第七章-外源基因的表达及其优化策略课件.ppt

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1、第七章第七章 外源基因的表达及其优化策略外源基因的表达及其优化策略第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素 第二节外源基因在原核细胞中的表达第二节外源基因在原核细胞中的表达 第三节外源基因在真核细胞中的表达第三节外源基因在真核细胞中的表达第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素基因表达：基因表达：从从DNA分子有序地将其所承载的遗传信息分子有序地将其所承载的遗传信息,通过通过密码子密码子和反密码子和反密码子系统系统,转变由特定氨基酸顺序构成的转变由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白多肽或蛋白质质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。分子过程，从而决定生物有机体遗传表

2、型。基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。所有加工过程。基因工程中基因工程中基因高效表达研究基因高效表达研究是指外源基因在某种细是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。产物。第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素基因表达基因表达 遗传信息从遗传信息从DNA到蛋白质的到蛋白

3、质的传递过程传递过程中心法则（中心法则（central dogma）。）。第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素克隆基因的表达克隆基因的表达 外源基因在宿主细胞中表达外源基因在宿主细胞中表达 外源基因外源基因 表达载体表达载体 重组载体重组载体 导入宿主细胞导入宿主细胞 在宿主细胞中在宿主细胞中 表达出蛋白质表达出蛋白质 提取蛋白提取蛋白 宿主细胞：宿主细胞：原核细胞或真核细胞原核细胞或真核细胞第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素 影响外源基因表达的因素主要有：影响外源基因表达的因素主要有：阅读框架阅读框架 顺式作用元件顺式作用元件 翻译过程翻译过程 表达

4、体系表达体系第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素 一、阅读框架对转化基因的影响一、阅读框架对转化基因的影响 什么是阅读框架什么是阅读框架(open reading frame,ORF)?二、顺式作用元件对基因表达的影响二、顺式作用元件对基因表达的影响 1.对基因转录起始的调控对基因转录起始的调控 1)启动子启动子 2)增强子增强子 3)沉默子沉默子第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素 二、顺式作用元件对基因表达的影响二、顺式作用元件对基因表达的影响 2.对基因转录终止的调控对基因转录终止的调控 1)终止子终止子 2)衰减子衰减子 3.对对DNA结构的影响

5、结构的影响 1)核基质结合区：一段与核基质特异结合的核基质结合区：一段与核基质特异结合的DNA序列。序列。2)绝缘子：对一侧有作用，对另一侧没有。绝缘子：对一侧有作用，对另一侧没有。3)基因座控制区：通过改变染色质结构导致基因转录。基因座控制区：通过改变染色质结构导致基因转录。第一节影响外源基因表达的因素第一节影响外源基因表达的因素 三、翻译过程对表达的影响三、翻译过程对表达的影响 1.翻译起始对基因表达的影响翻译起始对基因表达的影响 2.密码子偏爱性对基因表达的影响密码子偏爱性对基因表达的影响 3.翻译终止对基因表达的影响翻译终止对基因表达的影响 四、表达系统对表达产物的影响四、表达系统对表

6、达产物的影响第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 外源基因表达系统由外源基因表达系统由基因表达载体基因表达载体和相应的和相应的受体细胞受体细胞两部分组成。两部分组成。宿主细胞分为两大类：宿主细胞分为两大类：第一类为原核细胞第一类为原核细胞：大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞第二类为真核细胞：酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母，已建立了许多适合它目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母，已建立了许多适合它们的克隆载体和们的克隆载体和DNADNA

7、导入方法。许多外源基因已获得成功表达。导入方法。许多外源基因已获得成功表达。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达用原核生物作宿主。用原核生物作宿主。A dividing E.coli 原核或噬菌体启动子原核或噬菌体启动子 MCS SD序列序列 终止子终止子 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有全基因组测序，共有44054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善基因克隆

8、表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国被美国FDAFDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白真核与原核生物结构

