【教学课件】第六章酶工程制药.ppt

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1、第六章第六章 酶工程制药酶工程制药第一节第一节 概概 述述第二节第二节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化第三节第三节 固定化酶和固定化细胞的反应器固定化酶和固定化细胞的反应器第四节第四节 酶工程研究的展望酶工程研究的展望 第六章第六章 酶工程制药酶工程制药 一、酶工程简介一、酶工程简介 二、酶的来源二、酶的来源 三、酶的生产菌三、酶的生产菌 四、酶在医药领域的应用四、酶在医药领域的应用第一节第一节 概概 述述一、酶工程简介一、酶工程简介1.酶工程（酶工程（enzyme engineering）的概念：）的概念：是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术科学，它是是酶学和工程学相互渗透发展而成

2、的一门新的技术科学，它是从应用的目的出发研究酶，应用酶的特异性催化功能并通过工程化将从应用的目的出发研究酶，应用酶的特异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。相应原料转化成有用物质的技术。一、酶工程简介一、酶工程简介2.酶工程主要研究内容：酶工程主要研究内容：（1）酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的应用开发；酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的应用开发；（2）酶酶和和细细胞胞的的固固定定化化及及酶酶反反应应器器的的研研究究（包包括括酶酶传传感感器器、反反应应检检测测等等）；（3）酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究；）酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰

3、酶（突变酶）的研究；（4）酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究；）酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究；（5）有机相中酶反应的研究；）有机相中酶反应的研究；（6）酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究；）酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究；（7）抗体酶、核酸酶的研究；）抗体酶、核酸酶的研究；（8）模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。）模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。酶工程技术和应用研究在工业、农业、医药和食品等方面发挥着极其重酶工程技术和应用研究在工业、农业、医药和食品等方面发挥着极其重要的作用。要的作用。二、酶的来源二、酶的来源1.

4、直接从生物体抽提分离（动物、植物、微生物）直接从生物体抽提分离（动物、植物、微生物）动物组织提供的酶主要有胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪的凝乳酶等。动物组织提供的酶主要有胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪的凝乳酶等。植物提供的酶主要有蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。植物提供的酶主要有蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。动植物原料的生长周期长、来源有限，又受地理、气候和季节等因素动植物原料的生长周期长、来源有限，又受地理、气候和季节等因素 的影响，不适于大规模生产。的影响，不适于大规模生产。近近10多年来，动植物组织和细胞培养技术取得了很大的进步，但因多年来，动植物组织和细胞培养技术取得了很大的进步，但因 其周期长、成本高

5、，因而还有一系列问题正待解决。其周期长、成本高，因而还有一系列问题正待解决。目目前前工工业业生生产产一一般般都都以以微微生生物物为为主主要要来来源源，目目前前在在千千余余种种被被使使用用的的商商品酶中，大多数都是利用微生物生产的。品酶中，大多数都是利用微生物生产的。2.人工合成人工合成 二、酶的来源二、酶的来源利用微生物生产酶制剂的优点：利用微生物生产酶制剂的优点：（1）微生物种类繁多，酶的品种齐全，可以说一切动植物体内存在）微生物种类繁多，酶的品种齐全，可以说一切动植物体内存在 的酶几乎都能从微生物中得到。的酶几乎都能从微生物中得到。（2）微生物繁殖快、生产周期短、产量高。）微生物繁殖快、生

6、产周期短、产量高。（3）培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高，并可）培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉，经济效益高，并可 以通过控制培养条件来提高酶的产量。以通过控制培养条件来提高酶的产量。（4）微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过各种遗传变异）微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过各种遗传变异 的手段，培育出新的高产菌株。的手段，培育出新的高产菌株。三、酶的生产菌三、酶的生产菌 1酶的发酵技术：酶的发酵技术：有目的地利用微生物生产酶的方法称为酶的发酵技术。有目的地利用微生物生产酶的方法称为酶的发酵技术。2.作为酶制剂的生产菌应具备以下几点要求：作为酶制剂的生产菌应具备

