(精品)药物分析 第09章 维生素类药物的分析.ppt

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1、第第第第 九九九九 章章章章维生素类药物的分析维生素类药物的分析Analysis of vitamins 制作人：制作人：张敏惠张敏惠第一节第一节 概述概述维生素：维生素：是维持人体正常代谢机能所是维持人体正常代谢机能所必需的必需的 微量营养物资。微量营养物资。人体不能合成维生素。人体不能合成维生素。VitA、D2、D3、E、K1 等等 脂溶性脂溶性水溶性水溶性 VitB族族(B1、B2、B6、B12)VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺、叶酸、烟酸、烟酰胺VitMVitPP-H 维生素维生素A醇醇-COCH3 维生素维生素A醋酸酯醋酸酯-COC15H31 维生素维生素A棕榈酸酯棕榈酸酯R:第二节第二

2、节 维生素维生素A为一个具有共轭多烯侧链的为一个具有共轭多烯侧链的 环己烯环己烯（一）（一）结构与性质结构与性质一、一、v 具有具有UV吸收吸收v 存在多种立体异构化合物存在多种立体异构化合物维生素维生素A 325.5 100%新维生素新维生素Aa 328 75%新维生素新维生素Ab 320.5 24%新维生素新维生素Ac 310.5 15%异维生素异维生素Aa 323 21%异维生素异维生素Ab 324 24%相对生物效价相对生物效价VitA2VitA3v 易发生脱氢、脱水、聚合反应易发生脱氢、脱水、聚合反应鲸醇鲸醇v 或有金属离子存在时氧化或有金属离子存在时氧化共轭多烯侧链共轭多烯侧链 易

3、被氧化易被氧化（二）（二）环氧化物环氧化物VitA醛醛VitA酸酸（三）（三）与三氯化锑发生呈色反应与三氯化锑发生呈色反应CHCl3溶解性溶解性（四）（四）不溶于水不溶于水易溶于有机溶剂和植物油等易溶于有机溶剂和植物油等三氯化锑反应三氯化锑反应（一）（一）条件条件 无水无醇无水无醇CHCl3鉴别鉴别二、二、蓝色蓝色紫红紫红（BP（1998）max为为326nm一个吸收峰一个吸收峰UV法法（二）（二）max为为350390nm三个吸收峰三个吸收峰去水去水VitA（VitA3）VitAUSP 显色剂显色剂 磷钼酸磷钼酸 规定斑点颜色和规定斑点颜色和Rf值值BP 杂质对照品法杂质对照品法 显色剂显色

4、剂 三氯化锑三氯化锑TLC法法（三）（三）立体异构体立体异构体氧化产物及光照产物氧化产物及光照产物合成中间体合成中间体去氢维生素去氢维生素A（VitA2）去水维生素去水维生素A（VitA3）UV法法（一）（一）含量测定含量测定三、三、三点校正法三点校正法1.条件：条件：（1）杂质的吸收在）杂质的吸收在310340nm波波长范围内呈一条直线，且随波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小；长的增大吸收度减小；（2）物质对光的吸收具有加和性。）物质对光的吸收具有加和性。2.波长的选择：波长的选择：（1）1 VitA的的 max（328nm）（2）2 3 分别在分别在 1的两侧各选一点的两侧各选

5、一点测定对象测定对象 VitA醋酸酯醋酸酯第一法第一法 等波长差法等波长差法第二法第二法 等吸收度法等吸收度法(皂化法皂化法)测定对象测定对象 VitA醇醇3.测定法测定法4.（1）基本步骤）基本步骤:v第一步第一步 A选择选择选择依据：选择依据：所选所选A值中杂质的干扰已基本消除值中杂质的干扰已基本消除注意：注意：C 为混合样品的浓度为混合样品的浓度 第二步第二步 求求第三步第三步 求效价求效价换算因数由纯品计算而得：换算因数由纯品计算而得：第四步：求标示量第四步：求标示量 方法：方法：（2）第一法第一法维生素维生素A醋酸酯醋酸酯 判断判断 是否在是否在326329nm之间之间在在32632

