【教学课件】第三章细胞生物学实验技术.ppt

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1、第三章细胞生物学实验技术METHODS AND TECHNIQUESMETHODS AND TECHNIQUES第三节第三节 细胞分离技术细胞分离技术一、离心技术一、离心技术是是是是分分分分离离离离细细细细胞胞胞胞器器器器（如如如如细细细细胞胞胞胞核核核核、线线线线粒粒粒粒体体体体、高高高高尔尔尔尔基基基基体体体体）及及及及各各各各种大分子基本手段。种大分子基本手段。种大分子基本手段。种大分子基本手段。转速为转速为转速为转速为1025kr/min1025kr/min的离心机称为高速离心机。的离心机称为高速离心机。的离心机称为高速离心机。的离心机称为高速离心机。转速转速转速转速25kr/min2

2、5kr/min，离心力，离心力，离心力，离心力89K89K者称为超速离心机。者称为超速离心机。者称为超速离心机。者称为超速离心机。目目目目前前前前超超超超速速速速离离离离心心心心机机机机的的的的最最最最高高高高转转转转速速速速可可可可达达达达100000r/min100000r/min，离离离离心心心心力超过力超过力超过力超过500Kg500Kg。（一）差速离心（一）差速离心（一）差速离心（一）差速离心 Differential centrifugation Differential centrifugation特点：特点：特点：特点：l l介质密度均一；介质密度均一；介质密度均一；介质密度均

3、一；l l速度由低向高，逐级离心。速度由低向高，逐级离心。速度由低向高，逐级离心。速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉沉沉沉降降降降顺顺顺顺序序序序：核核核核线线线线粒粒粒粒体体体体溶溶溶溶酶酶酶酶体体体体与与与与过过过过氧氧氧氧化化化化物物物物酶酶酶酶体体体体内质网与高基体内质网与高基体内质网与高基体内质网与高基体核蛋白体。核蛋白体。核蛋白体。核蛋白体。可可可可将将将将细细细细胞胞胞胞器器器器初初初初步步步步分分分分离离离离，常常常常需需需需进进进进一

4、一一一步步步步通通通通过过过过密密密密度度度度梯梯梯梯离离离离心心心心再再再再行行行行分分分分离纯化。离纯化。离纯化。离纯化。Low speedHigh speedDifferential centrifugation（二）密度梯度离心（二）密度梯度离心用用用用介介介介质质质质在在在在离离离离心心心心管管管管内内内内形形形形成成成成一一一一连连连连续续续续或或或或不不不不连连连连续续续续的的的的密密密密度度度度梯梯梯梯度度度度，将将将将细细细细胞胞胞胞混混混混悬悬悬悬液液液液或或或或匀匀匀匀浆浆浆浆置置置置于于于于介介介介质质质质的的的的顶顶顶顶部部部部，通通通通过过过过离离离离心心心心力力力

5、力场场场场的的的的作作作作用用用用使使使使细胞分层、分离。细胞分层、分离。细胞分层、分离。细胞分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。类型：速度沉降、等密度沉降。类型：速度沉降、等密度沉降。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：分离活细胞的介质要求：分离活细胞的介质要求：分离活细胞的介质要求：l l1 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；）能产生密度梯度，且密度高

6、时，粘度不高；l l2 2）PHPH中性或易调为中性；中性或易调为中性；中性或易调为中性；中性或易调为中性；l l3 3）浓度大时渗透压不大；）浓度大时渗透压不大；）浓度大时渗透压不大；）浓度大时渗透压不大；l l4 4）对细胞无毒。）对细胞无毒。）对细胞无毒。）对细胞无毒。1、速度沉降、速度沉降 velocity sedimentation 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特特特特点点点点：介介介介质质质质密密密密度度度度较较较较低低低低，介介介介质

7、质质质的的的的最最最最大大大大密密密密度度度度应应应应小小小小于于于于被被被被分离生物颗粒的最小密度。分离生物颗粒的最小密度。分离生物颗粒的最小密度。分离生物颗粒的最小密度。原原原原理理理理：介介介介质质质质密密密密度度度度梯梯梯梯度度度度平平平平缓缓缓缓，分分分分离离离离物物物物按按按按各各各各自自自自的的的的沉沉沉沉降降降降系数以不同的速度沉降而达到分离。系数以不同的速度沉降而达到分离。系数以不同的速度沉降而达到分离。系数以不同的速度沉降而达到分离。2.等密度沉降等密度沉降 isopycnic sedimentation用途：分离密度不等的颗粒。用途：分离密度不等的颗粒。用途：分离密度不等

