第五章体内药物分析课件.ppt

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1、第一节第一节 体内样品的采集与贮藏体内样品的采集与贮藏第二节第二节 体内样品分析的前处理体内样品分析的前处理第三节第三节 体内样品分析方法与方法验体内样品分析方法与方法验证证第五章第五章 体内药物分析体内药物分析体内药物分析体内药物分析：是指体内样品（如体液、组织、器官和排泄物是指体内样品（如体液、组织、器官和排泄物等）中等）中药药物物及其及其代谢代谢物物或或内内源源性生物活性物性生物活性物质质的定量分析。的定量分析。药物进入体内后，其化学结构与存在状态均可能发生变化。药物进入体内后，其化学结构与存在状态均可能发生变化。存存在在状状态态游离型的药物或代谢物游离型的药物或代谢物结合型的药物或代谢

2、物、结合物（缀合物）结合型的药物或代谢物、结合物（缀合物）体内样品的体内样品的特点特点1样品量少、不能重复取样样品量少、不能重复取样：体内样品采样量一般为几十体内样品采样量一般为几十微升至数毫升；多数在特定条件下采集，无法再次取样。微升至数毫升；多数在特定条件下采集，无法再次取样。2被测成分浓度低被测成分浓度低：通常在通常在10-910-6g/ml，甚至，甚至10-12g/ml。3干扰物质多干扰物质多：血样中含有蛋白质、脂肪等和大量内源性血样中含有蛋白质、脂肪等和大量内源性物质；以及代谢物、结合物等均可能干扰测定。物质；以及代谢物、结合物等均可能干扰测定。1 1体内体内样样品一般均需经过分离、

3、净化后才能进行分析。品一般均需经过分离、净化后才能进行分析。2 2对对分析方法的灵敏度及专属性要求较高。在测定前需浓分析方法的灵敏度及专属性要求较高。在测定前需浓缩、富集以适应分析方法要求。缩、富集以适应分析方法要求。3 3分析工作量大，数据的处理和阐明较为复杂。分析工作量大，数据的处理和阐明较为复杂。体体内药物分析的特点内药物分析的特点色谱分析法色谱分析法：HPLC、UPLC、GC、HPCE 灵敏度高、专属性强灵敏度高、专属性强免疫分析法免疫分析法：RIA、FIA、EIA 灵敏度很高、专属性较强灵敏度很高、专属性较强生物学方法：生物学方法：体内样品中抗生素类药物的测定体内样品中抗生素类药物的

4、测定体内体内药物药物测定测定方法方法第一节第一节 体内样品的采集与贮藏体内样品的采集与贮藏一一 体内样体内样品的品的种类种类二二 体内样体内样品品的采集与制备的采集与制备三三 体内样体内样品品的贮存与处理的贮存与处理血液血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、淋巴液、粪便等脑脊液、泪液、胆汁、胃液、淋巴液、粪便等尿液尿液主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生物利用度等研究，以及测定代谢物类型等物利用度等研究，以及测定代谢物类型等脑脊液脑脊液怀疑药物损伤血脑屏障怀疑药物损伤血脑屏

5、障一一 体内样品的种类体内样品的种类二二 体内样体内样品品的采集与制备的采集与制备（一）血（一）血样样：离心离心全血全血离心离心上层：血清上层：血清(serum)下层：血细胞（凝块）下层：血细胞（凝块）上层：血浆上层：血浆(plasma)下层：血细胞下层：血细胞血血液液自然凝结自然凝结加抗凝剂加抗凝剂采取：一般是静脉取血、针刺手指、耳垂取血采取：一般是静脉取血、针刺手指、耳垂取血 动动物实验可直接从动脉或心脏采取物实验可直接从动脉或心脏采取（二）尿液（二）尿液优点：采取简便，取样量大，受试者无痛苦。优点：采取简便，取样量大，受试者无痛苦。缺点：药物浓度变化也大，需采集一定时间内的尿样。缺点：药