6、9nm之间之间改用第二法改用第二法是是否否 求算求算 并与规定值比较并与规定值比较 规定值规定值 差值差值 判断差值是否超过规定值的判断差值是否超过规定值的有一个以上有一个以上超过超过无超过无超过 计算计算 A328（校正）（校正）用用A328计算计算03%15%3%第二法第二法第二法第二法 VitAD胶丸中胶丸中VitA的含量测定的含量测定 精密称取本品精密称取本品(规格规格10000VitAIU/丸丸)装量差异项下（平均装量装量差异项下（平均装量0.08262g/丸）丸）的内容物的内容物 0.2399g 至至250ml量瓶中，用环量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取己烷稀释至刻度，摇

7、匀；精密量取2.0ml，置另一，置另一20 ml量瓶中，用环己烷稀释至量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为大吸收波长为328nm，并在下列波长处，并在下列波长处测得吸收度为测得吸收度为A300 ：0.354A316 ：0.561A328 ：0.628A340 ：0.523A360 ：0.216A300/A328 ：0.555A316/A328 ：0.907A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.811A360/A328 ：0.299 求本品中维生素求本品中维生素A的含量？的含量？A300/A328 ：0.564

8、A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.833A360/A328 ：0.344 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 +0.010.01 0+0.02+0.04=适用于维生素适用于维生素A醇醇（等吸收度法）（等吸收度法）第一法无法消除杂质干扰时用此法第一法无法消除杂质干扰时用此法 皂化法、皂化法、6/7A法法（3）第二法）第二法水溶性水溶性脂溶性脂溶性 判断判断 max是否在是否在323327nm之间之间取未皂化样品取未皂化样品采用色谱法纯采用色谱法纯化后再测定化后再测定 计算计算是是否否 判断判断 A300/A325 是

9、否大于是否大于0.73是是否否取未皂化样品取未皂化样品采用色谱法纯采用色谱法纯化后再测定化后再测定 计算计算A325(校正校正)03%3%三氯化锑比色法三氯化锑比色法（二）（二）优点优点 简便简便 快速快速max 618nm620nm标准曲线法标准曲线法缺点缺点呈色不稳定呈色不稳定（5 10s内）内）水分干扰水分干扰与标准曲线温差与标准曲线温差1专属性差专属性差三氯化锑有腐蚀性三氯化锑有腐蚀性苯并二氢吡喃醇苯并二氢吡喃醇第三节第三节 维生素维生素E 名名 称称R1R2相对活性相对活性-生育酚生育酚-生育酚生育酚-生育酚生育酚-生育酚生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1

10、*生物效价生物效价 右旋体右旋体 ：消旋体消旋体 =1.4：10（天然品）（天然品）（合成品）（合成品）dl生育酚醋酸酯生育酚醋酸酯结构与性质结构与性质一、一、苯环苯环+二氢吡喃环二氢吡喃环+饱和烃链饱和烃链1、易溶于有机溶剂，不溶于水、易溶于有机溶剂，不溶于水2、UV3、酯键、酯键 易水解易水解7515（一）（一）硝酸反应硝酸反应橙红色橙红色鉴别鉴别二、二、（橙红色）（橙红色）生育红生育红生育酚生育酚HNO3强氧化剂强氧化剂 取本品约取本品约30mg，加无水，加无水乙醇乙醇10ml溶解后，加硝酸溶解后，加硝酸2ml，摇匀，在，摇匀，在75加热加热15分钟，分钟，溶液应显橙红色。溶液应显橙红色

11、。三氯化铁联吡啶反应三氯化铁联吡啶反应O（二）（二）生育酚生育酚对对-生育醌生育醌O弱氧化弱氧化剂剂红色红色 =41.045.5max=284nmmin=254nm0.01%无水乙醇中无水乙醇中UV法法（三）（三）维生素维生素EUV图图薄层板薄层板 硅胶硅胶G展开剂展开剂 环己烷环己烷-乙醚（乙醚（4 ：1）显色剂显色剂 硫酸（硫酸（105 5）VitE Rf =0.7TLC法法（四）（四）游离生育酚游离生育酚 硫酸铈滴定液（硫酸铈滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黄二苯胺（亮黄灰紫）灰紫）利用游离生育酚的还原性，利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈将硫酸铈还原成硫酸亚铈 检查检

