分子发光分析法PPT讲稿.ppt

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1、分子发光分析法1井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第1页，共77页，编辑于2022年，星期五v第第一一次次记记录录荧荧光光现现象象的的是是16世世纪纪西西班班牙牙的的内内科科医医生生和和植植物物学学家家N.Monardes，1575年年他他提提到到在在含含有有一一种种称称为为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。v直直到到1852年年，Stokes在在考考察察奎奎宁宁和和叶叶绿绿素素的的荧荧光光时时，用用分分光光光光度度计计观观察察到到其其荧荧光光的的波波长长比比入入射射光光的的波波长长稍稍

2、微微长长些些，才才判判断断这这种种现现象象是是这这些些物物质质在在吸吸收收光光能能后后重重新新发发射射不不同同波波长长的的光光，而而不不是是由由光光的的漫漫射射作作用用所所引引起起的的，从从而而导导入入了了荧荧光光是是光光发发射射的的概概念念，他他还还由由发发荧荧光光的的矿矿石石“萤萤石石”推演而提出推演而提出“荧光荧光”这一术语。这一术语。v1867年年，Goppelsroder进进行行了了历历史史上上首首次次的的荧荧光光分分析析工工作作，应应用用铝铝桑桑色色素配合物的荧光进行铝的测定。素配合物的荧光进行铝的测定。v19世世纪纪以以前前，荧荧光光的的观观察察是是靠靠肉肉眼眼进进行行的的，直直

3、到到1928年年，才才由由Jette和和West提提出了第一台荧光计。出了第一台荧光计。2井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第2页，共77页，编辑于2022年，星期五v某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能量受激量受激光辐射光辐射退激退激分子在退激过程中以光辐射形式释放能量分子在退

4、激过程中以光辐射形式释放能量3井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第3页，共77页，编辑于2022年，星期五v根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：理不同分为以下几类：光致发光：以光致发光：以光能光能来激发而发光来激发而发光 电致发光：以电致发光：以电能电能来激发而发光来激发而发光荧光灯荧光灯 生物发光：以生物发光：以生物体释放的能量生物体释放的能量激发而发光激发而发光 化学发光：以化学发光：以化学反应能化学反应能激发而发光激发而发光荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法4井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德

5、勇第4页，共77页，编辑于2022年，星期五一、荧光与磷光的产生过程一、荧光与磷光的产生过程 由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.1.分子能级与跃迁分子能级与跃迁 分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、电子激发单重态 S1、S2；第一、第二、电子激发三重态 T1、T2 ；第一第一节节 分子发光分析法原理分子发光分析法原理5井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第5页，共

6、77页，编辑于2022年，星期五2 2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；6井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第6页，共77页，编辑于2022年，星期五3.3.激发态激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电电子子处处于于激激发发态态是是不不稳稳定定状状态态，返返回回基基态态时时，通通过过辐辐射射跃跃迁迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷

7、光内转换外转换系间跨越振动弛豫无辐射跃迁 激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光荧光：10-710-9 s,第一激发单重态单重态的最低振动能级基态；磷光磷光：10-410s；第一激发三重态三重态的最低振动能级基态；7井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第7页，共77页，编辑于2022年，星期五S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量 2 1 3 外转换 2T2内转换振动弛豫8井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第8页，共77页，编辑于2022年，星期五非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫振动弛豫

8、：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12 s。内转换内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。9井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第9页，共77页，编辑于2022年，星期五辐射能量传递过程辐射能量传递过程 荧光发射荧光发射：电

9、子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为 S1 S0跃迁；10-710-9 s 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；磷光发射磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（T1 S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0 T1禁阻跃迁）S0 激发振动弛豫内转换系间跨越振动弛豫 T1 发光速度很慢：10-4100 s。光照停止后，可持续一段时间。10井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第10页，共77页，编辑于2022年，星期五二、激发光谱与荧光二、激发光谱与荧光(磷光磷光)光谱光谱 荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？1.1.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线的

10、激发光谱曲线 固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线（图中曲线I）。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大；11井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第11页，共77页，编辑于2022年，星期五2.2.荧光光谱荧光光谱(或磷光光谱或磷光光谱)固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光)强度与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。12井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第12页，共77页，编辑于2022年，星期五13井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第13页，共77页，编辑于2022年，星

11、期五3.3.激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。c.镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。14井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第14页，共77页，编辑于2022年，星期五镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态

