实验三++实验理论-离心.ppt

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1、生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心离离 心心 技技 术术 Centrifugation techniques1 1l l基本概念及原理基本概念及原理l l离心技术的应用离心技术的应用l l离心机的构造及使用离心机的构造及使用洗衣机脱水筒洗衣机脱水筒洗衣机脱水筒洗衣机脱水筒2 2基本概念基本概念l l 离心技术离心技术 借助离心机旋转所产生的离心力，使借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术。不同大小和不同密度的物质分离的技术。l l 超速离心技术超速离心技术 根据物质沉降系数

2、、质量、浮力因子根据物质沉降系数、质量、浮力因子等的等的不同不同,应用强大的离心力使物质分离、应用强大的离心力使物质分离、浓缩、提纯的浓缩、提纯的方法方法.3 3基本原理基本原理l l离心力离心力离心力离心力 Centrifugal force (F)Centrifugal force (F)物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运物体作圆周运动时形成的一种迫使物体脱离圆周运动中心的动中心的动中心的动中心的力。力。力。力。离心力离心力离心力离心力 F=ma=mF=ma=m2 2r r :旋转角速度旋转角

3、速度旋转角速度旋转角速度 r:r:旋转体离旋转轴的距离旋转体离旋转轴的距离旋转体离旋转轴的距离旋转体离旋转轴的距离 2n2n =(=(radrad/sec)/sec)60 60 n n：转子每分钟的转数：转子每分钟的转数：转子每分钟的转数：转子每分钟的转数(rpm)(rpm)4 4l l沉降系数沉降系数沉降系数沉降系数S(Svedberg)S(Svedberg)单位离心力作用下颗粒沉降的速度单位离心力作用下颗粒沉降的速度单位离心力作用下颗粒沉降的速度单位离心力作用下颗粒沉降的速度.2.12.1 10102 2 logX2/X1logX2/X1S =S =n n2 2 (t2-t1)(t2-t1

4、)X1:X1:离心前粒子离旋转轴的距离离心前粒子离旋转轴的距离离心前粒子离旋转轴的距离离心前粒子离旋转轴的距离 X2:X2:离心后粒子离旋转轴的距离离心后粒子离旋转轴的距离离心后粒子离旋转轴的距离离心后粒子离旋转轴的距离 n n：转子每分钟的转数：转子每分钟的转数：转子每分钟的转数：转子每分钟的转数(rpm)(rpm)t2-t1t2-t1：离心时间（：离心时间（：离心时间（：离心时间（s s）S S在实际应用时常在在实际应用时常在在实际应用时常在在实际应用时常在1010-13-13秒左右，故把沉降系数秒左右，故把沉降系数秒左右，故把沉降系数秒左右，故把沉降系数1010-13-13秒秒秒秒称为一

5、个称为一个称为一个称为一个SvedbergSvedberg单位，简写为单位，简写为单位，简写为单位，简写为S S，量纲为秒。量纲为秒。量纲为秒。量纲为秒。沉降系数越沉降系数越沉降系数越沉降系数越大，相对分子质量越大大，相对分子质量越大大，相对分子质量越大大，相对分子质量越大5 5离心机的装置及应用离心机的装置及应用l l 离心机的种类离心机的种类离心机的种类离心机的种类 一般分常速一般分常速一般分常速一般分常速,高速和超高速离心机高速和超高速离心机高速和超高速离心机高速和超高速离心机1 1 常速离心机常速离心机常速离心机常速离心机 5000r/min,5000r/min,用用用用途途途途：分分

6、分分离离离离细细细细胞胞胞胞、细细细细胞胞胞胞碎碎碎碎片片片片、培培培培养养养养基残渣及粗结晶等较大颗粒基残渣及粗结晶等较大颗粒基残渣及粗结晶等较大颗粒基残渣及粗结晶等较大颗粒2 2 高速离心机高速离心机高速离心机高速离心机 5000500020000r/min,20000r/min,用用用用途途途途：分分分分离离离离各各各各种种种种沉沉沉沉淀淀淀淀物物物物、细胞碎片及较大的细胞器等细胞碎片及较大的细胞器等细胞碎片及较大的细胞器等细胞碎片及较大的细胞器等6 6uu3 3 超高速离心机超高速离心机超高速离心机超高速离心机 200002000060000r/min60000r/min 结结结结构构

7、构构：离离离离心心心心管管管管帽帽帽帽、冷冷冷冷冻冻冻冻装装装装置置置置和和和和温温温温控控控控系系系系统统统统、真真真真空空空空系系系系统统统统、安全保护系统、制动系统、指示仪表等。安全保护系统、制动系统、指示仪表等。安全保护系统、制动系统、指示仪表等。安全保护系统、制动系统、指示仪表等。uu按用途分：按用途分：按用途分：按用途分：制备用超速离心机：制备用超速离心机：制备用超速离心机：制备用超速离心机：分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等 分析用超速离心机：分析用超速离心机：分析用超速离心机：