12、查 三、三、原理原理（一）（一）试剂试剂（二）（二）（M生育酚生育酚=430.8）例例 取本品取本品0.10g，加无水乙醇，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液溶解后，加二苯胺试液1滴，滴，用硫酸铈液（用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，）滴定，消耗硫酸铈液（消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得）不得过过 1.0ml。2.15限量限量（三）（三）药典规定药典规定消耗硫酸铈液（消耗硫酸铈液（0.01mol/L）1.0ml设：应消耗硫酸铈液设：应消耗硫酸铈液 V ml0.011.0 实际浓度实际浓度 V若硫酸铈液浓度不是若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L，应重新计算硫酸铈的消耗量应重新

13、计算硫酸铈的消耗量例例 Ce(SO4)2=0.01020mol/L四、四、含量测定含量测定GC法法（一）（一）GC特点特点1、选择性好选择性好灵敏度高灵敏度高速度快速度快分离效能好分离效能好挥发性低、不挥发性低、不稳定、极性强稳定、极性强衍生化易受衍生化易受样品蒸气压限样品蒸气压限制制载气载气N2固定液固定液硅酮（硅酮（OV-17）担体担体硅藻土或高分子多孔小球硅藻土或高分子多孔小球柱温柱温265检测器检测器氢火焰离子化检测器氢火焰离子化检测器(FID)内标内标正三十二烷正三十二烷 n 500 R2VitE测定的色谱条件测定的色谱条件2、内标法加校正因子内标法加校正因子内标法内标法供试液（样品

14、供试液（样品+内标）内标）内标物内标物对照液（对照对照液（对照+内标）内标）是样品中不存在的物质是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近与被测组分峰靠近能与各组分完全分离能与各组分完全分离与被测组分的量接近与被测组分的量接近校正因子：校正因子：实际工作中的计算方法实际工作中的计算方法例例 内标液内标液 取正三十二烷加正己烷溶解取正三十二烷加正己烷溶解 并稀释成并稀释成1.0mg/ml溶液溶液对照液对照液 精密称取精密称取VitE对照品对照品0.2011g 置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内置棕色具塞锥形瓶中，精密加入内 标液标液10ml，密塞，振摇使溶解，取，密塞，振摇使溶解，取 13ul注入注入GC

15、仪，测定，计算仪，测定，计算供试液供试液 精密称取供试品精密称取供试品0.1998g置棕置棕 色具塞锥形瓶中，精密加入内标液色具塞锥形瓶中，精密加入内标液 10ml，密塞，振摇使溶解，取，密塞，振摇使溶解，取13ul 注入注入GC仪，测定，计算仪，测定，计算对照液对照液供试液供试液0.3730.368本品含本品含C31H52O3应为应为96.0 102.0%BP GC 内标内标 正三十二烷正三十二烷 R1.4USP GC 内标内标 十六酸十六醇酯十六酸十六醇酯 R1.0JP HPLC 外标外标 dl生育酚生育酚 R1.4利用生育酚的易氧化性利用生育酚的易氧化性还原型还原型氧化型氧化型二苯胺（亮

16、黄二苯胺（亮黄灰紫）灰紫）原理原理1、铈量法铈量法（二）（二）指示剂指示剂2、防止防止Ce(SO4)2的水解的水解减慢生育酚被减慢生育酚被O2氧化速度氧化速度C、酸性条件、酸性条件Ce(SO4)2易溶于水易溶于水生育酚易溶于醇生育酚易溶于醇B、溶剂、溶剂分子量较大，反应慢分子量较大，反应慢 易被易被O2氧化氧化A、反应速度、反应速度H2SO4讨论讨论3、含量计算含量计算4、MVitE =472样品样品 dl生育酚生育酚固定相固定相十八烷基硅烷键合硅胶十八烷基硅烷键合硅胶流动相流动相甲醇甲醇-水（水（49 ：1）检测波长检测波长292nm R2.6 RSD0.8%JP-RP-HPLC法（外标法）