12、上的各振动能级分布类似；基 态 上 的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。15井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第15页，共77页，编辑于2022年，星期五200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱16井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第16页，共77页，编辑于2022年，星期五三、荧光的产生与分子结构的关系三、荧光的产生与分子结构的关系 1.1.分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率

13、。荧光量子产率（）：荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；17井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第17页，共77页，编辑于2022年，星期五2.化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱

14、。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。18井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第18页，共77页，编辑于2022年，星期五不产生荧光不产生荧光不产生荧光不产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光不产生荧光不产生荧光不产生荧光 F F=0.92=0.92萘萘萘萘V VA A F F(萘萘萘萘)=5 5 F F(V VA A)荧光黄荧光黄荧光黄荧光黄酚酞酚酞酚酞酚酞偶氮菲偶氮菲偶氮菲偶氮菲偶氮苯偶氮苯偶氮苯偶氮苯19井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第19页，共77页，编辑于2022年，星期五20井冈山大

15、学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第20页，共77页，编辑于2022年，星期五四、影响荧光强度的因素四、影响荧光强度的因素 影响荧光强度的外部因素1.1.溶剂的影响溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.2.温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；21井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第21页，共77页，编辑于2022年，星期五pH1有有荧光荧光pH13无无荧光荧光无荧光无荧光有荧光有荧光另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性2

16、2井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第22页，共77页，编辑于2022年，星期五4.内滤光作用和自吸现象 自自吸吸现现象象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；23井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第23页，共77页，编辑于2022年，星期五5.溶液荧光的猝灭荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降荧光物质与溶剂或其它物质之间发生化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效率或荧光效率 f 下降称为下降称为荧光猝灭

17、。荧光猝灭。v使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂 氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是常见的荧光猝灭剂v碰撞猝灭碰撞猝灭 M+激激 M*M*+Q M+Q+热热v静态猝灭静态猝灭v自猝灭自猝灭荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。荧光物质发射的荧光被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。24井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第24页，共77页，编辑于2022年，星期五一、仪器结构流程一、仪器结构流程 测测量量荧荧光光的的仪仪器器主主要要由由四四个个部部分分组组成

18、成：激激发发光光源源、样样品品池池、双双单色器系统、检测器。单色器系统、检测器。特殊点：特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：基本流程如图：单单色色器器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光光源源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器检测器：光电倍增管。第二节分子荧光与磷光分析法第二节分子荧光与磷光分析法25井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第25页，共77页，编辑于2022年，星期五1、光源、光源v激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽度；适用波

19、长范围宽v荧光光度计中，常使用卤钨灯作光源荧光光度计中，常使用卤钨灯作光源v荧光分光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光分光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射365 nm365 nm、405 nm405 nm、436 nm 436 nm 三条谱线三条谱线三条谱线三条谱线以以以以365 nm 365 nm 的谱线最强的谱线最强的谱线最强的谱线最强应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源26井冈山大学化学化

20、工学院分析化学教研室 何德勇第26页，共77页，编辑于2022年，星期五2、单色器、单色器v荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱不能获得光谱v大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱谱v第一单色器作用第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长激发波长 ex，用此激发光激发液池内的荧光物质，用此激发光激发液池内的荧光物质

21、exv第二单色器作用第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长扰光，用来选择测定用的荧光波长 em。在选定的在选定的 em 下测定荧光强度，定量分析下测定荧光强度，定量分析27井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第27页，共77页，编辑于2022年，星期五3、样品池、样品池v盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边只能用手拿棱或最上边1.1.样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收

22、池一样可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样可见分光光度计的吸收池一样2.2.吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围波长范围波长范围波长范围3.3.使用注意事项使用注意事项使用注意事项使用注意事项容易破碎容易破碎容易破碎容易破碎问题：问题：问题：问题：紫外紫外紫外紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分

23、光光度计的样品可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？池有什么区别？池有什么区别？池有什么区别？沾污问题沾污问题沾污问题沾污问题28井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第28页，共77页，编辑于2022年，星期五4、检测器、检测器v把光信号转化成电信号把光信号转化成电信号,放大放大,直接转成荧光强度直接转成荧光强度v荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管荧光光度计采用光电倍增管v荧光分析比吸收光度法具有高

24、得多的灵敏度，是因为荧光荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可 大大提高大大提高荧光强度荧光强度5、读出装置、读出装置v记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱光谱29井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第29页，共77页，编辑于2022年，星期五仪器光路图30井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第30页，共77页，编辑于2022年，星期五同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差

