茶叶生物技术第四章茶叶发酵工程课件.ppt

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1、第第4 4章章 茶叶发酵工程茶叶发酵工程微生物不仅包括最小的生物病毒（它只能在电子显微镜下才能观察到），也包括那些用肉眼和普通光学显微镜可观察到的生物。原生生物包括单细胞的细菌、原生动物、藻类、真菌和一些多细胞的藻类（如海藻）以及大而惹人注目的真菌（如蘑菇）。原生生物可分为两大类，即原核生物和真核生物。细菌（包括蓝细菌和蓝绿藻类），它们的细胞具有较简单的内部构造，被划归为原核生物。原生动物、藻类和真菌（它们的细胞具有较复杂的内部构造）与多细胞的高度分化的动、植物一起被划归为真核生物。1 1 微生物的基本知识微生物的基本知识（1 1）个体微小、结构简单）个体微小、结构简单（2 2）生长繁殖迅速）

2、生长繁殖迅速（3 3）种类繁多、分布广泛）种类繁多、分布广泛（4 4）容易变异）容易变异一般认为在茶叶固态发酵过程中，微生物产生柠檬酸等有机酸和多酚氧化酶、纤维素酶、果胶酶等多种胞外酶，促使茶叶成分转化，形成茶叶品质风味；同时微生物产生很多次级代谢产物，增加有益物质，形成茶叶的风味品质和增强茶叶保健功效物质。例如云南大叶种晒青毛茶在多种益生微生物的作用下，发生了品质与功效的系列变化。2 2 微生物的益生作用微生物的益生作用（1）有机酸：如柠檬酸、葡萄糖酸等。（2）酶：与茶叶品质形成有关的酶可能有多酚氧化酶、纤维素酶和半纤维素酶、果胶酶、过氧化氢酶、糖化酶、蛋白酶等。（3）次生代谢物：如在茶叶中

3、已发现有他汀类化合物。他汀药物是羟甲戌二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，是最为经典和有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗。（4）丰富营养药效成分，提升养生保健功能：茶叶存在的酵母等微生物，富含极丰富的蛋白质，具有人体所必需的八种氨基酸、B族维生素、维生素D2原、脂肪、粗纤维、碳水化合物、矿物元素、辅酶、辅酶A、辅酶Q、细胞色素C、卵磷脂、凝血质、谷胱甘肽和核糖核酸等。（5）增加茶叶滋味：酵母菌富含十多种氨基酸、肽、呈味核苷酸、维生素、多种微量元素，滋味鲜美，是天然调味品。由其生产的调味品酵母精具有强烈的呈味性能，是理想的风味增强剂，能赋予食品浓厚的滋味。酵母菌本身还有缓和酸味、去除

4、苦味、屏蔽咸味及异臭的效果。从微生物影响茶叶品质与安全的角度看，有几个问题值得进一步探究。一是茶叶发酵过程中有害微生物的分离鉴定及其变化规律和控制方法；二是茶叶发酵过程中有害微生物的代谢产物（如黄曲霉毒素、棕曲霉毒素、展青霉素、氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、橘青霉素、孢子毒等）及其危害的风险评估。虽然现行的食品安全国家标准食品中真菌毒素限量（2010年）并没有对发酵茶叶作出明确的规定，但鉴于茶叶发酵过程中有大量微生物的生长，发酵中也会存在杂菌的污染，可能会有真菌毒素的污染。通过控制好发酵环境和发酵条件如温度等，一般不会产生杂菌的污染和毒素的产生。但在今后应重视对茶叶真菌毒素的风险评估，实现茶

5、叶的清洁化加工；三是茶叶发酵过程中特殊耐高温（如高于60）等极端微生物的作用及安全风险评估；四是茶叶产品中有害微生物的种类及其来源、控制方法；五是茶叶产品中有害微生物在长时间贮藏过程以及不同贮藏条件下的变化规律及安全性；六是茶叶产品中残存微生物对茶叶感官品质的影响及控制方法。3 3 茶叶微生物的安全性研究 1 基本营养成分（1）碳（2）氮（3）氢（4）氧（5）磷（6）硫（7）钾（8）镁（9）Fe和Zn（10）Cu,Co,Mo和Ca（11）Na和 Cl （12）维生素第第2 2节节 茶叶微生物培养基制备与灭菌茶叶微生物培养基制备与灭菌（1）根据微生物特点选择培养基：在实际应用时，要依据微生物的不

6、同特性，来考虑培养基的组成，对典型的培养基配方需作必要的调整。（2）根据发酵方式选择培养基：在液体培养基中，营养物质是以溶质状态溶解于水中，这样微生物就能更充分接触和利用营养物质，更有利于微生物的生长和更好地积累代谢产物。固体培养基则常用于微生物菌种的保藏、分离、菌落特征鉴定、活细胞数测定等方面。（3）从生产实践和科学试验的不同要求选择（4）从经济效益方面考虑选择生产原料2 2 培养基的选择依据培养基的选择依据（1）根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基：不同的微生物所需要的培养基成分是不同的，要确定一个合适的培养基，就需要了解生产用菌种的来源、生理生化特性和一般的营养要求，根据不同生产菌种