6、物浓度变化也大，需采集一定时间内的尿样。采取采取：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。：动物应在代谢笼中进行，通过笼下漏斗接收。药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式从尿中药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物形式从尿中排出。尿中药物大多呈缀合状态，测定前要将缀合的药物游离。排出。尿中药物大多呈缀合状态，测定前要将缀合的药物游离。（三）唾（三）唾液液：优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。优点：样品易得，取样无痛苦，尤易为儿童接收。缺点：药物浓度变化大缺点：药物浓度变化大采取采取：漱口：漱口1515分钟，收集自然流出或经舌在口内搅动流出分钟，收集自然流出或经舌在口内搅动流

7、出的唾液。也可采取物理、化学方法刺激使唾液流出。的唾液。也可采取物理、化学方法刺激使唾液流出。制备制备：采取后，立即测量除去泡沫部分的体积。：采取后，立即测量除去泡沫部分的体积。分层分层离心离心取上清液取上清液（四）组织（四）组织：药物动物实验、服用药物过量中毒死亡时使用组织药物动物实验、服用药物过量中毒死亡时使用组织常用的脏器组织有：胃、肝、肾、心、肺、脑等常用的脏器组织有：胃、肝、肾、心、肺、脑等 制备制备：组织样品在测定之前，需先加入一定量水或缓冲液匀浆：组织样品在测定之前，需先加入一定量水或缓冲液匀浆均匀化。均匀化。处理处理：沉淀蛋白、酸水解或碱水解：沉淀蛋白、酸水解或碱水解、酶水解（

8、枯草菌溶素）酶水解（枯草菌溶素）三、体内样品的贮三、体内样品的贮存存 取样后最好立即进行分析，不能立即分析的，则短期内冷取样后最好立即进行分析，不能立即分析的，则短期内冷藏藏(4)，长期冰冻，长期冰冻(-20或或-8070)。全血未经分离，不宜直接冷冻保持。全血未经分离，不宜直接冷冻保持。尿液是很好的细菌生长液，若需收集尿液是很好的细菌生长液，若需收集24小时或更长时间的小时或更长时间的样品或不能立即测定的，应置冰箱冷藏或加防腐剂（样品或不能立即测定的，应置冰箱冷藏或加防腐剂（1%甲苯、甲苯、过饱和氯过饱和氯仿等）仿等）保存。保存。注意注意：避免将样品反复解冻避免将样品反复解冻-冷冻冷冻-解冻

9、解冻冷冻前分装成若干小份贮存冷冻前分装成若干小份贮存（一）冷藏与一）冷藏与冷冻冷冻1、终止酶的活性、终止酶的活性 液氮中快速冷冻液氮中快速冷冻 微波照射微波照射 匀浆及沉淀匀浆及沉淀 加入酶活性阻断剂（氟化钠、四氢尿苷、三氯醋酸等）加入酶活性阻断剂（氟化钠、四氢尿苷、三氯醋酸等）2、阻止药物氧化及光解：、阻止药物氧化及光解：易被氧化药物，加抗氧剂（如维生素易被氧化药物，加抗氧剂（如维生素C）（二）去活性二）去活性第二节第二节 体内体内样品样品分析分析的前处理的前处理药药物在体内的存在形式物在体内的存在形式游离型：原形药物或代谢物游离型：原形药物或代谢物缀合物：药物或其代谢物与葡萄糖醛酸缀合物：

10、药物或其代谢物与葡萄糖醛酸或硫酸或硫酸等结合等结合结合物：药物与蛋白质结合结合物：药物与蛋白质结合一、体内样一、体内样品前处理的目的品前处理的目的2 2 2 2、满足测、满足测、满足测、满足测定方定方定方定方法的灵法的灵法的灵法的灵敏度、准确度和专属性敏度、准确度和专属性敏度、准确度和专属性敏度、准确度和专属性3 3 3 3、改善分析环境改善分析环境改善分析环境改善分析环境：保护测定仪器不受保护测定仪器不受保护测定仪器不受保护测定仪器不受体内体内体内体内样品中类脂和蛋白样品中类脂和蛋白样品中类脂和蛋白样品中类脂和蛋白质等的污染。质等的污染。质等的污染。质等的污染。1 1 1 1、使待测药物游离

