真核生物DNA修复机制课件.pptx

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1、DNA损伤错配紫外线电离辐射化学试剂致病、致死进化复制过程修复真核生物DNA的修复机制n n重组修复n n非同源末端连接修复n n跨越修复n n切除修复一.真核生物DNA损伤的重组修复n n同源重组的重要性n n染色体重组及重组修复的有关蛋白n n酵母影响同源间重组的途径n n酵母菌中复制导致的染色体片段化 n n酵母菌重组修复的机制n n脊椎动物细胞的重组修复 同源重组的重要性n nAccording to the participants of the National Academy of Sciences Colloquium entitled Links Between Recomb

2、ination and Replication:Vital Roles of Recombination,organized by Charles Radding(chair),Nicholas Cozzarelli,Michael Cox,Kenneth Marians,and James Haber and held at the Beckman Center of the Academy in Irvine,California,on November 10-12,2000.n nThe recent surge in works on interdependence of DNA re

3、plication and homologous recombination,conducted in experimental systems ranging from bacteriophages to mammalian cell lines,highlighted faltering replication forks as the connecting points between the two seemingly opposite domains of DNA metabolism.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.98,Issue15,8461-8468,J

4、uly17,2001Colloquium PaperDNA replication meets genetic exchange:Chromosomal damage and its repair by homologous recombination Andrei Kuzminov*染色体重组及重组修复的有关蛋白染色体的同源重组是重组修复的基础。(fig32)酵母中重组相关蛋白与phageT4、大肠杆菌的比较，通过对重组缺陷突变体的研究,揭示DNA代谢在跨不同领域的明显的相似性，分析了相应重组酶及有关蛋白质的特征(fig33)如PCNA(fig38)。当单链DNA断裂不能复制时，就引发同源重

5、组。酵母中影响同源性重组的途径A.RAD51/54/55/57 作用于同源重组之间,强烈影响同源染色体间的重组.B.rad50,mre11(rad58),rad59,and xrs2(rad60),作用于姊妹重组之间,RAD50/58/59/60途径轻微提高同源间重组的水平.它们都受RAD52的控制酵母菌中复制导致的染色体片段化A:点检测点检测 真核生物复制及修复过程中精确的点检测方式阻止了细胞周期以避免DNA的明显损伤，阻止停滞不前的复制叉的大量出现，从而产生染色体片段化，然后或细胞停止分裂或有助于重组修复的形成。Mec1是一个依赖于RAD52 的DNA损伤的点检测关键蛋白.它的突变在新合成

6、DNA中积累单链断裂B:当出芽酵母细胞用羟基尿抑制核苷酸还原酶,细胞中的DNA会集聚单链断裂.单链断裂转换为双链断裂也使DNA片段化，这一些现象最直接的解释是原来有单链断裂的DNA上复制叉解散(Fig.2B-C),出现断裂双链。rad27pol30rfc1cdc9突变DNA单链断裂积累冈崎片段不能成熟突变双链DNA不能修复致 死C:冈崎片段不能成熟的突变导致DNA片段化D:MichaelResnick和DmitryGordenin报道了一系列DNA聚合酶突变体中，如果再加上rad27突变，缺乏35核酸外切酶活性,这种突变是致死的。但是,DNA聚合酶突变体中,如果具有Rad27和3-5Exoof

7、Pol（聚合酶的3-5核酸外切酶活性）,这样的突变体仍能存活，不过会发生超重组，超重组依赖于RAD50,RAD51,和RAD52.这种情况下冈崎片段有可能不能成熟,也出现DNA片段化。酵母菌重组修复的机制A、暂停复制叉修复的假说(fig)B、链退火修复复制叉n n依靠单链退火修复复制叉的两种途径 复制叉到达模板DNA的单链断裂后解体,Rad52促进染色质上带有单链裂缝的分离末端的重新退火。单链断裂的修复 全长染色质上的单链断裂得到填补，Rad54催化完整染色质在双链末端临近位置的解链。Rad52催化一条单链与打开的姊妹链的双链之一的末端退火，从而产生复制叉结构。(fig35)C:酵母菌的双链断

8、裂重组n n酵母菌的双链断裂重组有两个阶段：1、末端之一侵入到同源染色体，形成类似于复制叉的重组中间体，2、另一末端的聚集阻止了重组中间体形成复制叉.如果因为同源性有限，第二个末端不能与重组中间体结合，复制叉成熟，继而推进到染色体末端。D、双链末端修复的发生顺序假说n n双链末端被Rad50/Rad58/Rad60加工产生ssDNA突出，与RPA形成复合体;n nRad52 催化RPA 与Rad51的转化；n nRad51,在 Rad54,Rad55,和Rad57的帮助下，催化双链末端侵入完整的姊妹双链。n n在这一机制中,Rad51作为蛋白质复合体的组成者和催化剂两方面起着重要的作用(fig