7、的培养条件、生物合成的代谢途径、代谢产物的化学性质等确定培养基。（2）营养成分的恰当配比：一般情况下，碳氮比偏小，能导致菌体的旺盛生长，易造成菌体提前衰老自溶，影响产物的积累；碳氮比过大，菌体繁殖数量少，不利于产物的积累；碳氮比较合适，但碳源、氮源浓度高，仍能导致菌体的大量繁殖，增大发酵液粘度，影响溶解氧浓度，容易引起菌体的代谢异常，影响产物合成；碳氮比较合适，但碳源、氮源浓度过低，会影响菌体的繁殖，同样不利于产物的积累。3 3 培养基的设计原则培养基的设计原则（3）渗透压：配制培养基时，应注意营养物质要有合适的浓度。营养物质的浓度太低，不仅不能满足微生物生长对营养物质的需求，而且也不利于提高

8、发酵产物的产量和提高设备的利用率。但是，培养基中营养物质的浓度过高时，由于培养基溶液的渗透压太大，会抑制微生物的生长。此外，培养基中的各种离子的浓度比例也会影响到培养基的渗透压和微生物的代谢活动，因此，培养基中各种离子的比例需求要平衡。（4）pH值：一般霉菌和酵母菌比较适于微酸性环境，放线菌和细菌适于中性或微碱性环境。当微生物在培养过程中改变培养基的pH值而不利于本身的生长时，应以微生物菌体对各种营养成分的利用速度来考虑培养基的组成，同时加入缓冲剂，以调节培养液的pH值。在配制培养基时，除应注意以上几条原则外，还要考虑到营养成分的加入顺序，为了避免生成沉淀而造成营养成分的损失，加入的顺序一般为

9、先加入缓冲化合物，溶解后加入主要物质，然后加入维生素、氨基酸等生长素类的物质。（5）培养基成分配比的选择：培养基的组分(包括这些组分的来源和加入方法)、配比、缓冲能力、黏度、灭菌是否彻底、灭菌后营养破坏的程度及原料中杂质的含量都对菌体生长和产物形成有影响。目前还只能在生物化学、细胞生物学等的基本理论指导下，参照前人所使用的较适合于某一类菌种的培养基（常称为基础培养基）的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶等小型发酵设备，对碳、氮、无机盐和前体等进行逐个单因子试验，观察这些因子对菌体生长和产物合成量的影响，最后再综合考虑各因素的影响，得到一个适合该菌种的培养基的配方，在大规模生产中进行

10、必要的调整，以获得高产。为了减少实验次数，可考虑用“正交试验设计”等数学方法来确定培养基组分和浓度。另外，还可通过方差分析，了解哪些因素影响较大，以引起人们的注意。1 微生物利用营养物质的基本方式微生物利用营养物质的基本方式营养物质要进入（吸收和输送）细胞，主要面临两个问题：（1）细胞膜是疏水性的，而绝大多数营养物（存在于水溶液环境中）是亲水的；（2）如果营养物以非常低的浓度存在于环境中，营养物必须逆浓度梯度进入细胞，在营养物向细胞内积聚的过程中必须消耗自由能。第第3 3节节茶叶微生物接种和扩繁茶叶微生物接种和扩繁1 微生物利用营养物质的基本方式（1）简单扩散：细胞外营养物质的浓度必须大于或等

11、于细胞内该物质的浓度。（2）促进扩散：在细胞内的浓度总是小于或等于其在细胞外的浓度。（3）主动运输：细胞内营养物质浓度可以大于细胞外，必须花费能量才能逆浓度梯度把营养物质吸收进细胞（驱动营养物质向细胞内富集）。2 温湿度与茶叶品质的关系（1）温度：堆温过低，一些化学成分氧化降解所需的热量无法达到，导致发酵不足；堆温过高，会导致茶叶碳化，同样不利于茶叶良好品质的形成。（2）湿度：水是微生物新陈代谢所必需的六类基本营养要素之一，水在微生物代谢活动中是不可缺少的。3 发酵茶叶常见菌种的分离与培养（1）黑曲霉的分离培养：初筛，复筛，培养。黑曲霉菌落（左为正面，右为反面）黑曲霉菌落（左为正面，右为反面）