11、、使待测药物游离、使待测药物游离、使待测药物游离二、生二、生物样品前处理方法物样品前处理方法分分分分离与离与离与离与浓集浓集浓集浓集化学衍生化化学衍生化去除蛋白质去除蛋白质缀合物的水解缀合物的水解（一）去（一）去除蛋白质除蛋白质加入与水混融加入与水混融的的有机溶剂有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)加加入入中性盐中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)加加入入强酸强酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金属沉淀剂加入金属沉淀剂(CuSO(CuSO4 4-Na-Na2 2WOWO4 4、ZnSOZnSO4 4-NaOH)-

12、NaOH)热凝固法热凝固法水溶性有机溶剂除蛋白效果水溶性有机溶剂除蛋白效果血清与水溶性有机溶剂比例为血清与水溶性有机溶剂比例为1:(13)可可除除90%蛋白蛋白乙腈乙腈块状絮凝物、易于分离；块状絮凝物、易于分离；成分损失可能性大，上清液成分损失可能性大，上清液pHpH为为8.5-9.58.5-9.5甲醇甲醇细小颗粒沉淀、不易分细小颗粒沉淀、不易分离；成分损失可能性小，上清离；成分损失可能性小，上清液液pHpH为为8.5-9.58.5-9.5超速离心分离（超速离心分离（12000r/min)12000r/min)离心离心1-2min1-2min强酸及中性盐除蛋白效果强酸及中性盐除蛋白效果血清与饱

13、和硫酸铵比例为血清与饱和硫酸铵比例为1：2可可除除90%蛋白蛋白血清与强酸比例为血清与强酸比例为1：0.6可可除除90%蛋白蛋白（二）缀（二）缀合物的水解合物的水解尿液中药物多数呈缀合物状态。尿液中药物多数呈缀合物状态。（1 1）酸水解：适量盐酸）酸水解：适量盐酸（2 2）酶水解：）酶水解：常用常用-葡葡糖糖醛酸糖糖醛酸苷酶或硫酸酯苷酶或硫酸酯酶或两者混合。酶或两者混合。（3 3）溶剂解）溶剂解 某些药物的硫酸酯，往往加入萃取溶剂时发生某些药物的硫酸酯，往往加入萃取溶剂时发生分解，同时提取入有机溶剂中。分解，同时提取入有机溶剂中。目的：从大量共存物中分离出所需要的微量组分目的：从大量共存物中分

14、离出所需要的微量组分方法：方法：1 1、液相萃、液相萃取（取（liquid-liquid extraction,LLE）（三）分离与（三）分离与浓集浓集2 2、固固相相萃取萃取（solid phase extraction，S SP PE E）液液-液萃取中需注意的问题：液萃取中需注意的问题：适当的有机溶剂：常用乙醚、氯仿、适当的有机溶剂：常用乙醚、氯仿、乙酸乙酯乙酸乙酯等。等。离子型药物：离子对萃取离子型药物：离子对萃取（ion pair extraction）提取技术：提取技术：适当的水相适当的水相pH值值1 1、液相萃、液相萃取（取（LLELLE）多数药物是亲脂性的，可用有机溶剂萃取出来

15、，多数药物是亲脂性的，可用有机溶剂萃取出来，而大多数内源性杂质是强极性的，不被萃取出。而大多数内源性杂质是强极性的，不被萃取出。对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对萃取对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对萃取 适当的水相适当的水相pH值：值：由药物的由药物的pKa值确定，一般碱性药物在碱性条件、酸性值确定，一般碱性药物在碱性条件、酸性药物在酸性条件下萃取。药物在酸性条件下萃取。碱性药物最佳碱性药物最佳pH 高于高于pKa值值1-2个个pH单位单位酸性药物最佳酸性药物最佳pH 低于低于pKa值值1-2个个pH单位单位中性药物：中性药物：pH=7 附近附近为避免体液中杂质进入有

