PCR与RTPCR技术分析和总结.docx

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1、PCR与RT-PCR技术PCR基础Template104-106 copies of DNA templateTemplate104-106 copies of DNA template聚合酶链式反响（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的 过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20- 30个循环得到的扩增产物就足够在澳化乙锭染色的凝胶上观察到。反响包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的 基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引

2、物确定了扩增产 物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶 会改善结果。扩增反响还包括缓冲液，三磷酸脱氧核甘及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模 板和 PCR产物的熔点（Tin）,忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与 作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。Template10 4-10 6 copies of DNA templatePrimer 10. 1-0. 5阿Primer 20. 1-0. 5闯10X Reaction bufferIXMagnesium1.

3、0-3. OmMdNTP mix200 mM each dNTPThermostable DNA polymerase1-4 units/100 ml reactionRT-PCR基础RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于 对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比 其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的模板可以为总RNA或poly（A）+选择性RN

4、A。逆转录反响可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo（dT）或基 因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最正确条件 下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反响产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转 录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。H图10.逆转录温度对RT-PCR特异性的 影响二m使用ThermoScript和设计用来同人 DNA聚合酶 mRNA退火的GSP,由刀g Hela RNA 合成cDNA。Thermoscript 加 入到预热的反响混合液中，使用P

5、latinum Tap DNA聚合酶对1/减少基因组DNA污染RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA别离方法，如 Trizol Reagent,会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了防止产生于基因组DNA的产 物，可以在逆转录之前使用扩增级的DNase I对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在 2. OmM EDTA中65保温10分钟以终止DNase I消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所 发生的依赖于镁离子的RNA水解。为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火 的引物。来源于cDNA的PC

6、R产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA 模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNAo在 无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。增加PCR特异性 引物设计细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而 非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以 增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：* 典型的引物18到24个核昔长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非 目的序列位点的可能性。但是长度大于24核昔的引物并不意味着更高的特异性。较长的序 列可能

7、会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。* 选择GC含量为40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。* 设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。* 防止引物对3,末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。* 防止3,末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核昔中含有3个A或T。* 防止3,末端的错误配对。3,端核昔需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 防止存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响 特异性。当计算引物

8、Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构 的检测。有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比方，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简 并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加 特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄喋吟可以同 所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3,端使用简并碱基，因为3,端最后3个 碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度(Ip M到3P M),因为许多简并混 合物中的引物不是特异性针对目的模板。引物退火温度引物的另一个重要参数是熔解温度(Tm) o

9、这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以 保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55 到70。退火温度一般设定比引物的Tm低5。设定Tm有几种公式。表5列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液 中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可 信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定 性。大局部计算机程序使用近邻分析法。Simple Formula(39)(valid tor

10、 primers 50basesPAGEPycle sequencingStandardIsothermal sequencingDesaltedSite-directed mutagenesisCartridgeLfLP techmologyDesalted引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。Invitrogen?以一个最小0D单位确保总寡核首 的产量（表7） o定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为TE 比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核昔的水解。表7.各种纯化方法的最低寡核甘酸产量Note:For primers 50 bases, PAGE pur

11、ification is recommended and HPLC is not an option. NA is not available.Minimum Yield(OD) for Different Primer Purities*Number of BasesSynthesis ScaleStandard/DesaltedCartridgeHPLCPAGE大于20*50nmole22NANA200nmole88311Pmol2020103r1lOMmol200NA10030大于等于2050nmole52NANA200nmole201031iPmol5025155lOMmol500NA

12、15050*These Yields are seen with the following 5， modifications: biotin, fluorescein(FITC), rhodamine, primary amines (NH2), phosphate (P04), HEX, TET, FAM, andphosphorothioates(S-01igos), Other modifications may have slightly lower yields.引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20。以大于浓度溶 于TE的引物在-20可以稳定保存6个月，但在

13、室温(15到30)仅能保存不到1周。 干粉引物可以在-20保存至少1年，在室温(15。到30)最多可以保存2个月。热启动热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA 聚合酶的最正确延伸温度在72,聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反响配制过程 中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物 一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、 表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。限制Taq DNA聚 合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反

14、响液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单廉价, 但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪到达变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大局部手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方 法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反响成分，如模板和缓冲 液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动 方法一样，蜡防护层法比拟烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效(图20)。Pla

15、tinum Taq DNA聚合酶 的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。抗体在PCR配制以及在 室温的延时保温过程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在变性步骤的94保温过程中被释放到 反响中，恢复了完全的聚合酶活性。同经化学彳修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比， Platinum酶不需要在94。延时保温(10到15分钟)以激活聚合酶。使用Platinum Taq DNA 聚合酶，在94进行2分钟就可以恢复90%的Taq DNA聚合酶活性。fewpss生一SPP n WOB-8L图20.使用Platinum Taq DNA聚合酶增加特异性A组.人基因组

16、DNA内克隆的HIV DNA的检测。W HIV gag区域的1000 个质粒DNA拷贝同100ng的基因组DNA混合，使用gag区域的引物进行 扩增。泳道1 .使用Taq DNA聚合酶，在室温配制反响液。泳道2.使用 Taq DNA聚合酶，通过在94加入酶而手工热启动。泳道3.使用 Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反响液。B组.由lOOng人基因 组DNA扩增4. 1 kb的人球蛋白。泳道1.使用Taq DNA聚合酶，在室 温配制反响液泳道2.使用Taq DNA聚合酶，在冰上配制反响液并放置 在预热（80）的PCR仪。泳道3.使用Platinum Taq DNA聚合酶，在 室