7、以下几点要求：（1）繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而且）繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而且 最好是产生胞外酶的菌；最好是产生胞外酶的菌；（2）不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生）不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生 有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要；有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要；（3）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；）产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；（4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。三、酶的生产菌三、酶的生产菌3生产菌的来源生产菌的来源（1）菌种保藏机

8、构和有关研究部门；）菌种保藏机构和有关研究部门；（2）从自然界中分离筛选。）从自然界中分离筛选。自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。种采集地。4.筛选产酶菌的方法主要包括以下几个步骤：筛选产酶菌的方法主要包括以下几个步骤：菌样采集、菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。菌样采集、菌种的分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。为了提高酶的产量，在酶的生产过程中应不断改良生产菌。主要应用为了提高酶的产量，在酶的生产过程中应不断改良生产菌。主要应用遗传学原理进行改良，其基本途径有：基因突变、基因

9、转移和基因克隆。遗传学原理进行改良，其基本途径有：基因突变、基因转移和基因克隆。三、酶的生产菌三、酶的生产菌5目前常用的产酶微生物：目前常用的产酶微生物：大肠杆菌大肠杆菌（Ecoli）用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰）用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰 化酶、化酶、半乳糖苷酶等。半乳糖苷酶等。枯草杆菌枯草杆菌主要用于生产淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶主要用于生产淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶 酵母酵母主要用于生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶等。主要用于生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶等。曲霉（黑曲霉和黄曲霉）曲霉（黑曲霉和黄曲霉）可用于生产糖化酶、蛋白酶、

10、淀粉酶、果胶酶、可用于生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶等。葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶等。青霉青霉主要用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、主要用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5磷酸二酯酶、磷酸二酯酶、脂肪酶等的；脂肪酶等的；根霉根霉主要用于生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶主要用于生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶 木霉木霉主要用于生产纤维素酶主要用于生产纤维素酶 链霉菌链霉菌主要用于生产葡萄糖异构酶等主要用于生产葡萄糖异构酶等四、酶在医药领域的应用四、酶在医药领域的应用1.在疾病诊断方面的应用在疾病诊断方面的应用 酶学诊断方法可靠、简便、快捷，在临床诊断中已被

11、广泛使用。酶学诊断方法可靠、简便、快捷，在临床诊断中已被广泛使用。酶学诊断包括两个方面：酶学诊断包括两个方面：一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，如利用谷一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，如利用谷丙转氨酶活力升高来诊断肝炎；丙转氨酶活力升高来诊断肝炎；二是用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病，如利用葡萄糖二是用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病，如利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量，诊断糖尿病等。氧化酶测定血糖含量，诊断糖尿病等。四、酶在医药领域的应用四、酶在医药领域的应用 2.在疾病治疗方面的应用在疾病治疗方面的应用 由于酶具有专一性和高效率的特点，所以在医药方面使用的酶具有由于酶具

12、有专一性和高效率的特点，所以在医药方面使用的酶具有种类多、用量少和纯度高等特点。种类多、用量少和纯度高等特点。主要的医药用酶有：主要的医药用酶有：（1）蛋白酶主要用于消化不良和食欲不振等。）蛋白酶主要用于消化不良和食欲不振等。（2）溶菌酶具有抗菌、消炎、镇痛等作用。）溶菌酶具有抗菌、消炎、镇痛等作用。（3）超氧化物歧化酶，具有抗辐射作用。）超氧化物歧化酶，具有抗辐射作用。（4）L-天冬酰胺酶用于治疗白血病。天冬酰胺酶用于治疗白血病。（5）尿激酶具有溶血栓的活性。）尿激酶具有溶血栓的活性。（6）其他相关酶制剂，如细胞色素）其他相关酶制剂，如细胞色素C等。等。四、酶在医药领域的应用四、酶在医药领域