16、机相，溶液为避免体液中杂质进入有机相，溶液pH值偏高一些较好值偏高一些较好空白血清的乙醚提取物的空白血清的乙醚提取物的HPLC图图（UV-220nm检测）检测）pH为为13时空白血时空白血清杂质峰最少清杂质峰最少 提取溶剂用量：提取溶剂用量：有机相与水相比1:1或2:1 提取方式：密塞情况下，将提取方式：密塞情况下，将萃取试管萃取试管置于振荡器或涡旋混合置于振荡器或涡旋混合器混合，也可采用首尾颠倒的方式混合。器混合，也可采用首尾颠倒的方式混合。提取次数：尽可能少，不要求提取完全，而要求适量而稳定提取次数：尽可能少，不要求提取完全，而要求适量而稳定的提取率。的提取率。离心与分离离心与分离 通常离

17、心机通常离心机4000rpm，离心，离心10min分离出有机相。分离出有机相。提取技术：提取技术：2 2、固相萃、固相萃取取（SPESPE）担担体体亲水性：硅藻土亲水性：硅藻土疏水性：活性炭、聚苯乙烯或疏水性：活性炭、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶化学键合硅胶常用微型柱：常用微型柱：Bound Elut 、Sep-pak 利用固体材料为固定相，当含多组分的体内利用固体材料为固定相，当含多组分的体内样品溶液通过时，固定相对各组分具有不同的亲样品溶液通过时，固定相对各组分具有不同的亲和性，一些组分受到和性，一些组分受到“分配分配”或或“吸附吸附”作用而作用而滞留在固定相上，当使用流动相冲洗时，由于流

18、滞留在固定相上，当使用流动相冲洗时，由于流动相对组分的亲和性更强，遂按组分洗脱的难易，动相对组分的亲和性更强，遂按组分洗脱的难易，将其携带出柱，使之达到分离。将其携带出柱，使之达到分离。用有机溶剂用有机溶剂(甲醇甲醇)冲洗冲洗洗净洗净用水冲洗用水冲洗活化活化上样上样用水或缓冲液冲洗，洗去用水或缓冲液冲洗，洗去内源性物质内源性物质有机溶剂洗脱药物有机溶剂洗脱药物收集洗脱液收集洗脱液微型微型柱固相萃柱固相萃取步骤取步骤真空固相萃取装置真空固相萃取装置固相微萃取法固相微萃取法（Solid-phase microextraction,SPME）SPME 装置图装置图 1、压杆、压杆 2.筒体筒体 3.

19、压杆卡持螺钉压杆卡持螺钉 4.Z 形槽形槽 5.筒体视窗筒体视窗 6.调节针头长度的定位器调节针头长度的定位器 7.拉伸弹簧拉伸弹簧 8.密封隔膜密封隔膜 9.注射外管注射外管10.熔融石英纤维熔融石英纤维 11.熔融石英纤维熔融石英纤维（表面涂（表面涂有高分子固相液膜）有高分子固相液膜）3 3、被、被测组分的浓集测组分的浓集浓集方法：浓集方法：浓集方法：浓集方法：1 1、末次提取时，加入溶剂尽可能少、末次提取时，加入溶剂尽可能少2 2、挥去溶剂：、挥去溶剂：（1 1）通入气流（氮气）吹干）通入气流（氮气）吹干（2 2）减压法：适于易随气流挥发或遇热不稳定药物）减压法：适于易随气流挥发或遇热不

20、稳定药物（四）化（四）化学衍生化学衍生化GC中，极性较大、挥发性低的药物或代谢物中，极性较大、挥发性低的药物或代谢物极性极性小、稳定性好的衍生物小、稳定性好的衍生物HPLC中，分子结构无中，分子结构无紫外、荧光吸紫外、荧光吸收收具具紫外吸收紫外吸收或荧光的衍生物或荧光的衍生物GC中化学衍中化学衍生化生化RCOOH、ROH、RSH、RNH2CH3I、CH3N2等等RCOOCH3、ROCH3、RSCH3、RNHCH3例：烷基化例：烷基化极性降低，挥发性增加极性降低，挥发性增加烷基化（烷基化（碘庚烷、叠氮甲烷）碘庚烷、叠氮甲烷）酰化（乙酸酐、丙酸酐）酰化（乙酸酐、丙酸酐）硅烷化（三甲基氯硅烷硅烷化（