17、法（外标法）（三）（三）测定对象测定对象血清中血清中VitA和和VitE固定相固定相十八烷基硅烷键合硅胶十八烷基硅烷键合硅胶流动相流动相甲醇甲醇-水（水（96 ：4）检测波长检测波长 8前前330nm 8后后292nmRP-HPLC法（外标法）法（外标法）（四）（四）氨基嘧啶环氨基嘧啶环CH2噻唑环噻唑环(季铵碱季铵碱)第四节第四节 维生素维生素B1HClCl-（一）（一）溶解性溶解性1、易溶于水、易溶于水2、水溶液呈酸性、水溶液呈酸性（二）（二）UV共轭双键共轭双键max=246nm结构与性质结构与性质一、一、嘧啶环嘧啶环 伯氨伯氨噻唑环噻唑环 季铵季铵1、可与酸成盐、可与酸成盐2、与生物碱

18、、与生物碱3、含量测定、含量测定 非水碱量法非水碱量法（三）（三）硫色素反应硫色素反应（四）（四）碱性碱性ChP鉴别试验鉴别试验二、二、（一）（一）硫色素反应硫色素反应硫色素硫色素2HVitB1H+H+H+H+（二）（二）沉淀反应沉淀反应S元素反应元素反应Cl-反应反应（三）（三）其他反应其他反应三、三、含量测定含量测定喹那啶红亚甲蓝喹那啶红亚甲蓝 （紫红（紫红天蓝）天蓝）（一）（一）非水溶液滴定法非水溶液滴定法UV法法（二）（二）片剂、注射剂片剂、注射剂=421（每片）相当于标示量的（每片）相当于标示量的%=A=ECL规格规格g/片片g/100mlgChP（每（每ml）相当于标示量的）相当于

19、标示量的%=规格规格g/mlml准确度高准确度高灵敏度低灵敏度低操作繁琐操作繁琐设备简单设备简单（三）（三）硅钨酸重量法硅钨酸重量法重量法特点重量法特点1、原理原理2、2337.273479.22 取本品约取本品约50mg，精密称定，加水，精密称定，加水50ml溶解后，加盐酸溶解后，加盐酸2ml，煮沸，立即，煮沸，立即滴加硅钨酸试液滴加硅钨酸试液4ml，继续煮沸，继续煮沸2分钟，分钟，用用80恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀先用煮沸的盐酸溶液（淀先用煮沸的盐酸溶液（120）20ml分次洗涤，再用水分次洗涤，再用水10ml洗涤洗涤1次，最后次，最后用丙酮洗涤用丙酮洗涤2次，

20、每次次，每次5ml，在，在80干干燥至恒重，精密称定，所得重量与燥至恒重，精密称定，所得重量与0.1939相乘，即得相乘，即得测定方法测定方法3、例例 精密称取本品精密称取本品0.0519g，加水，加水50 ml溶解，加盐酸溶解，加盐酸2ml煮沸，立即滴加煮沸，立即滴加硅钨酸试液硅钨酸试液4 ml，继续煮沸，继续煮沸2分钟，用分钟，用80恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀先用煮沸的盐酸溶液（先用煮沸的盐酸溶液（120）20 ml 分次洗涤，再用水分次洗涤，再用水10ml 洗涤洗涤1次，后次，后用丙酮洗涤用丙酮洗涤2次，每次次，每次5ml。在。在80干干燥至恒重，称得沉淀重

21、量为燥至恒重，称得沉淀重量为0.2557g。求本品的含量按干燥品计算为多少？求本品的含量按干燥品计算为多少？(本品干燥失重项下测定结果为本品干燥失重项下测定结果为3.73%)A.取样量取样量50mg 提高灵敏度提高灵敏度B.80 保持保持4个个H2OC.HCl 增大沉淀颗粒增大沉淀颗粒D.硅钨酸硅钨酸 ：VitB1=8 ：1 使沉淀完全使沉淀完全E.硅钨酸边搅拌边缓慢加入硅钨酸边搅拌边缓慢加入 增大沉淀颗粒增大沉淀颗粒实验条件实验条件4、NaOH（四）（四）硫色素荧光法硫色素荧光法原理原理1、激发波长激发波长365nm发射波长发射波长435nm方法与计算方法与计算2、+NaOH+铁氰化钾铁氰化