9、41)。脊椎动物细胞的重组修复 重组修复机制与酵母大致相同，只是要复杂些。多数双链断裂被同源重组如实修复，这一重组机制是通过缩短断裂一端的同源 序列长度 实验证实的：得到的修复产物携带着断裂的非同源一端的多种拷贝。在复制区内及前后，有很多微小同源区。显然，断裂的同源末端侵袭完整的姊妹染色单体，启动复制叉，产生的末端在微小同源区与非同源末端相连。n nProc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.98,Issue 15,8388-8394,July 17,2001 Colloquium PaperColloquium PaperHomologous DNA recombination i

10、n vertebrate cells n nEiichiro Sonoda*,Minoru Takata*,Yukiko M.其它差异：A、用鸡淋巴瘤细胞株为材料做的突变实验，发现不同于酵母的两个主要变异：1、rad51突变脊椎动物细胞迅速死亡，死之前发育中的全部染色体发生变异。2、脊椎动物的rad52突变体细胞对DNA损伤剂不是太敏感。B、脊椎动物与酵母的另一个差异是：脊椎动物中存在多种共生同源的重组酶蛋白Rad51p。XRCC2是Rad51p的一个共生同源物，但非同源末端的连接不受影响。XRCC3是Rad51p的另一个共生同源物，通过同源重组对双链突变的修复需要它。同源重组n nDNA复制

11、使先前存在的 DNA损伤恶化，因而阻碍了以后 DNA的复制。需要同源重组帮助修复n n DNA损伤引起复制叉失控使复制体具有断裂的倾向n n同源重组使单链断裂和双链断裂经过复制叉的解体和重新形成而得到修复。n n真核生物重组酶对真核生物单链退火有较大的作用。n n近期的报道认为,RAD51在真核中起关键作用.二.非同源末端连接(NHEJ)修复n n A1 B1 A1 B1n n A2 B2A2 B2n n同源片段同源片段A1/A2;A1/A2;同源片段同源片段B1/B2B1/B2n n如果如果A1A1的末端和的末端和B1B1的末端连接的末端连接,可进行可进行非同源末端非同源末端连接修复连接修复

12、,依靠依靠KuKu类蛋白质类蛋白质,而不是象而不是象HRHR修复依靠修复依靠RAD52RAD52非等位基因编码的蛋白质非等位基因编码的蛋白质.n n事实上事实上,在在NHEJNHEJ中中,仍然存在着一些微小的同源小仍然存在着一些微小的同源小区域区域,帮助帮助NHEJ.NHEJ.n n在酵母菌和脊椎动物中在酵母菌和脊椎动物中,DSB,DSB修复途径存在一些修复途径存在一些差异差异.HR、NHEJ在酵母菌和脊椎动物中DSB的作用NHEJHR酵母菌+脊椎动物+三.跨越修复n n跨越修复跨越修复 在在RPARPA、RadRad、DNADNA聚合酶、聚合酶、PCNAPCNA等的作用下，使新生的等的作用下

13、，使新生的DNADNA跨越模跨越模板上错误的碱基而继续合成。板上错误的碱基而继续合成。最近新发现的最近新发现的UmuC-PinB-Rad30-Rev1 UmuC-PinB-Rad30-Rev1 复合体在复合体在三种生物域都存在三种生物域都存在.它们在跨越损伤修复中起重它们在跨越损伤修复中起重要作用要作用.机制一机制一(fig36fig36)机制二机制二(fig39fig39)nBiochem.Soc Trans May29(Pt 2):187-91nEukaryotic mutagenesis and translesion replication dependant on DNA polym

14、erase zeta and Rev1 protein四.切除修复n n切除修复是一种多步骤的酶反应过程(fig37)核酸内切酶将损伤的DNA切除 由DNA聚合酶进行聚合反应填补修复的切口 由DNA 连接酶连接,完成修复 n n切除修复分为核苷酸切除修复(NER)和碱基切除修复(BER).而BER又分为短补丁(1个核苷酸)修复和长补丁(2-10个核苷酸)修复.n nMutut Res 2001.Sep.4.486(4):217-47n nRepair of DNA interstrand cross-linksn nDNA interstrand interstrand cross-links

15、(TCLs)are very toxic to dividing cellsn n多种途径如NER、HR转录后复制/跨损伤修复都参与DNA的ICLs修复n nCrit Rev Biochem md.Biol.2001 Crit Rev Biochem md.Biol.2001 36(4):337-9736(4):337-97n nMolecular mechanisms of DNA damage Molecular mechanisms of DNA damage and repair:progress in plants and repair:progress in plants n n植