13、的应用3.在药物生产方面的应用在药物生产方面的应用 酶在药物制造方面的应用是利用酶的催化作用将前体物质转为酶在药物制造方面的应用是利用酶的催化作用将前体物质转为药物。药物。主要的应用有：主要的应用有：（1）利用青霉素酰化酶制造半合成青霉素和头孢霉素；）利用青霉素酰化酶制造半合成青霉素和头孢霉素；（2）利用）利用-酪氨酸酶制造多巴酪氨酸酶制造多巴 （3）利用核苷磷酸化酶生产阿糖腺苷）利用核苷磷酸化酶生产阿糖腺苷 （4）利用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素等。）利用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素等。四、酶在医药领域的应用四、酶在医药领域的应用 4.在分析检测方面的应用在分析检测方面的

14、应用 用酶进行物质分析检测的方法统称为酶法检测或酶法分析。用酶进行物质分析检测的方法统称为酶法检测或酶法分析。酶法检测可以分为单酶反应、多酶偶联反应和酶标免疫反应等三类。酶法检测可以分为单酶反应、多酶偶联反应和酶标免疫反应等三类。第二节第二节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备二、固定化细胞的制备二、固定化细胞的制备三、固定化方法与载体的选择依据三、固定化方法与载体的选择依据四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备1固定化酶的定义：固定化酶的定义：固定化酶（固定化酶（immobilized e

15、nzyme）是指限制或固定于特定空间位置）是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。称为酶的固定化。一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备2固定化酶的特点：固定化酶的特点：固定化酶的最大特点是既具有生物催化剂的功能，又具有固定化酶的最大特点是既具有生物催化剂的功能，又具有 固相催化剂的特性。固相催化剂的特性。与天然酶相比，固定化酶具有下列优点：与天然

16、酶相比，固定化酶具有下列优点：（1）酶的稳定性提高。）酶的稳定性提高。（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高。易于纯化，产品质量高。（3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续和自动控制。）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续和自动控制。（4）酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少。）酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少。（5）比水溶性酶更适合于多酶反应。）比水溶性酶更适合于多酶反应。一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备固定化酶的缺点：固定化酶的缺点：（1）固定化时，酶活力有损失。

17、）固定化时，酶活力有损失。（2）增加了生产的成本，工厂初始投资大。）增加了生产的成本，工厂初始投资大。（3）只能用于可溶性底物，而且较适于小分子底物，对大分子底物不适宜。）只能用于可溶性底物，而且较适于小分子底物，对大分子底物不适宜。（4）胞内酶必须经过酶的分离纯化过程。）胞内酶必须经过酶的分离纯化过程。（5）与完整菌体相比不适宜用于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。）与完整菌体相比不适宜用于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备 3酶的固定化方法与制备技术：酶的固定化方法与制备技术：按所用的载体和操作方法的差异，一般可分为：按所用的载体和操作方法的差异，一

18、般可分为：（1）载体结合法）载体结合法 （2）包埋法）包埋法 （3）交联法）交联法一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备（1）载体结合法）载体结合法 载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的种固定化方法。根据种固定化方法。根据结合形式的不同，可分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法等三结合形式的不同，可分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法等三种。种。一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备（2）交联法）交联法 交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之交联法是用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联的固定化方法。间交联的固定化方法。常

19、用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺常用的交联剂有戊二醛、双重氮联苯胺2,2二磺酸、二磺酸、1,5二氟二氟2,4二硝基苯及己二酰亚胺二甲酯等。二硝基苯及己二酰亚胺二甲酯等。交联法又可分为交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法及载交联法又可分为交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法及载体交联法体交联法4种。种。一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备（3）包埋法）包埋法 包埋法可分为网格型和微囊型两种。包埋法可分为网格型和微囊型两种。将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型；将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型；将酶或细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。将酶或细胞包埋在高分子半