8、分析用超速离心机：测定样品纯度（根据紫外吸收率或折光率等判断）测定样品纯度（根据紫外吸收率或折光率等判断）测定样品纯度（根据紫外吸收率或折光率等判断）测定样品纯度（根据紫外吸收率或折光率等判断）、沉降系数、相对分子量、沉降系数、相对分子量、沉降系数、相对分子量、沉降系数、相对分子量7 7国产超高速离心机国产超高速离心机Beckman超高速离心机超高速离心机8 8l l 离心方法的选择离心方法的选择 对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时大小

9、和密度相差较大，只要选择好离心速度和时大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。间，就能达到分离效果。间，就能达到分离效果。间，就能达到分离效果。超速离心的离心方法：超速离心的离心方法：超速离心的离心方法：超速离心的离心方法：差速离心差速离心差速离心差速离心 密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心密度梯度离心速率速率-区带区带等密度梯度离心等密度梯度离心9 91 差速离心差速离心 采用不同的离心速度采用不同的离心速度采用不同的离心速度采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度和离心时间，使沉降速度和离心时间，使沉降速度和离心时间，使沉

10、降速度不同的颗粒分批分离的方不同的颗粒分批分离的方不同的颗粒分批分离的方不同的颗粒分批分离的方法。主要用于分离大小和法。主要用于分离大小和法。主要用于分离大小和法。主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。密度差异较大的颗粒。密度差异较大的颗粒。密度差异较大的颗粒。10102 速率速率-区带离心区带离心 样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。梯度液的最大密近的物质得以分离的一种区带分离方法。梯度液的最大密近的物质得以分

11、离的一种区带分离方法。梯度液的最大密近的物质得以分离的一种区带分离方法。梯度液的最大密度不超过样品组分的密度。度不超过样品组分的密度。度不超过样品组分的密度。度不超过样品组分的密度。样品铺在密度梯度溶液表面，离心后，由于样品组分样品铺在密度梯度溶液表面，离心后，由于样品组分样品铺在密度梯度溶液表面，离心后，由于样品组分样品铺在密度梯度溶液表面，离心后，由于样品组分的沉降系数不同，运动速率也不同。选择某一特定时刻的沉降系数不同，运动速率也不同。选择某一特定时刻的沉降系数不同，运动速率也不同。选择某一特定时刻的沉降系数不同，运动速率也不同。选择某一特定时刻,当样品组分各区带之间的距离拉得最远时停止

12、离心，即可当样品组分各区带之间的距离拉得最远时停止离心，即可当样品组分各区带之间的距离拉得最远时停止离心，即可当样品组分各区带之间的距离拉得最远时停止离心，即可以达到分离目的。以达到分离目的。以达到分离目的。以达到分离目的。常用的介质包括甘油和蔗糖。常用的介质包括甘油和蔗糖。常用的介质包括甘油和蔗糖。常用的介质包括甘油和蔗糖。1111聚蔗糖聚蔗糖聚蔗糖聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度泛影葡胺分层液密度梯度泛影葡胺分层液密度梯度泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞离心法分离外周血单个核细胞离心法分离外周血单个核细胞离心法分离外周血单个核细胞3 等密度梯度离心等密度梯度离心 在密度梯度介

13、质中，被分离在密度梯度介质中，被分离在密度梯度介质中，被分离在密度梯度介质中，被分离的不同密度的物质颗粒在离心力的不同密度的物质颗粒在离心力的不同密度的物质颗粒在离心力的不同密度的物质颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密作用下一直移动到与各自浮力密作用下一直移动到与各自浮力密作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置度相等的位置度相等的位置度相等的位置(等密度点等密度点等密度点等密度点)，并不，并不，并不，并不再运动，形成区带。再运动，形成区带。再运动，形成区带。再运动，形成区带。梯度液的密度范围必须包含梯度液的密度范围必须包含梯度液的密度范围必须包含梯度液的密度范围必须包含所有待分离物质的

14、密度。所有待分离物质的密度。所有待分离物质的密度。所有待分离物质的密度。常用的介质：铯盐，如常用的介质：铯盐，如常用的介质：铯盐，如常用的介质：铯盐，如CsClCsCl，CsCs2 2SOSO4 4，CsBrCsBr。1212离心机使用的注意事项离心机使用的注意事项l l离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除故障。故障。故障。故障。l l离心管必须对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样离心管必须对称放入套管中，防止机身振动

15、，若只有一支样离心管必须对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样离心管必须对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样品管另外一支要用等质量的水代替。品管另外一支要用等质量的水代替。品管另外一支要用等质量的水代替。品管另外一支要用等质量的水代替。l l启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。l l分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，

16、方可打分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。1313小结小结 离心技术已成为分离、纯化、鉴别和各离心技术已成为分离、纯化、鉴别和各离心技术已成为分离、纯化、鉴别和各离心技术已成为分离、纯化、鉴别和各种生物大分子的重要手段之一。种生物大分子的重要手段之一。种生物大分子的重要手段之一。种生物大分子的重要手段之一。原理简单原理简单原理简单原理简单,但是由于仪器的不同但是由于仪器的不同但是由于仪器的不同但是由于仪器的不同,需要在需要在需要在需要在实际操作中熟练掌握其正确的使用流程。实际操作中熟练掌握其正确的使用流程。实际操作中熟练掌握其正确的使用流程。实际操作中熟练掌握其正确的使用流程。1414