灌流液。用注射心耳以引出血液和灌流液。用注射器或输液器缓慢注入器或输液器缓慢注入37 37、0.9%NaCl,0.9%NaCl,直至内脏血色消失或流直至内脏血色消失或流出液无血色为止出液无血色为止,注入注入4 4 固定液，固定液，

11、待组织变硬后取材。待组织变硬后取材。体外培养细胞的固定体外培养细胞的固定单层细胞固定单层细胞固定悬浮细胞固定悬浮细胞固定加入融化的加入融化的2%2%琼脂或琼脂或BSABSA增加粘附性。增加粘附性。离心。离心。三三.脱脱 水水目的目的将组织内部游离的水分脱净，有利于将组织内部游离的水分脱净，有利于浸透和包埋浸透和包埋常用脱水剂常用脱水剂乙醇乙醇:使组织收缩较小，但与包埋剂的互溶使组织收缩较小，但与包埋剂的互溶 性差性差丙酮丙酮:可溶解脂类，与包埋剂的互溶性好，可溶解脂类，与包埋剂的互溶性好，但易使组织变脆但易使组织变脆脱水步骤脱水步骤从低浓度至高浓度系列脱水从低浓度至高浓度系列脱水50%50%酒

12、精酒精 4 104 1015min15min70%70%酒精酒精 4 104 1015min15min或过夜或过夜80%80%酒精酒精 室温室温 101015min15min90%90%酒精酒精 室温室温 101015min15min95%95%酒精酒精 室温室温 101015min15min95%95%酒精：酒精：95%95%丙酮（丙酮（1 1：1 1）室温）室温 101015min15min95%95%丙酮丙酮 室温室温 101015min15min无水丙酮无水丙酮 室温室温 40min40min 中间换一次中间换一次四四.浸透及包埋浸透及包埋浸透浸透：目的是使包埋剂逐渐取代脱水剂目的是使

13、包埋剂逐渐取代脱水剂渗透到组织细胞中。因包埋剂与脱水剂不渗透到组织细胞中。因包埋剂与脱水剂不相溶，需用一种既能与脱水剂相溶，又能相溶，需用一种既能与脱水剂相溶，又能与包埋剂相溶的物质进行转换，常用的转与包埋剂相溶的物质进行转换，常用的转换剂为环氧丙烷。换剂为环氧丙烷。包埋：包埋：目的是让包埋剂完全浸透到组织目的是让包埋剂完全浸透到组织细胞内部，使组织具有一定的硬度、弹性细胞内部，使组织具有一定的硬度、弹性和韧性，能够承受切片时的各种压力，以和韧性，能够承受切片时的各种压力，以便制备超薄切片便制备超薄切片.常用的包埋剂常用的包埋剂 具有低黏度、亲和性强和优良的切割性能，具有低黏度、亲和性强和优良

14、的切割性能，切片透明度高，组织结构保存好，并能耐受切片透明度高，组织结构保存好，并能耐受电子束的轰击及在低温下聚合的特点。电子束的轰击及在低温下聚合的特点。环氧树脂环氧树脂Epon812(Epon812(进口进口)渗入组织容易，对细胞结构保存好，较渗入组织容易，对细胞结构保存好，较常用。常用。丙烯酸酯（丙烯酸酯（acrylic resin)acrylic resin)618618(国产国产)LowcrylLowcryl K4MK4M：为低温水溶性包埋剂，较常用。特点是低温下为低温水溶性包埋剂，较常用。特点是低温下(-35(-35)可保持低黏度；在紫外光（波长可保持低黏度；在紫外光（波长360n

15、m360nm）下）下可聚合。聚合后可聚合。聚合后可在常温下切片；能较好地保持组织结构和抗原性及植物凝可在常温下切片；能较好地保持组织结构和抗原性及植物凝血素结合部位，减少背景非特异性染色，故多用于免疫细胞血素结合部位，减少背景非特异性染色，故多用于免疫细胞化学的包埋后染色。化学的包埋后染色。包埋剂配方（包埋剂配方（K4M)K4M)K4M(K4M(单体）单体）8.65g8.65g 交联剂交联剂 1.35g1.35g 引发剂引发剂 50mg50mg LR white:为混合的丙烯酸单体，对脂类溶为混合的丙烯酸单体，对脂类溶解度低，保存膜结构较好，可耐受电解度低，保存膜结构较好，可耐受电子束轰击，因