20、透膜中的称为微囊型。一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备 4酶和细胞的固定化载体酶和细胞的固定化载体 在酶的固定化过程中所用的水不溶性固体支持物称为载体或基质。在酶的固定化过程中所用的水不溶性固体支持物称为载体或基质。固定化载体种类很多，其来源、结构和性质各不相同。因此在固定化固定化载体种类很多，其来源、结构和性质各不相同。因此在固定化过程中，需根据酶促反应性质、底物类型及固定化方法，选择相应的载体过程中，需根据酶促反应性质、底物类型及固定化方法，选择相应的载体或基质。或基质。一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备固定化过程中使用的载体需符合如下条件：固定化过程中使用的载体需符合如下条件：（1）

21、固定化过程中不引起酶变性；固定化过程中不引起酶变性；（2）对酸碱有一定的耐受性；对酸碱有一定的耐受性；（3）有一定的机械强度；）有一定的机械强度；（4）有有定的亲水性及良好的稳定性；定的亲水性及良好的稳定性；（5）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；（6）共价结合时具有可活化基团；）共价结合时具有可活化基团；（7）有耐受酶和微生物细胞的能力；有耐受酶和微生物细胞的能力；（8）廉价易得。廉价易得。一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备酶和细胞的固定化载体主要有以下酶和细胞的固定化载体主要有以下3类：类：（1）吸附载体）吸附载体：用于吸附法制备固定化酶，有物理吸附和离用

22、于吸附法制备固定化酶，有物理吸附和离 子吸附。物理吸附所用的载体有无机物和有机物。子吸附。物理吸附所用的载体有无机物和有机物。（2）包埋载体：）包埋载体：工业上应用的包埋载体主要为卡拉胶、海藻胶等。工业上应用的包埋载体主要为卡拉胶、海藻胶等。（3）交联载体：）交联载体：交联法与吸附法和包埋法所用的载体相同。交联法与吸附法和包埋法所用的载体相同。二、固定化细胞的制备二、固定化细胞的制备1.固定化细胞的定义固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为被限制或定位于特定空间位置的细

23、胞称为固定化细胞固定化细胞，它与固定化酶，它与固定化酶 一起被称为固定化生物催化剂。一起被称为固定化生物催化剂。固定化细胞固定化细胞主要是利用细胞内酶和酶系，它的实际应用比固定化酶更为普遍。主要是利用细胞内酶和酶系，它的实际应用比固定化酶更为普遍。细胞固定化技术的应用比固定化酶更为普遍，已在医药、食品、细胞固定化技术的应用比固定化酶更为普遍，已在医药、食品、化工、医疗诊断、农业、分析、环保、能源开发及理论研究的应用化工、医疗诊断、农业、分析、环保、能源开发及理论研究的应用 中取得了举世瞩日的成就。中取得了举世瞩日的成就。二、固定化细胞的制备二、固定化细胞的制备2.固定化细胞的特点固定化细胞的特

24、点 固定化细胞既有细胞特性，也有生物催化剂功能，又具有固相催化剂待点。固定化细胞既有细胞特性，也有生物催化剂功能，又具有固相催化剂待点。其优点在于：其优点在于：（1）无需进行酶的分离纯化。）无需进行酶的分离纯化。（2）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高。）细胞保持酶的原始状态，固定化过程中酶的回收率高。（3）细胞内酶比固定化酶稳定性更高。）细胞内酶比固定化酶稳定性更高。（4）细胞内酶的辅因子可以自动再生。）细胞内酶的辅因子可以自动再生。（5）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应。）细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应。（6）抗污染能力强。）抗污染能力强。二、固定化细胞的制备二、固定

25、化细胞的制备2.固定化细胞的特点固定化细胞的特点 固定化技术的局限性：固定化技术的局限性：（1）利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物）利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物 （2）细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。）细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。（3）载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。）载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。二、固定化细胞的制备二、固定化细胞的制备3.固定化细胞的制备技术固定化细胞的制备技术 细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，其制备方法和应用方法也细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，其制备方