8、的颗粒。用途：分离密度不等的颗粒。特点：特点：特点：特点：l l介介介介质质质质密密密密度度度度较较较较高高高高，陡陡陡陡度度度度大大大大，介介介介质质质质的的的的最最最最高高高高密密密密度度度度应应应应大大大大于于于于被被被被分分分分离离离离组组组组分分分分的的的的最最最最大密度。大密度。大密度。大密度。l l所所所所需需需需的的的的力力力力场场场场通通通通常常常常比比比比速速速速率率率率沉沉沉沉降降降降法法法法大大大大1010010100倍倍倍倍，往往往往往往往往需需需需要要要要高高高高速速速速或或或或超超超超速速速速离心。离心。离心。离心。原原原原理理理理：样样样样品品品品各各各各成成成

9、成分分分分在在在在连连连连续续续续梯梯梯梯度度度度的的的的介介介介质质质质中中中中经经经经过过过过一一一一定定定定时时时时间间间间的的的的离离离离心心心心则则则则沉沉沉沉降降降降到到到到与与与与自自自自身身身身密密密密度度度度相相相相等等等等的的的的介介介介质质质质处处处处，并并并并停停停停留留留留在在在在那那那那里里里里达达达达到到到到平衡，从而将不同密度的成分分离。平衡，从而将不同密度的成分分离。平衡，从而将不同密度的成分分离。平衡，从而将不同密度的成分分离。Velocity(A)and Equilibrium(B)sedimentation二、流式细胞术二、流式细胞术用途：对单个细胞进行

10、快速定量分析与分选的一门技术。用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原原原原理理理理：包包包包在在在在鞘鞘鞘鞘液液液液中中中中的的的的细细细细胞胞胞胞通通通通过过过过高高高高频频频频振振振振荡荡荡荡控控控控制制制制的的的的喷喷喷喷嘴嘴嘴嘴，形形形形成成成成包包包包含含含含单单单单个个个个细细细细胞胞胞胞的的的的液液液液滴滴滴滴，在在在在激激激激光光光光束束束束的的的的照照照照射射射射下下下下，这这这这些些些些细细细细胞胞胞胞发发发发出出出出散散散散射射射射光光光光和和和和荧荧荧荧光光

11、光光，经经经经探探探探测测测测器器器器检检检检测测测测，转转转转换换换换为为为为电电电电信信信信号号号号，送送送送入入入入计计计计算算算算机机机机处处处处理理理理，输输输输出出出出统统统统计计计计结结结结果果果果，并并并并可可可可根根根根据据据据这这这这些些些些性性性性质质质质分分分分选选选选出出出出高高高高纯纯纯纯度度度度的的的的细细细细胞胞胞胞亚亚亚亚群群群群，分分分分离离离离纯纯纯纯度度度度可可可可达达达达99%99%。包包包包被被被被细细细细胞胞胞胞的的的的液液液液流流流流称称称称为为为为鞘鞘鞘鞘液，所用仪器称为流式细胞计（液，所用仪器称为流式细胞计（液，所用仪器称为流式细胞计（液，所

12、用仪器称为流式细胞计（flow cytometerflow cytometer）。）。）。）。三、细胞电泳三、细胞电泳原原原原理理理理：在在在在一一一一定定定定PHPH值值值值下下下下细细细细胞胞胞胞表表表表面面面面带带带带有有有有净净净净的的的的正正正正或或或或负负负负电电电电荷荷荷荷，能能能能在外加电场的作用下发生泳动。在外加电场的作用下发生泳动。在外加电场的作用下发生泳动。在外加电场的作用下发生泳动。各各各各种种种种细细细细胞胞胞胞或或或或处处处处于于于于不不不不同同同同生生生生理理理理状状状状态态态态的的的的同同同同种种种种细细细细胞胞胞胞荷荷荷荷电电电电量量量量有有有有所所所所不不不不同同同同，故在一定的电场中的泳动速度不同故在一定的电场中的泳动速度不同故在一定的电场中的泳动速度不同故在一定的电场中的泳动速度不同 。用用用用途途途途：检检检检测测测测细细细细胞胞胞胞生生生生理理理理状状状状态态态态和和和和病病病病理理理理状状状状态态态态、分分分分离离离离不不不不同同同同种种种种类类类类的的的的细细细细胞，如分离哺乳动物的胞，如分离哺乳动物的胞，如分离哺乳动物的胞，如分离哺乳动物的XYXY精子。精子。精子。精子。