9、上存在差别真核与原核生物结构上存在差别第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物细胞表达的特点一、原核生物细胞表达的特点 1.原核生物只有原核生物只有一种一种RNA聚合酶聚合酶识别原核细胞的启动识别原核细胞的启动子，催化所有子，催化所有RNA的合成。的合成。2.原核生物的表达是以原核生物的表达是以操纵子操纵子为单位的。为单位的。Z Z编码编码-半乳糖苷酶；半乳糖苷酶；Y Y编码编码-半乳糖苷透过酶；半乳糖苷透过酶；A A编码编码-半乳糖苷乙酰半乳糖苷乙酰基转移酶。基转移酶。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物细胞表达

10、的特点一、原核生物细胞表达的特点 3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物直接控制要慢。对基因产物直接控制要慢。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达一、原核生物细胞表达的特点一、原核生物细胞表达的特点 6.在大肠杆菌在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同译起始密码子及

11、同16S RNA 3末端碱基互补的序列，即末端碱基互补的序列，即SD序列序列。Shine-Dalgarno（S-D）sequence:含有一个启始密码子含有一个启始密码子和一段同核糖体和一段同核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。）序列。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达二、外源基因在原核细胞中表达具备条件二、外源基因在原核细胞中表达具备条件 1.通过通过表达载体表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。成外源蛋白。2.外源基因

12、不能带有间隔顺序外源基因不能带有间隔顺序(内含子内含子)，因而必须用，因而必须用cDNA或全化或全化学合成基因，而不能用基因组学合成基因，而不能用基因组DNA。3.必须利用原核细胞的必须利用原核细胞的强启动子强启动子和和SD序列序列等调控元件控制外源基等调控元件控制外源基因的表达。因的表达。4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架开放阅读框架(ORF)。5.利用利用宿主菌的调控系统宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。表达产物对宿主菌的毒害。第二节第二节 外源基因在

13、原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 原核生物基因表达载体的组成特征原核生物基因表达载体的组成特征 启动子启动子 核糖体结合位点核糖体结合位点(SD序列序列)终止子终止子 选择标记基因选择标记基因 复制子复制子 原核生物基因表达的受体系统原核生物基因表达的受体系统 大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统 链霉菌受体系统、蓝藻受体系统链霉菌受体系统、蓝藻受体系统大肠杆菌表达载体的基本成分大肠杆菌表达载体的基本成分第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表

14、达的调控三、原核生物基因表达的调控 1.启动子启动子 是是DNA上的能与上的能与RNA聚合酶结合并能起始聚合酶结合并能起始mRNA合成合成的序列。的序列。（1）启动子序列）启动子序列 大大肠肠杆杆菌菌的的所所有有启启动动子子中中都都有有两两段段一一致致顺顺序序（consensus sequence）。）。-35 Box 和和-10 Box 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达不同启动子的不同启动子的consensus sequences 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 1.启动

15、子启动子（1）启动子序列）启动子序列 -35 box：RNA聚合酶聚合酶 亚基的识别位点亚基的识别位点。5-TTGACA-3 -10 box（Pribnow Box）：）：5-TATAAT-3 TTGACATTGACA TATAAT TATAAT 转录起始位点转录起始位点 17bp17bp 5 5 核糖体结合位点核糖体结合位点 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达原核启动子共有序列的功能 三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 1.启动子启动子（1）启动子序列）启动子序列第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基

16、因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 1.启动子启动子 （2）翻译的起始位点）翻译的起始位点 a)核糖体结合位点（核糖体结合位点（ribosome binding site,RBS）Shine-Dalgarno（SD）sequence：mRNA上与核糖体上与核糖体16sRNA结合的序列。结合的序列。S-D序列距离序列距离AUG的距离也影响翻译，最佳距离的距离也影响翻译，最佳距离4-8 nt b)起始密码：位于起始密码：位于SD序列下游序列下游 AUG（91%）、）、GUG（8%）、）、UUG（1%）第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三

17、、原核生物基因表达的调控 2.RNA多聚酶多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录多聚酶转录tRNA，rRNA和和mRNA。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.转录终止子转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。启动子启动子 操纵区操纵区S-D序列序列 目的基因目的基因 终止子终止子 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.转录终止