21、三甲基氯硅烷TMCS等）。等）。HPLC中化学衍生化中化学衍生化化学衍生化学衍生化化分类分类柱后衍生化柱后衍生化柱前衍生化柱前衍生化衍衍生生化化方法方法紫外衍生化紫外衍生化荧光衍生化：邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。荧光衍生化：邻苯二醛、丹酰氯、荧胺等。非对映衍生化：手性衍生化试剂将药物对映异非对映衍生化：手性衍生化试剂将药物对映异构体转变为非对映异构体，用常规构体转变为非对映异构体，用常规HPLC测定。测定。第三节第三节 体内样品分析方法与方法验证体内样品分析方法与方法验证一、分析方法的建立一、分析方法的建立（一）方法的选择（一）方法的选择1、色谱分析法：、色谱分析法：GC、HPLC、GC-MS、

22、HPLC-MS 适合大多数小分子药物及代谢物的测定适合大多数小分子药物及代谢物的测定2、免疫分析法：、免疫分析法：RIA、FIA、EIA 多用于蛋白质、多肽等生物大分子类的检测多用于蛋白质、多肽等生物大分子类的检测3、生物学方法：抗生素类药物的体内分析，需与特异性高的色、生物学方法：抗生素类药物的体内分析，需与特异性高的色谱法平行检测谱法平行检测（二）分（二）分析方法建立的一析方法建立的一般程序般程序1、对照品测定：选择测定条件、浓度线性范围等、对照品测定：选择测定条件、浓度线性范围等2、经过纯化处理的空白样品测定：测定空白值，、经过纯化处理的空白样品测定：测定空白值，考虑分离度。考虑分离度。

23、3、空白样品加对、空白样品加对照品（质控样品）测照品（质控样品）测定：求得样定：求得样品回收率，检验样品中是否有干扰。品回收率，检验样品中是否有干扰。4、体内实际样品测定、体内实际样品测定二二 分析方法的验证分析方法的验证(一一)特异性特异性(二二)标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围(三三)精密度与准确度精密度与准确度(四四)定量下限定量下限(五五)样品样品稳定性稳定性(六六)提取回收率提取回收率 所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和相应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。相应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。空白

24、血浆空白血浆空白血浆标准物质空白血浆标准物质受试血浆受试血浆(一一)特异性特异性1、内源性物质的干扰、内源性物质的干扰：比较待测物标准物质、至少比较待测物标准物质、至少6个不同个体的空白生物介质和质控样品的检测信号个不同个体的空白生物介质和质控样品的检测信号2、未知代谢物的干扰：、未知代谢物的干扰：比较至少比较至少6个不同个体用药后个不同个体用药后的实际体内样品和质控样品的检测信号的实际体内样品和质控样品的检测信号3、伍用药物的干扰：、伍用药物的干扰：比较待测药物、伍用药物、质控比较待测药物、伍用药物、质控样品和添加伍用药物的干扰样品的检测信号样品和添加伍用药物的干扰样品的检测信号4、与参比方

25、法的相关性：、与参比方法的相关性：(二二)标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围Y=9.566 10-2X+6.153 10-3 r=0.9995u空白生物介质加入系列标准溶液空白生物介质加入系列标准溶液u至至少少6 6个浓度点建立标准曲线个浓度点建立标准曲线u线性范围必须覆盖全部待测浓度，线性范围必须覆盖全部待测浓度，不得外推不得外推6.4 12.8 19.2 25.6 3232.41.81.20.60茶碱茶碱(g/ml)isHH最高浓度应高于达峰浓度最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于最低浓度应低于Cmax的的10%5%回归方程的截距应接近于零回归方程的截距应接近于零相关系数要