26、法和应用方法也基本相同，但细胞的固定比主要适用于胞内酶，要求底物和产物容易透过细基本相同，但细胞的固定比主要适用于胞内酶，要求底物和产物容易透过细胞膜，细胞内不存在产物分解系统及其他副反应；若存在副反应，应具有相胞膜，细胞内不存在产物分解系统及其他副反应；若存在副反应，应具有相应的消除措施。应的消除措施。固定化细胞的制备方法有载体结合法、包埋法、交联法及无载体法等。固定化细胞的制备方法有载体结合法、包埋法、交联法及无载体法等。三、固定化方法与载体的选择依据三、固定化方法与载体的选择依据 1固定化方法的选择固定化方法的选择 应考虑下述几个因素来选择固定化的方法：应考虑下述几个因素来选择固定化的方

27、法：（1）固定化酶应用的安全性）固定化酶应用的安全性 （2）固定化酶在操作中的稳定性）固定化酶在操作中的稳定性 （3）固定化的成本固定化的成本 2载体的选择载体的选择 最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶及海藻胶等。另外离子交换树脂、金属如聚乙烯醇、卡拉胶及海藻胶等。另外离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等，也都是有应用前途的载体。氧化物及不锈钢碎屑等，也都是有应用前途的载体。三、固定化方法与载体的选择依据三、固定化方法与载体的选择依据载体的选择还应考虑底物的性质。载体的选择还应考虑底物的性质。固定化方法具有多样性

28、。固定化方法具有多样性。三、固定化方法与载体的选择依据三、固定化方法与载体的选择依据 1固定化酶与固定化细胞的形状固定化酶与固定化细胞的形状 已有多种物理形状的固定化酶，如酶膜、酶管、酶纤维、已有多种物理形状的固定化酶，如酶膜、酶管、酶纤维、微囊和颗粒状的固定化酶。微囊和颗粒状的固定化酶。颗粒状的固定化酶包括酶珠、酶块、酶片和酶粉等。颗粒状的固定化酶包括酶珠、酶块、酶片和酶粉等。制造何种形状的固定化酶，需要根据底物和产物的性质、制造何种形状的固定化酶，需要根据底物和产物的性质、基质材料的性能、固定化的方法、酶反应的性质、反应器的类基质材料的性能、固定化的方法、酶反应的性质、反应器的类型和应用目

29、的来决定。型和应用目的来决定。四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质 （1）颗粒状固定化酶）颗粒状固定化酶 颗粒状的固定化酶包括酶珠、酶块、酶片和酶粉等。颗粒状的固定化酶包括酶珠、酶块、酶片和酶粉等。每种固定化方法均可制备颗粒状的固定化酶，制备方法简单，每种固定化方法均可制备颗粒状的固定化酶，制备方法简单，颗粒比表面积大，转化效率高，适用于各种类型的反应器。颗粒比表面积大，转化效率高，适用于各种类型的反应器。如海藻胶溶液和酿酒酵母的混合液经喷珠机压入到如海藻胶溶液和酿酒酵母的混合液经喷珠机压入到CaCl2溶液溶液 中即可制成固定化的酵母酶珠，可用于工业化中乙醇

30、的大规模生产。中即可制成固定化的酵母酶珠，可用于工业化中乙醇的大规模生产。四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质 （2）纤维状固定化酶）纤维状固定化酶 某些材料，如三醋酸纤维素，用适当的溶剂溶解后与酶混合，某些材料，如三醋酸纤维素，用适当的溶剂溶解后与酶混合，再采用喷丝的方法就可制成酶纤维。如将含酶的甘油水溶液滴入再采用喷丝的方法就可制成酶纤维。如将含酶的甘油水溶液滴入 三醋酸纤维素的二氯甲烷溶液中，乳化后经喷丝头喷入含丙酮的三醋酸纤维素的二氯甲烷溶液中，乳化后经喷丝头喷入含丙酮的 凝固液中即成为纤维状，取出后真空干燥即得固定化酶。凝固液中即成为纤维状，取出后