18、子转录终止子 原理：原理：茎环结构茎环结构 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与与DNA的互作的互作 多聚多聚A/U 由于茎环由于茎环3段紧接一串段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。利于转录物脱落而不利于转录延续。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.转录终止子转录终止子第二节第二节 外源基因在原核

19、细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 3.转录终止子转录终止子第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达三、原核生物基因表达的调控三、原核生物基因表达的调控 4.翻译终止密码翻译终止密码 大肠杆菌偏爱大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上。一般安置上全部的三个终止密码全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（防止核糖体跳跃（skipping）。）。5.翻译增强子（翻译增强子（Translation enhancer）能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。的特殊序列。T

20、7噬菌体基因噬菌体基因10前导序列（简称前导序列（简称g10-L序列）序列）;大肠杆菌大肠杆菌atpE基因基因mRNA5-UTR中富含中富含U的区段的区段第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体1.非融合型表达载体非融合型表达载体载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。质融合在一起。S-D序列序列 ATG-外源基因外源基因-TAG 优点：优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏

21、。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：条件：条件：必须选择一个有必须选择一个有lacI的宿主菌。的宿主菌。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：结构组成：结构组成：1）强启动子）强启动子:tac（trp-lac）2）操纵基因：乳糖操纵子系统。）操纵基因：乳糖操纵子系统。trp的

22、的-35区区 lacUV5的的-10区区 laclac操纵基因操纵基因 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：结构组成：结构组成：3）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。如如JM105菌。菌。4）终止子：）终止子：rrnB的强终止子的强终止子 S-D序列和插入位点区：序列和插入位点区：S-DS-D 插入位点区插入位点区 Lac I 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、

23、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 1.非融合型表达载体非融合型表达载体 pKK223-3 载体：载体：结构组成：结构组成：6）载体的其余部分：来自）载体的其余部分：来自pBR322质粒。质粒。7）表达诱导物：）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）（乳糖的类似物，不会被降解）tac P Lac O S-D 插入位点区插入位点区 rrnB T 宿主宿主lac I 阻遏物阻遏物 IPTG 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 2.分泌型表达载体分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽

24、连在一载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：如：pIN III系列：系列：pIN III-comA1,pIN III-comA2,pIN III-comA3,第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 2.分泌型表达载体分泌型表达载体 pIN III系列系列 组成结构组成结构 1）强启动子：）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。启动子。2）调节基因：）调节基因：lac I。3）S-D序列和起始密码序列和起

25、始密码ATG。4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。5）插入位点区（多克隆位点）。）插入位点区（多克隆位点）。IppIpp lac Plac P lac Olac O S-D/ATGS-D/ATG ompaompa 插入位点插入位点 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达pIN III-comA1 四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 2.分泌型表达载体分泌型表达载体第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白

26、表达载体系统 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。起的。如：如：pGEX系列系列 优点：便于融合蛋白的分离和纯化。优点：便于融合蛋白的分离和纯化。组成结构：组成结构：1）启动子：）启动子：tac 2）操纵基因：）操纵基因：lacP 3）调节基因：）调节基因：lacI 4）S-D序列序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）谷胱甘肽巯基转移酶）第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合

27、蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 pGEX系列系列lacIlacI tac tac lac Olac O S-D/ATGS-D/ATG GSTGST 插入位点插入位点 TGATGA lacPlacP GST融合蛋白用融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱亲和层析柱分离纯化。分离纯化。产物提纯产物提纯:第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 pGEX系列系列 产物分离产物分离:用凝血酶或用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从因子可以把外源蛋白从GST

28、上切下来。上切下来。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达pGEX-2XpGEX-2X的插入区的插入区pGEX-1XpGEX-1X的插入区的插入区pGEX-3XpGEX-3X的插入区的插入区四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统融合蛋白表达载体系统 pGEX系列插入区系列插入区第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达四、常用大肠杆菌表达载体四、常用大肠杆菌表达载体 4.其他融合蛋白系统其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）（组氨酸标签）在外源多肽的在外源多肽的N端或端或C端接上端接上6个组氨酸（个