17、温配制反响液。镁离子浓度 镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影 响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最正确的镁离 子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200PM dNTP的典型PCR起始浓度是L5mM （注意：对实时定量PCR,使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子 浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最正确浓度，从lmM到 3mM,以0.5mM递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum

18、 Taq DNA聚合酶能够在比Taq DNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保 持功能，因此仅需较少的优化（图21）。2J8 kbRinelA(mM MgCl2)1.01.41.82.2 2G 3.0Panel B(mM MgCls)1.011.82.22.63.0图21.使用Platinum Taq DNA聚合酶拓宽镁离子浓度范围由100ng人基因组DNA扩增人球蛋白基因的2. 8kb区域。A组，使用Taq DNA聚合酶，在冰上配制 反响液并放置在预热（80）的PCR仪。B组，使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反响液。促进PCR的添加剂 退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足

19、以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模 板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物 特异性和产量的另外一种方法（图22）。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外， 二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO,甘油，甜菜碱以及 PCRx Enhancer Solution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物 退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution还有其他优点。在同Platinum Taq DNA聚合酶（图22）和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用时，基本上不

20、需要优化镁离子 浓度。这样，将Platinum技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离 子优化的依赖。为获得最正确结果，应优化添加剂的浓度（图23）,尤其是会抑制Taq DNA聚 合酶的DMSO,甲酰胺和甘油。PdnelAPanels-EG bp62% GC图22.使用PCRx Enhancer Solution提高特异性使用Platinum Taq DNA聚合酶，由lOOng人基因组DNA扩增一条156bp 的片段（GC含量62%）。使用标准PCR缓冲液（A组）或带有IXPCRx Enhancer Solution 的PCRx Amplificaton Buufer （B

21、组）,测试不同 的MgC12浓度（泳道1到4分别为1.0, 1.5, 2.0, 2.5mM）。循环在 94 30秒，60 30秒，68 1分钟进行35个循环。OX IX 2X 2.5X 3X 3.5X 4X-149 bp78% GC图23.测试PCRx Enhancer Solution的不同浓度在带有不同量 PCRx Enhancer Solution （0 到 4X）的 IXPCRx Amplificaton Buufer 中，使用Platinum Taq DNA聚合酶,对包含三 核昔重复的149bp序列（GC含量78%）进行扩增。尸L一AWAAAIA.从MW 映/AWAAAlAh-MMM

22、Z*- jnrrm/- AWMAMMiWtM做，从 AMAA 仲*一、nrnrn图1. RT-PCR概图，一增加RT-PCR灵敏别离高质量RNA 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑 制剂，如EDTA或SDSo RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一 般的RNA纯化方法是使用异硫氟酸胭/酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见以下图）将一步 法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少 100个细胞或Img组织中提取RNA。TRIzol试剂步骤略图Elapsed Time i图

23、7 RNaseH处理对RT-PCR的影响使用 SuperScript II (S)、NHfLV (M)或 AMV (A),由 5|j g Hela RNA 合成人 tuberous sclerosis II mRNA (5. 3kb)的全长cDNA, 反响产物的一半使用RnasII处理30分钟，使用ELONGASE Enzyme Mix对相当于起始RNA 0.5%的经处理及未处理逆转录产物进行 35个循环的扩增。小量RNA检测方法的提高 当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA别离过程中加入的作为载体的糖元有 助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase

24、的糖元。糖元是水溶性 的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞 的样品，无RNase糖元的建议浓度为250P g/mlo在使用SuperScript II的逆转录反响中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度(图8),而且对于 小量RNA,减少SuperScript II的量并加入40单位的RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测 的水平。如果在RNA别离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScript II进行逆转录反 应时加入BSA或RNase抑制剂。i1 rRi123456 r1234 S 67图9 一步法RT-PCR的灵敏度使用 SuperSc

25、ript II One-Step RT-PCR System 从 0, 0. 1, 1, 10, 102, 103pg Hela 总 RNA （分别为泳道1-6）扩增/?-actin片段。反响在50保温30分钟；942分钟；然 后9415秒，5530秒，6890秒进行40个循环；随后在68保温5分钟。反响中 包含200 nM正义和反义引物。步法同两步法RT-PCR的比拟 两步法RT-PCR比拟常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比拟有用。然而一步法RT-PCR 具有其他优点（表3）。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少剩余污染，因为在cDNA合成和扩增 之间不需要翻开管盖。

26、一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以到达O.lpg总RNA,这是因 为整个cDNA样品都被扩增（图9）。对于成功的一步法RT-PCR, 一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。表3. 一步法和两步法RT-PCR的比拟两步法步骤一步法步骤起始第一链cDNA合成使用：起始第一链合成使用Oligo(dT)GSP引物随机六聚体GSP引物优点优点灵活方便引物选择扩增酶同逆转录酶预先混合扩增酶的选择转管步骤少，减少污染可能性困难RT-PCR的优化能力高灵敏度同Platinum酶结合提高特异性适用于大量样品分析同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提身忠头性适用于定量PCR适用于在单个样

27、品中检测几个mRNA关于扩增酶和产物大小应注意,对于小于 4kb 的产物使用Taa DNA 聚合酶或Platinum Tag DNA 聚合酶对于小于 12kb 的产物使用Platinum Pfx Taq DNA 聚合前或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 对于大于12kb的产物使用ELONGAE Enzyme Mix对于一步法RT-PCR,如果产物小于3. 5kb,使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果 产物小于 9kb,使用 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。增加RT-PCR特异性第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成 cDNA的量和种类。随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整