31、真空干燥即得固定化酶。纤维状固定化的的比表面积大，转化效率高，但只适用于填充纤维状固定化的的比表面积大，转化效率高，但只适用于填充 床反应器。酶纤维也可以织成酶布用于填充床反应器。床反应器。酶纤维也可以织成酶布用于填充床反应器。四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质 （3）膜状固定化酶）膜状固定化酶 膜状固定化酶也称为酶膜，可以通过共价结合法将酶偶联膜状固定化酶也称为酶膜，可以通过共价结合法将酶偶联 到滤膜上制备，也可以将酶和某些材料如火棉胶、硝酸纤维素到滤膜上制备，也可以将酶和某些材料如火棉胶、硝酸纤维素 、骨胶原和明胶等，用戊二醛交联或其他方法处理后制成膜

32、状。、骨胶原和明胶等，用戊二醛交联或其他方法处理后制成膜状。酶膜的表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可酶膜的表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可 用于填充床反应器。用于填充床反应器。目前已制备出木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、氨基酰目前已制备出木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、氨基酰 化酶和脲酶等多种酶膜。化酶和脲酶等多种酶膜。四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质 （4）管状固定化酶）管状固定化酶 管状固定化酶称为酶管，某些管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和管状固定化酶称为酶管，某些管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和 聚丙烯酰胺等，经活化后与酶偶联

33、即得固定化酶管。聚丙烯酰胺等，经活化后与酶偶联即得固定化酶管。目前已制备出糖化酶、转化酶和脲酶等酶管，酶管在化学分析目前已制备出糖化酶、转化酶和脲酶等酶管，酶管在化学分析 中可用于连续测定。中可用于连续测定。酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可以组装酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可以组装成列管式反应器。成列管式反应器。四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质 细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，制备方法也基本相细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，制备方法也基本相 同，因此许多固定化细胞的形状与固定化酶的形状相同，如珠状、块同，

34、因此许多固定化细胞的形状与固定化酶的形状相同，如珠状、块 状、片状或纤维状等。状、片状或纤维状等。固定化细胞的方法主要是包埋法，其次是交联法或二者相结合的固定化细胞的方法主要是包埋法，其次是交联法或二者相结合的 方法，用无载体法制备的是粉末状的固定化细胞，工业上应用最多的方法，用无载体法制备的是粉末状的固定化细胞，工业上应用最多的 就是用包埋法制备的各种形状的固定化细胞。就是用包埋法制备的各种形状的固定化细胞。四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质2固定化酶的性质固定化酶的性质 天然酶经过固定化后即成为固定化酶，其催化反应体系也天然酶经过固定化后即成为固定化酶

35、，其催化反应体系也由均相反应转变为非均相反应。由于固定化的方法和所用的载由均相反应转变为非均相反应。由于固定化的方法和所用的载体不同，制得的固定化酶可能会受到扩散限制、空间障碍、微体不同，制得的固定化酶可能会受到扩散限制、空间障碍、微环境变化和化学修饰等因素的影响，可能会导致酶学性质和酶环境变化和化学修饰等因素的影响，可能会导致酶学性质和酶活力的变化。活力的变化。四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质3固定化细胞的性质固定化细胞的性质 细胞被固定化后，其中酶的性质、稳定性、最适细胞被固定化后，其中酶的性质、稳定性、最适pH、最适温度和、最适温度和 Km值的变化