12、（2）酿酒酵母的分离培养酿酒酵母菌落（左为正面，右为反面）酿酒酵母菌落（左为正面，右为反面）（3）绿色木霉的分离培养（4）少根根霉的分离培养根霉菌落（左为正面，右为反面）根霉菌落（左为正面，右为反面）1 发酵过程与微生物：普洱茶、康砖茶、茯砖茶、六堡茶和云南少数民族地区的酸茶、腌茶等发酵茶的加工中微生物也发挥了重要作用，经过发酵后茶叶具有了独特的色、香、味和营养价值。2 微生物与茶叶品质：参与茶叶发酵的微生物中，曲霉、根霉、木霉和酵母菌等都是与人类关系极为密切，属具有较高经济价值的菌群，也是对茶叶品质形成具有重要影响的微生物。微生物的酶促作用，茶叶原料及半成品中的基础物质（如茶多酚、蛋白质与氨

13、基酸、糖类等）大量快速转化重组，使得茶叶品质特征（干茶色泽红褐，茶汤红浓明亮，香气独特陈香）在较短的时间内快速形成。3 发酵剂研发应用：茶叶发酵剂则是指在茶叶生产和发酵过程中起有效作用的微生物培养物（如黑曲霉发酵剂、酵母发酵剂、木霉发酵剂等）。第第4 4节节茶叶微生物发酵过程茶叶微生物发酵过程1 1 茶叶中微生物的来源茶叶中微生物的来源（1 1）毛茶）毛茶（2 2）加工环境）加工环境（3 3）人工添加）人工添加第第5 5节节 茶叶微生物分离提纯茶叶微生物分离提纯2 2 茶叶中微生物的分离鉴定茶叶中微生物的分离鉴定（1 1）普普洱洱茶茶：普洱茶加工过程中微生物及酶系变化的研究，发现黑曲霉、青霉、

14、根霉、灰绿曲霉和酵母等微生物存在于普洱茶的整个加工过程中，其中初期黑曲霉最多，约占微生物总数的80%。（2 2）茯砖茶）茯砖茶：冠突散囊菌。（3 3）六六堡堡茶茶：起主要作用的是霉菌，其中曲霉、青霉在制茶过程中有促进变色作用，但是若干霉菌如黑曲霉则起相反作用。六堡茶在后发酵阶段，也有少量金黄色散囊菌出现，能产生淀粉酶、氧化酶。六堡茶在晾置陈化后，茶中便可见到有许多金黄色“金花”，这是有益品质的黄霉菌。（4 4）黑毛茶）黑毛茶：黑茶在渥堆中微生物群落主要是酵母、霉菌和细菌。其中以酵母菌最多，且为假丝酵母中的种类；霉菌则以黑曲霉占优势，其次为青霉；细菌为无芽孢短小杆菌等。（5 5）康砖和青砖茶）康

15、砖和青砖茶：康砖、青砖等砖茶中都含有多种真菌，康砖茶品质主要是湿热和微生物作用引起内含物变化而形成。（6 6）其他发酵茶类）其他发酵茶类：具有酸味和苦涩味的酸茶作为一种民族特色食品，深受少数民族如德昂族、布朗族的喜爱。腌制型酸茶的基本工艺流程：鲜叶清洗水潦杀青沥水盐渍装瓶压实密封厌氧发酵成品。（1）茶叶原料与微生物多样性：不同厂家生产的茶叶具有不同的风味，不同产地原料在茶叶发酵过程中优势菌群有所差异。（2）地域与微生物多样性：从各地市售茶叶中分离鉴定出的微生物也存在较大差别，在不同地区发酵、贮藏的茶叶品质和风味均存在较大差异。应加强对茶叶主要产区环境（水、土壤、空气以及茶树）微生物的分布规律、

16、生长发育规律及其对茶叶的作用机理的研究。3 3 茶叶中的微生物多样性茶叶中的微生物多样性（3）产品与微生物多样性：在发酵过程中利用发酵微生物的多样性可能产生不同风格、不同功能的茶叶。如可以利用产GABA的菌株作为优势菌，可能生产出可降血压的GABA发酵茶叶；利用产洛伐他汀的菌株作为优势菌，可能生产出可降血脂的洛伐他汀发酵茶叶；利用产根霉和酵母菌株作为优势菌，有可能开发出具高含量寡糖的发酵茶叶。（4）茶叶风味多样性：茶叶品质风味形成的实质是在微生物产生各种酶的酶促作用以及湿热作用（其热源包括干燥过程的外源热及发酵过程微生物释放的生物热）综合作用下，使内含成分实现一系列如氧化、聚合、缩合、分解等复杂的化学变化，形成对茶叶品质有利的产物。（5）茶叶功能多样性：茶叶中的酮苷具有维生素P的作用，可防止人体血管的硬化；茶多糖对肿瘤发生的启动、促癌和增殖阶段均有抑制作用；茶多酚是一种天然的抗氧化剂，具有抑制脂质过氧化、抗凝、促纤溶、抗血小板凝集、降血压、降血脂、防治动脉粥样硬化、保护心肌、清除自由基等生物学作用；茶色素具有显著的抗凝、促纤溶、抗血小板凝集、抑制动脉平滑肌细胞增生的作用，能有效防止动脉粥样硬化症。