16、而可不做支持膜。热聚子束轰击，因而可不做支持膜。热聚合合60；冷聚合；冷聚合-25 ，加速剂协助，加速剂协助聚合。聚合。包埋方法包埋方法1.常规包埋方法常规包埋方法 适用于大多数组织块及细胞团适用于大多数组织块及细胞团浸透浸透环氧丙烷环氧丙烷 室温室温 20min20min环氧丙烷环氧丙烷:包埋剂包埋剂 1:1 1:1 室温室温 40-60min40-60min包埋剂包埋剂 室温室温 3h3h包埋包埋将样品放入包埋板或胶囊内将样品放入包埋板或胶囊内放好标签放好标签充填满包埋剂充填满包埋剂 聚合聚合(使包埋剂变硬使包埋剂变硬)35 35 12h 12h 45 45 12h 12h 55 55 1

17、2h 12h2.原位包埋法原位包埋法 适用于组织块中数量少的特殊结构，如：适用于组织块中数量少的特殊结构，如：运动终板；冷冻切片、半薄切片及单层培养细运动终板；冷冻切片、半薄切片及单层培养细胞的某些结构的观察胞的某些结构的观察.1、组织块：前固定后用振动切片机切成、组织块：前固定后用振动切片机切成50-100mm的厚片，显微镜下选出含有所需结构的的厚片，显微镜下选出含有所需结构的厚片进行漂洗。经过厚片进行漂洗。经过1%锇酸后固定，乙醇及丙锇酸后固定，乙醇及丙酮系列脱水，环氧树脂浸透，把厚片铺于载玻酮系列脱水，环氧树脂浸透，把厚片铺于载玻片上，将顶端平整的废包埋块安在切片的特定片上，将顶端平整的

18、废包埋块安在切片的特定部位上，部位上，60 聚合后修块，常规切片及染色。聚合后修块，常规切片及染色。2 2、切片及单层培养细胞（需要在玻片上进行）：切片及单层培养细胞（需要在玻片上进行）：在光镜下选出所需观察的部位，在玻片反面在光镜下选出所需观察的部位，在玻片反面用笔做好标记。前固定、漂洗、后固定，脱水用笔做好标记。前固定、漂洗、后固定，脱水及浸透同常规包埋方法，但各步骤时间可适当及浸透同常规包埋方法，但各步骤时间可适当缩短。在玻片有标记处的正面位置滴上包埋剂，缩短。在玻片有标记处的正面位置滴上包埋剂，将顶端平整的废包埋块压在其上，于将顶端平整的废包埋块压在其上，于60 聚合聚合硬化。将粘有包

19、埋块的玻片置于硬化。将粘有包埋块的玻片置于90 热板上加热板上加温温10s，取下包埋块修块，超薄切片及电子染色。，取下包埋块修块，超薄切片及电子染色。五五.切片切片目的：目的：制备厚度小于制备厚度小于100nm100nm的切片的切片准备工作准备工作:1.1.复膜载网复膜载网支持膜支持膜formvarformvar膜膜火棉胶膜火棉胶膜碳膜碳膜 用于负染技术用于负染技术支持网支持网铜网铜网 常用常用不锈钢网、镍网、铂网（组化用）不锈钢网、镍网、铂网（组化用）2.制刀制刀 3.3.修块修块目的是去除组织块周围多余的包埋介目的是去除组织块周围多余的包埋介质，便于切片。质，便于切片。半薄切片半薄切片:目

20、的是确定所要观察的准确部位，厚目的是确定所要观察的准确部位，厚度为度为0.50.51m1m，用甲苯胺兰染色显示。用甲苯胺兰染色显示。超薄切片超薄切片:采用超薄切片机采用超薄切片机操作步骤操作步骤:包埋块固定包埋块固定刀固定刀固定水槽加水水槽加水切片切片选片选片捞片捞片切片带弯曲可能原因及解决办法切片带弯曲可能原因及解决办法可能原因 解决办法梯形或矩形组织面上下边不平行 用双面刀片重新休整组织切面使之平行刀刃锋利程度不一 更换新玻璃刀组织面上边或下边与刀刃不平行 重新调整组织与刀刃距离，使之平行支持膜的制作支持膜的制作支持膜是一种能支持观察样品的膜，厚度约20nm。性能良好的支持膜应具备：1.较

21、高的透明度2.在电镜下无可见结构3.与所支持的各种样品不发生化学反应方华膜、碳膜、火棉胶基底碳膜、硝化纤维素基底碳膜、微筛膜等支持膜的制作支持膜的制作方华膜（方华的化学成分是聚乙烯醇缩甲醛，为淡黄色粉末）：准备-附膜-漂膜-捞膜支持膜的制作支持膜的制作碳膜：观察高分辨率的样品及某些悬浮液对方华膜有溶解作用时需用碳膜。碳膜的机械性能及化学性能较好，减少热漂移。喷膜-漂膜摆网-捞膜切片的厚度可根据干涉色来判断切片的厚度可根据干涉色来判断。暗灰色调暗灰色调 40nm 40nm 灰色灰色 40-50nm40-50nm，较薄，易被电子较薄，易被电子 束击破束击破 银白色银白色 60-70nm60-70n