29、组氨酸（His）。）。His-tag能与能与Ni2+柱结合，但很容易被柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达五、提高外源基因表达效率的方法五、提高外源基因表达效率的方法 1.选择强启动子序列，如选择强启动子序列，如tac 等等 2.调整调整S-D序列与序列与AUG碱的距离碱的距离 一般为一般为5-9bp 距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离启动子选择不同的距离 3.改变起始密码下面的几组

30、密码子改变起始密码下面的几组密码子 能提高翻译的起始效率能提高翻译的起始效率 4.增加增加mRNA的拷贝数和稳定性的拷贝数和稳定性 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 五、提高外源基因表达效率的方法五、提高外源基因表达效率的方法 5.减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的代谢负荷 合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系 （1）诱导表达）诱导表达 将宿主生长代谢与外源基因表达分开将宿主生长代谢与外源基因表达分开 一般采用温度诱导或药物诱导一般采用温度诱导或药物诱导 PL启动子是温度诱导型启动子是温度诱导型:cI857cI

31、857 P PL L 外源基因外源基因 P POO 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达五、提高外源基因表达效率的方法五、提高外源基因表达效率的方法 5.减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的代谢负荷 （1）诱导表达）诱导表达 tac启动子是药物诱导型启动子是药物诱导型 调节基因调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。阻遏物。无无IPTG 阻遏物与阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。量生长。有有IPTG 阻遏物与阻遏物与IPTG结合，结合，lac操

32、纵基因解放，外源基因大量操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。转录。宿主生长受抑制。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达AmpR Plasmid pGEX-KGGSTlacIq Ptac PromoterAmpr IPTG第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达五、提高外源基因表达效率的方法五、提高外源基因表达效率的方法 5.减轻宿主细胞的代谢负荷减轻宿主细胞的代谢负荷 （2）表达载体诱导复制）表达载体诱导复制 将宿主的生长与载体的复制分开。将宿主的生长与载体的复制分开。当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加当宿主大量生长

33、后，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。拷贝数。当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 五、提高外源基因表达效率的方法五、提高外源基因表达效率的方法 6.提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性 防止被宿主的酶降解。防止被宿主的酶降解。（1）设计成融合蛋白）设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。这是避免被降解的最好措施。N末端：由原核基因编码一段多肽，末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。末端：是完整的真核外源基因。质粒基因产物质粒基因产物 目的基因产物目的基

34、因产物 NN C C 切割切割 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达 五、提高外源基因表达效率的方法五、提高外源基因表达效率的方法 6.提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性 （2）使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。1)使用次黄嘌呤核苷（使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。蛋白酶合成。2)大肠杆菌的大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。基因突变也减少蛋白酶的降解作用。3)T4噬菌体的噬菌体的pin基因产

35、物能抑制细菌的蛋白酶。可把基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。增加到载体上。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达五、提高外源基因表达效率的方法五、提高外源基因表达效率的方法 6.提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白）表达分泌蛋白细胞质细胞质 外膜外膜 内膜内膜 周间质周间质 质粒质粒 染色体染色体“外排外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表

36、达 五、提高外源基因表达效率的方法五、提高外源基因表达效率的方法 6.提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白）表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条件：细菌蛋白分泌的条件：有信号肽有信号肽:位于位于N端，一般为端，一般为15-30aa。真核与原核的结。真核与原核的结构相似构相似,功能相似，可以互换。功能相似，可以互换。碱性氨基酸碱性氨基酸 N 疏水氨基酸核心区疏水氨基酸核心区 切割位点切割位点 Arg、Lys Leu、Ile AlaGlySer 信号肽酶信号肽酶 外源蛋白外源蛋白 第二节第二节 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达五、提高外源基因表达效率的方法五、提高外源基因表达效率的方法 6.提高表达产物的稳定性提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白）表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条件：细菌蛋白分泌的条件：蛋白质内有与分泌相关的蛋白质内有与分泌相关的aa 序列序列:为蛋白指明目的地。为蛋白指明目的地。细胞内的转运机制细胞内的转运机制:信号肽酶信号肽酶I、信号肽酶、信号肽酶II等近等近20多种蛋多种蛋白质的参与。白质的参与。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。