25、()和固定能量差及可变波长三种；同同步步扫扫描描技技术术可可简简化化光光谱谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；如图。合适的合适的可可减少光谱重叠减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。31井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第31页，共77页，编辑于2022年，星期五可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图32井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第32页，共77页，编辑于2022年，星期五激发光谱和荧光、磷光光谱激发光谱和荧光、磷光光谱v荧光和磷光均为光致发光，

26、合适的激发光波长需根据激发荧光和磷光均为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定光谱确定激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱的荧光强度随激发波长变化的光谱I exex固定固定 em em 荧光波长荧光波长荧光波长荧光波长获得方法：先把第二单色器的波长获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的固定，使测定的 emem不变，改变第不变，改变第不变，改变第不变，改变第一单色器波长，从一单色器波长，从一单色器波长，从一单色器波长，从200700 nm 200700 nm 扫描，扫描，扫描，扫描，让不同波长的光照在荧光物质上，让

27、不同波长的光照在荧光物质上，让不同波长的光照在荧光物质上，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以测定它的荧光强度，以测定它的荧光强度，以测定它的荧光强度，以I 为纵坐标，为纵坐标，exex为横坐标得左图，即荧光物质的为横坐标得左图，即荧光物质的为横坐标得左图，即荧光物质的为横坐标得左图，即荧光物质的激发光谱激发光谱激发光谱激发光谱从曲线上找出从曲线上找出从曲线上找出从曲线上找出 exex，实际上选波长较长的高波长峰，实际上选波长较长的高波长峰，实际上选波长较长的高波长峰，实际上选波长较长的高波长峰33井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第33页，共77页，编辑于2022年，

28、星期五I emem固定固定 ex 激发光波长激发光波长激发光波长激发光波长获得方法：先把第一单获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激色器的波长固定，使激发的发的 exex不变，改变第二不变，改变第二单色器波长，让不同波单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的长的光扫描，测定它的发光强度，以发光强度，以I 为纵坐为纵坐标，标，emem为横坐标得左图，为横坐标得左图，为横坐标得左图，为横坐标得左图，即荧光物质的发射光谱即荧光物质的发射光谱即荧光物质的发射光谱即荧光物质的发射光谱 从曲线上找出最大从曲线上找出最大的的 emem34井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第34页，共77页，编辑

29、于2022年，星期五v从图中看出从图中看出v 磷磷 荧荧 激激图吸收峰荧光峰磷光峰35井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第35页，共77页，编辑于2022年，星期五A.A.激发光谱激发光谱激发光谱激发光谱固定固定固定固定 emem=620nm(MAX)=620nm(MAX)exex=290nm =290nm(MAX)(MAX)固定发射波长固定发射波长固定发射波长固定发射波长扫描激发波长扫描激发波长扫描激发波长扫描激发波长荧光激发光谱与紫外荧光激发光谱与紫外荧光激发光谱与紫外荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似可见吸收光谱类似可见吸收光谱类似可见吸收光谱类似36井冈山大学化学化工学院分

30、析化学教研室 何德勇第36页，共77页，编辑于2022年，星期五 exex=290nm =290nm(MAX)(MAX)固定固定固定固定 emem=620nm(MAX)=620nm(MAX)固定固定固定固定 exex=290nm=290nm(MAX)(MAX)emem=620nm 620nm(MAX)(MAX)B.B.发射光谱发射光谱发射光谱发射光谱(荧光光谱荧光光谱荧光光谱荧光光谱)固定激发波长固定激发波长固定激发波长固定激发波长 扫描发射波长扫描发射波长扫描发射波长扫描发射波长C.C.激发光谱与发射激发光谱与发射激发光谱与发射激发光谱与发射光谱的镜像关系光谱的镜像关系光谱的镜像关系光谱的镜

31、像关系S S0 04 43 32 21 1S S1 14 43 32 21 1发射光谱的形状与激发波长无关：发射光谱的形状与激发波长无关：发射光谱的形状与激发波长无关：发射光谱的形状与激发波长无关：分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于发到高于发到高于发到高于S S1 1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到的电子态，由于经过极快的内

32、转换和振动弛豫降到的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S S1 1电子态的最低振动、电子态的最低振动、电子态的最低振动、电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。1 1 4 41 1 3 31 1 2 21 11 11 1 4 41 1 3 31 1 2 21 1 1 137井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第37页，共77页，编辑于2022年，星期五2.2.2.2.三维荧光光谱三维荧光光谱