16、物主要受植物主要受OV-BOV-B射线影响，导致过氧化损伤和交射线影响，导致过氧化损伤和交叉连接（叉连接（DNA-PrDNA-Pr、DNA-DNADNA-DNA）修复方式有：直）修复方式有：直接反转、接反转、BER IVER BER IVER 光修复、跨越修复、双链断光修复、跨越修复、双链断裂途径错配修复途径裂途径错配修复途径n n直接反转修复、光修复只需要直接反转修复、光修复只需要1 1种蛋白参与，其它种蛋白参与，其它修复方式要求多种蛋白参与。修复方式要求多种蛋白参与。n n双链断裂需要双链断裂需要HRRHRR或或NHEJNHEJ，而在植物中，而在植物中，NHEJNHEJ导致错误修复几率比其

17、它真核生物的高，从而产导致错误修复几率比其它真核生物的高，从而产生进化。生进化。BERBER：单核苷切除途径：依赖：单核苷切除途径：依赖DNA DNA polpol,多核苷（多核苷（2-10nt2-10nt）切除：需）切除：需PCNAPCNAn nCell Death Differ 2001.Nov.8(11):1076-92.Cell Death Differ 2001.Nov.8(11):1076-92.n nFunctional interactions and signaling properties of Functional interactions and signaling p

18、roperties of mammalian DNA mismatch repair proteins mammalian DNA mismatch repair proteins n nPCNA:proliferating cell nuclear antigen:PCNA:proliferating cell nuclear antigen:ringmaster of the genuine ringmaster of the genuine n nPCNAPCNA是决定细胞存活与死亡的关键分子之一，是决定细胞存活与死亡的关键分子之一，PCNAPCNA基因可由基因可由P53P53诱导。如果

19、诱导。如果PCNAPCNA量丰富，无量丰富，无P53P53，进行，进行DNADNA复制；如果复制；如果PCNAPCNA量丰富，有量丰富，有P53P53，进行，进行DNADNA修复；如果修复；如果PCNAPCNA量低，无量低，无P53P53，细胞编程序性死亡。，细胞编程序性死亡。PCNAPCNA：低等原核生物中：低等原核生物中只是滑动夹状蛋白，而在真核生物中成为决定细只是滑动夹状蛋白，而在真核生物中成为决定细胞命运的关键分子。胞命运的关键分子。(fig38fig38)n nMutut Res 2001.Sep.4.486(4):217-47n nRepair of DNA interstrand

20、 cross-linksn nDNA interstrand interstrand cross-links(TCLs)are very toxic to dividing cellsn n多种途径如NER、HR转录后复制/跨损伤修复都参与DNA的ICLs修复Activity T4 E.coli Budding yeastActivityT4ActivityT4 E.coli E.coliBuddingyeastBuddingyeastReplicative DNA polymeraseReplicative DNA polymerasegp43gp43DNA polIIIDNA polIII

21、DNA polDNA polSliding clampSliding clampgp45gp45DnaN(DnaN()PCNAPCNAClamp loaderClamp loadergp44/46gp44/46ComplexComplexRFCRFCReplicative helicaseReplicative helicasegp41gp41DnaBDnaBMCMMCMReplicative primaseReplicative primasegp61gp61DnaGDnaGDNA polDNA polss-DNA-binding proteinss-DNA-binding proteing

22、p32gp32SSBSSBRPARPAProducing 3Producing 3-ssDNA tails-ssDNA tailsgp46/47gp46/47RecBCDRecBCDRad50/58/60Rad50/58/60Anti-SSB activityAnti-SSB activityUvsYUvsYRecBCD orRecBCD orRad52/59Rad52/59 RecFOR RecFORRecombinaseRecombinaseUvsXUvsXRecARecARad51Rad51Recombinase regulatorsRecombinase regulators?Rad5

23、5/57Rad55/57Auxiliary helicasesAuxiliary helicasesUvsWUvsWRecGRecGRad54/Tid1Rad54/Tid1DNA junction resolutionDNA junction resolutiongp49gp49RuvABCRuvABC?figfig34Fig 34aRPARad51谢谢!D:Dna2p 与 Rad27p形成复合体一起加工冈崎片段。dna2ts突变体在仅次于致死温度的情况下依赖于RAD52基因。在裂殖酵母中，dna2基因的失活会导致染色体片段化E:cdc24突变体在有染色体片段化信号下完成染色体复制后，突变体停止生长，dna2+,cdc24可以通过pcn1+(DNA clamp)and rfc1+(DNA clamp loader)基因而得到挽救。在离体条件下Cdc24p 结合到Pcn1p and Rfc1p上。冈崎片段不能成熟有可能导致cdc24突变型的多型化酵母菌重组的酶学n nRad51 催化单链侵入n nRad52 促进退火n nRad53 n nRad54n nRad55 Rad51n nRad57 Rad51n nRad5 促进链的同化作用