22、钾+异丁醇异丁醇+NaOH+异丁醇异丁醇+NaOH+铁氰化钾铁氰化钾+异丁醇异丁醇+NaOH+异丁醇异丁醇SdAb对照液对照液供试液供试液特点特点3、（1）灵敏度高，线性范围宽）灵敏度高，线性范围宽（2）代谢产物不干扰，适用于）代谢产物不干扰，适用于 体液分析体液分析第五节第五节 维生素维生素CL抗坏血酸抗坏血酸1、易溶于水、易溶于水2、水溶液呈酸性、水溶液呈酸性结构与性质结构与性质一、一、（一）（一）溶解性溶解性二烯醇结构二烯醇结构二酮基结构二酮基结构二烯醇结构二烯醇结构（二）（二）强还原性强还原性有活性有活性有活性有活性无活性无活性糖类的显色反应糖类的显色反应50结构与糖类相似结构与糖类相

23、似（三）（三）具糖的性质具糖的性质C3OH的的pKa=4.17C2OH的的pKa=11.57酸性酸性（四）（四）一元酸一元酸L(+)抗坏血酸抗坏血酸活性最强活性最强手性手性C（C4、C5）（五）（五）光学活性光学活性*与碱反应与碱反应（六）（六）水解反应水解反应（七）（七）UV特征特征与氧化剂的反应与氧化剂的反应（一）（一）鉴别试验鉴别试验二、二、1、与、与AgNO3反应反应2、与、与2，6-二氯靛酚反应二氯靛酚反应(ChP2000)氧化型氧化型玫瑰红色玫瑰红色还原型还原型蓝色蓝色OH(ChP2000)（玫瑰色）玫瑰色）（无色）（无色）3、与碱性酒石酸铜反应、与碱性酒石酸铜反应USP4、与、与

24、KMnO4反应反应糖类的反应糖类的反应（二）（二）或盐酸或盐酸50吡咯吡咯USP（蓝色）（蓝色）(糠醛糠醛)（戊糖）（戊糖）50(吡咯吡咯)UV（三）（三）BP0.01mol/L HCl指示剂指示剂 淀粉指示液淀粉指示液原理原理1、碘量法碘量法（一）（一）含量测定含量测定三、三、H+取本品约取本品约0.2g，精密称定，加新，精密称定，加新沸过的冷水沸过的冷水100ml与稀醋酸与稀醋酸10ml使溶使溶解，加淀粉指示液解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴，立即用碘滴定液（定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝）滴定，至溶液显蓝色，在色，在30秒内不褪。每秒内不褪。每1ml碘滴定液碘滴定液(0.1m

25、ol/L)相当于相当于8.806mg的的C6H8O6方法方法2、CHHOOaS3a S O+H2N H ON2252HO NH COS3a2，6-二氯靛酚钠滴定法法二氯靛酚钠滴定法法（二）（二）USPJP原理原理1、自身指示终点法自身指示终点法方法方法2、HPLC法法（三）（三）1、HPLC的优点的优点灵敏度高灵敏度高选择性高选择性高分离分析同步分离分析同步微量分析微量分析干扰少干扰少 快速快速2、HPLC法分离法分离VitC常用方法及测常用方法及测 定对象定对象 对象对象 制剂、生物样品、果汁制剂、生物样品、果汁方法方法 离子交换色谱法离子交换色谱法 离子对色谱法离子对色谱法 分配色谱法（正、反相）分配色谱法（正、反相）血、尿、组织、细胞等血、尿、组织、细胞等例例多种维生素片中多种维生素片中VitA、VitB1、VitB2、VitB6、烟酰胺、烟酰胺、VitC、VitE的含量测定的含量测定色谱柱色谱柱 ODS流动相流动相 A、水、水-甲醇（甲醇（4 ：1）B、甲醇、甲醇 （梯度洗脱）（梯度洗脱）抗氧剂抗氧剂 二巯基丙烷磺酸钠二巯基丙烷磺酸钠水溶性维生素水溶性维生素 离子对色谱法（樟脑磺酸）离子对色谱法（樟脑磺酸）内标法内标法+校正因子校正因子 内标物内标物苯酚苯酚脂溶性维生素脂溶性维生素 外标法外标法