26、求相关系数要求 0.99(色谱法色谱法)或或0.98(生物学方法生物学方法)附附录录药药物物制制剂剂人人体体生生物物利利用用度度和和生生物物等等效效性性试试验验指指导导原原则则规规定定相相对对回回收收率率一一般般应应在在85115%范范围围内，在内，在LOQ附近应在附近应在80120%范围内。范围内。(三三)精密度与准确度精密度与准确度1、准确度准确度方法：方法：取空白生物基质（如血浆）数份，加入高、中、低三种取空白生物基质（如血浆）数份，加入高、中、低三种浓度的药物对照品，制备质控浓度的药物对照品，制备质控(quality control，QC)样品，照样品，照标准曲线项下方法操作，用标准曲

27、线计算标准曲线项下方法操作，用标准曲线计算 高高(接近上限接近上限)、中、低、中、低(LLOQ的的3倍倍)3个浓度个浓度 每一浓度至少每一浓度至少5个样本个样本 与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定定1次次 方法：方法：日内精密度（日内精密度（intra-day Precision）：）：将高、中、低三种药浓样品，每种分别取样将高、中、低三种药浓样品，每种分别取样3-5次，同一次，同一天内同一仪器测定。天内同一仪器测定。日间精密度（日间精密度（inter-day Precision）：）：将高、中、低三种药浓样品，一周（或将高、中、低三

28、种药浓样品，一周（或10天）内分别取天）内分别取样样3-5次测定。次测定。2、精密度、精密度 批内精密度：批内精密度：将高、中、低三种药浓样品，每一浓度将高、中、低三种药浓样品，每一浓度56个样品，个样品，每个样品测定每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每个浓度及每1浓浓度的度的RSD批间精密度：批间精密度：每每1分析批内每一浓度制备分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算次；用随行标准曲线计算3个浓度个浓度(每一浓度每一浓度56个分析批数个分析批数据据)的的RSD(四四)定量下限定量下限（LLOQ）LLOQ

29、是标准曲线上的最低浓度点，即测定样品中符合准是标准曲线上的最低浓度点，即测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。确度和精密度要求的最低药物浓度。方法：方法：以标准曲线最低点作为定量下限（以标准曲线最低点作为定量下限（S/N5）要求：应能满足测定要求：应能满足测定35个消除半衰期后生物样品中的药个消除半衰期后生物样品中的药物浓度或物浓度或Cmax的的1/20 1/10时的药物浓度时的药物浓度 准确度在准确度在80%120%RSD20%1.长期贮存稳定性长期贮存稳定性 2.短期室温稳定性短期室温稳定性 3.冷冻冷冻解冻稳定性解冻稳定性 4.贮备液稳定性贮备液稳定性（五五）样品稳定性）样品稳

30、定性 提取回收率（绝对回收率）：指从生物样本介质中回收得到待提取回收率（绝对回收率）：指从生物样本介质中回收得到待测物的响应值与标准物质产生的响应值的比值。测物的响应值与标准物质产生的响应值的比值。萃萃取回收率取回收率称为，称为，是指经预处理（如萃取）后能将生物样品中是指经预处理（如萃取）后能将生物样品中的药物用于分析的比例，是评价预处理方案优劣的指标之一。的药物用于分析的比例，是评价预处理方案优劣的指标之一。实际分析时，由于生物样品中的药物难于做到完全回收，一实际分析时，由于生物样品中的药物难于做到完全回收，一般只要求萃取回收率稳定，且般只要求萃取回收率稳定，且50%。（六）提取（六）提取回收率回收率方法：方法：取空白生物基质取空白生物基质(如血浆如血浆)，照准确度项下方法，制备高、中、，照准确度项下方法，制备高、中、低低3个浓度的个浓度的QC样品样品(每一浓度至少每一浓度至少5个样品个样品)，每个样品分析，每个样品分析测定测定1次次另取等量的相同另取等量的相同3个浓度的标准溶液，个浓度的标准溶液，加入加入已处理后的空白已处理后的空白生物介质溶液，同法测定生物介质溶液，同法测定AT经萃取后的经萃取后的QC样品的检测信号或比值样品的检测信号或比值(内标法内标法)AS未经萃取的标准溶液的检测信号或比值未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法内标法)