33、三维荧光光谱三维荧光光谱I I F F f f f f(exex 、emem)蒽的激发光谱蒽的激发光谱蒽的激发光谱蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长固定发射波长、扫描激发波长38井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第38页，共77页，编辑于2022年，星期五I I F F f f f f(exex 、emem)蒽的发射光谱蒽的发射光谱蒽的发射光谱蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长固定激发波长、扫描发射波长39井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第39页，共77页，编辑

34、于2022年，星期五蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等高线光谱图 40井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第40页，共77页，编辑于2022年，星期五蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱蒽的三维等荧光强度光谱41井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第41页，共77页，编辑于2022年，星期五VBVB1 1和和和和VBVB2 2的三维荧光光谱的三维荧光光谱的三维荧光光谱的三维荧光光谱42井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第42页，共77页，编辑于2022年，星期五RLSRLSDSDSTSTSATSATSA

35、DSADS散射片三维共振光散射光谱散射片三维共振光散射光谱散射片三维共振光散射光谱散射片三维共振光散射光谱3.3.3.3.三维共振光散射光谱三维共振光散射光谱三维共振光散射光谱三维共振光散射光谱ADSADSADSADSATSATSATSATSTS TS TS TSRLSRLSDS DS DS DS散射片三维共振光散射等高线光谱图散射片三维共振光散射等高线光谱图散射片三维共振光散射等高线光谱图散射片三维共振光散射等高线光谱图共振光散射共振光散射共振光散射共振光散射瑞利散射瑞利散射瑞利散射瑞利散射固定固定固定固定 exex=270nm=270nm拉曼光拉曼光拉曼光拉曼光二级共振光散射二级共振光散射

36、二级共振光散射二级共振光散射三级共振光散射三级共振光散射三级共振光散射三级共振光散射荧光光谱有用区间荧光光谱有用区间荧光光谱有用区间荧光光谱有用区间43井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第43页，共77页，编辑于2022年，星期五磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。测量方法：测量方法：（1 1）通通常常借借助助于于荧荧光光和和磷磷光光寿寿命命的的差差别别，采采用用磷磷光光镜镜的装置将荧光隔开。的装置将荧光隔开。（2 2）采采用用脉脉冲冲光光源源和和可可控控检测及时间分辨技术。检测及时间分辨技术。室室温温测测量量时时，不不需需要要杜杜瓦瓦瓶

37、。瓶。44井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第44页，共77页，编辑于2022年，星期五二、荧光分析方法与应用二、荧光分析方法与应用1 1、特点特点（1 1）灵敏度高）灵敏度高 分子发光分析法比吸收光度法高24个数量级 检测下限：0.10.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3 3）试样量少）试样量少 缺点缺点：应用范围小。45井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第45页，共77页，编辑于2022年，星期五2、方法、方法v荧光衍生法v荧光猝灭法v敏化荧光法46井冈山

38、大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第46页，共77页，编辑于2022年，星期五3 3、定量依据与方法、定量依据与方法(1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ：If=Ia 由朗伯由朗伯-比耳定律：比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)If=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.3 l c)浓度很低时，将括号项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3 I0 l c =Kc47井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第47页，共77页，编辑于2022年，星期五（2）定量方法标准曲线法：标准曲线法：

39、配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；48井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第48页，共77页，编辑于2022年，星期五4 4、荧光分析法的应用、荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法

40、测定49井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第49页，共77页，编辑于2022年，星期五50井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第50页，共77页，编辑于2022年，星期五(2)(2)生物与有机化合物的分析生物与有机化合物的分析51井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第51页，共77页，编辑于2022年，星期五1、低温磷光分析法、低温磷光分析法v低温磷光分析是将试样溶于有机溶剂中，在液氮（温度77K）条件下形成刚性玻璃状物后，测量磷光.这样，可减小分子间的碰撞，防止磷光猝灭.所用的溶剂应具备下列条件：v易于制备和提纯；能很好的溶解被分析物质；在77K温度下应有足够的粘度

41、并能形成明净的刚性玻璃体；在所研究的光谱区背景要低，没有明显的光吸收和光发射现象。三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用52井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第52页，共77页，编辑于2022年，星期五低温磷光分析常用试剂低温磷光分析常用试剂溶剂及组成溶剂及组成混合比例（混合比例（V/V）使用温度使用温度乙醇异戊醇乙醚乙醇异戊醇乙醚（EPA）25577K异丙醇异戊醇乙醚异丙醇异戊醇乙醚25+577K乙醇甲醇碘乙（丙）乙醇甲醇碘乙（丙）烷烷164177K水乙二醇水乙二醇12123K150KEPA氯仿氯仿12177KEPA+碘甲烷（碘甲烷（IEPA）10+177K三乙醇胺三乙醇胺纯溶剂