22、m，最常用最常用金黄色金黄色 70-80nm 70-80nm 紫色为紫色为 90nm90nm以上，较厚，细节结以上，较厚，细节结 构不清构不清 超薄切片质量好坏指标超薄切片质量好坏指标样品结构保存良好，结构细腻，无丢失。样品结构保存良好，结构细腻，无丢失。切片厚薄均匀，厚度在切片厚薄均匀，厚度在60-90nm60-90nm之间。表面之间。表面无皱折、刀痕、震颤等缺陷。无皱折、刀痕、震颤等缺陷。样品反差良好，无染色沉淀。样品反差良好，无染色沉淀。支持膜厚度适中，观察时不产生漂移和破裂。支持膜厚度适中，观察时不产生漂移和破裂。六六.电子染色电子染色利用重金属盐类选择性地与生物样品中不同利用重金属盐

23、类选择性地与生物样品中不同结构成分相结合，来提高结构成分散射电子结构成分相结合，来提高结构成分散射电子的能力，从而增加图像反差的染色，又称为的能力，从而增加图像反差的染色，又称为正染色正染色。常用的染色剂常用的染色剂:0.50.5醋酸双氧铀醋酸双氧铀可使核酸、蛋白质、结缔组织纤维的反差增强。可使核酸、蛋白质、结缔组织纤维的反差增强。0.10.10.40.4柠檬酸铅柠檬酸铅可使膜结构、脂类的反差增强。可使膜结构、脂类的反差增强。v正染色正染色vTEMTEM样品样品：超薄切片厚度要均匀超薄切片厚度要均匀无震颤无震颤无刀痕无刀痕无染色污染无染色污染反差适当反差适当负染技术负染技术 指利用重金属盐类与

24、结构背景指利用重金属盐类与结构背景相结合，增加背景电子散射能相结合，增加背景电子散射能力，使背景呈黑色，样品结构力，使背景呈黑色，样品结构变亮。变亮。v染色剂染色剂 磷钨酸（磷钨酸（PTAPTA）pH 6.7-7pH 6.7-7v染色步骤染色步骤 复膜载网滴样品复膜载网滴样品-滴染滴染1-21-2minmin用滤纸用滤纸吸去染液观察吸去染液观察v优点优点 适用于悬浮液的样品（细菌、病毒、其他适用于悬浮液的样品（细菌、病毒、其他微生物、大分子、分离细胞器）微生物、大分子、分离细胞器）操作快速、简便操作快速、简便 样品用量少样品用量少 图像结构反差好图像结构反差好小结：（超薄切片）1.取材:要求部

25、位准确,块小,时间短,低温,器械锋利,减小机械损伤.2.固定:戊二醛固定时间可以适当延长,一般不要超过一周,期间要更换一次固定液,且要保持低温固定,充分清洗后再进行锇酸固定1-2小时,时间一定不要太长.3.脱水:锇酸固定后经过充分清洗,进行酒精梯度脱水,一般50%,70%,80%,95%,无水酒精,4.样品侵透,包埋.一定要保持干燥,侵透彻底.5.聚合:由室温到高温梯度升温聚合.如35度,45度,60度顺序.6.超薄切片:切片机性能,片厚度,捞片,载网质量都需要注意.7.电子染色:过程中一定要避免一切污染.注意事项注意事项 （负染）（负染）样品浓度要适中样品浓度要适中 样品要不含杂质样品要不含

26、杂质 样品的样品的pHpH值要与染液值要与染液pHpH值一致值一致 掌握滴染时机（样品要未完全干燥时）掌握滴染时机（样品要未完全干燥时）负染样品观察时，加速电压要适当负染样品观察时，加速电压要适当,物镜物镜光阑要小，反差较好，照相要快光阑要小，反差较好，照相要快.Fig.1.Fig.1.The labelling results of colloidal gold probe.A:colloidal gold,B:labeled colloidal gold(showing the protein halo around the labeled particles).Fig.4.Colloidal gold nanoparticles(20 nm).1:anti-TTX Mab labelled colloidal gold nanoparticles(showing the protein halo around the labelled nanoparticles),2:unlabelled colloidal gold nanoparticles.Food Chemistry