42、纯溶剂193K213K53井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第53页，共77页，编辑于2022年，星期五 2、室温磷光分析、室温磷光分析v低温磷光需要适当的低温条件，限制了它的应用及发展.室温磷光分析避免了低温条件，将试样固定在滤纸、硅胶、氧化铝、玻璃纤维、淀粉、溴化钾等基体上，以增加其刚性，减少三重态的碰撞猝灭，增强磷光相对强度。v固体基质表面室温磷光分析v胶束稳定室温磷光分析v敏化室温磷光分析54井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第54页，共77页，编辑于2022年，星期五 3、室温磷光分析应用、室温磷光分析应用（1 1）稠环芳烃分析）稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光

43、分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）（2 2）农药、生物碱、植物生长激素的分析）农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱等分析 检测限0.01 g/cm3（3 3）药物分析和临床分析）药物分析和临床分析55井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第55页，共77页，编辑于2022年，星期五56井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第56页，共77页，编辑于2022年，星期五一、一、基本原理基本原理1.1.化学发光反应化学发光反应 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A +B =C +D*D*D+h（1）能够

44、发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。第三节第三节 化学发光分析法化学发光分析法57井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第57页，共77页，编辑于2022年，星期五58井冈山大学化学化工学院分析化学教研

45、室 何德勇第58页，共77页，编辑于2022年，星期五59井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第59页，共77页，编辑于2022年，星期五60井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第60页，共77页，编辑于2022年，星期五2.2.化学发光效率化学发光效率化学效率：化学效率：发光效率：发光效率：时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dc/dt 分析物参加反应的速率；61井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第61页，共77页，编辑于2022年，星期五3.3.化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂

46、小得多，对于一级动力学反应：dc/dt=Kc；K 为反应速率常数。定量依据：定量依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：62井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第62页，共77页，编辑于2022年，星期五4.4.化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1 1）气相化学发光反应）气相化学发光反应a.一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO +O3 NO2*NO2*NO2+h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm3；b.氧原子与氧原子与SO2、NO、CO的发光反应的发光反应 O3

47、 O2+O（1000 C石英管中进行）SO2 +O+O SO2*+O2 SO2*SO2*+h 最大发射波长：200nm；灵敏度1 ng/cm3；63井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第63页，共77页，编辑于2022年，星期五 O3 O2+O（1000 C石英管中进行石英管中进行）NO +O NO2*NO2*NO2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：4001400nm；灵敏度；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与CO的发光反应：的发光反应：CO +O CO2*CO2*CO2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：300500nm；灵敏度；灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与NO的

48、发光反应：的发光反应：64井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第64页，共77页，编辑于2022年，星期五c.乙烯与乙烯与O3的发光反应的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：反应，生成激发态乙醛：CH2O*CH2O+h 最大发射波长：最大发射波长：435nm；对；对O3的特效反应；线性响应范围的特效反应；线性响应范围1 ng/cm3 1 g/cm3；65井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第65页，共77页，编辑于2022年，星期五（2 2）火焰中的化学发光反应）火焰中的化学发光反应 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应

49、；a.一氧化氮一氧化氮 NO +H HNO*HNO*HNO +h 发射光谱范围：发射光谱范围：660770nm；最大发射波长：最大发射波长：680nm；在在富氢火焰中：富氢火焰中：NO2 +2H NO+H2O 该反应十分迅速。该反应十分迅速。此法可用于测定空气中此法可用于测定空气中NOx的总量，可与的总量，可与GC联用，作为氮化合联用，作为氮化合物的检测器。物的检测器。66井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第66页，共77页，编辑于2022年，星期五b.硫化物硫化物 挥发性硫化物挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等等在富氢火焰在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（

50、蓝色）：中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2 +2H2 S +2H2O S +S 2S2*S2*S2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：350460nm；最大发射波长：最大发射波长：384nm；灵敏度：灵敏度：0.2 ng/cm3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。67井冈山大学化学化工学院分析化学教研室 何德勇第67页，共77页，编辑于2022年，星期五（3 3）液相中的化学发光反应）液相中的化学发光反应 机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