36、基本上与固定化酶相仿。值的变化基本上与固定化酶相仿。细胞的固定化主要是利用胞内酶，因此固定化的细胞主要用于催细胞的固定化主要是利用胞内酶，因此固定化的细胞主要用于催 化小分子底物的反应，而不适于大分子底物。化小分子底物的反应，而不适于大分子底物。无论采用哪种固定化方法，都需采用适当的措施来提高细胞膜的无论采用哪种固定化方法，都需采用适当的措施来提高细胞膜的 通透性，以提高酶的活力和转化效率。通透性，以提高酶的活力和转化效率。四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质四、固定化酶与固定化细胞的形状与性质1.固定化酶（细胞）活力的测定固定化酶（细胞）活力的测定2.偶联率及相对活力的测定偶联率及相对活力的

37、测定五、评价固定化酶（细胞）的指标五、评价固定化酶（细胞）的指标 第三节第三节 固定化酶和固定化细胞的反应器固定化酶和固定化细胞的反应器一、反应器的类型和特点一、反应器的类型和特点二、反应器的选择依据二、反应器的选择依据一、反应器的类型和特点一、反应器的类型和特点 可概括分为间歇式和连续式两大类，后者又有两种基本形式：连可概括分为间歇式和连续式两大类，后者又有两种基本形式：连 续流动搅拌罐式反应器和填充床反应器；续流动搅拌罐式反应器和填充床反应器；还有一些衍生形式，如连续流动搅拌罐还有一些衍生形式，如连续流动搅拌罐超滤膜反应器、循环反超滤膜反应器、循环反 应器和流化床反应器等。应器和流化床反应

38、器等。二、反应器的选择依据二、反应器的选择依据 目前虽有多种不同类型的反应器可供使用，但是并没有一种通目前虽有多种不同类型的反应器可供使用，但是并没有一种通用的理想的反应器，在研究和生产中，必须根据具体情况来选样合用的理想的反应器，在研究和生产中，必须根据具体情况来选样合适的反应器。影响反应器选择的因素很多，但一般从以下几方面考适的反应器。影响反应器选择的因素很多，但一般从以下几方面考虑：虑：1根据固定化酶的形状来选择根据固定化酶的形状来选择 2根据底物的物理性质来选择根据底物的物理性质来选择 3根据酶反应的动力学特性来选择根据酶反应的动力学特性来选择 4根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择根

39、据外界环境对酶的稳定性的影响来选择 5根据操作要求及反应器费用来选择根据操作要求及反应器费用来选择第四节第四节 酶工程研究的展望酶工程研究的展望一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰 二、酶的人工模拟二、酶的人工模拟三、有机相的酶反应三、有机相的酶反应四、基因工程酶的构建四、基因工程酶的构建一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰1.酶化学修饰的概念酶化学修饰的概念 从广义上说，凡涉及共价键或部分共价键的形成或破坏的转变从广义上说，凡涉及共价键或部分共价键的形成或破坏的转变都可看做是酶的化学修饰。都可看做是酶的化学修饰。从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较

40、温和的条件下，以可控制的方式使一种酶同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基制的方式使一种酶同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变。酸残基或其功能基团发生共价的化学改变。一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰2.酶化学修饰的目的酶化学修饰的目的 酶化学修饰的目的在于：人为地改变天然酶的一些性质，创造酶化学修饰的目的在于：人为地改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，来扩大酶的天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。应用领域，促进生物技术的发展。酶经过改造后会产生各种各样的变化，

41、概括起来主要有：酶经过改造后会产生各种各样的变化，概括起来主要有：（1）提高生物活性。）提高生物活性。（2）增强在不良环境（非生理条件）中的稳定性。）增强在不良环境（非生理条件）中的稳定性。（3）针对异体反应，降低生物识别能力。）针对异体反应，降低生物识别能力。可以说，酶的化学修饰在理论上为生物大分子结构与功能关系可以说，酶的化学修饰在理论上为生物大分子结构与功能关系的研究提供了有力的实验依据和证明，是改善酶学性质和提高其应用的研究提供了有力的实验依据和证明，是改善酶学性质和提高其应用价值的一种非常有效的措施。价值的一种非常有效的措施。3.酶化学修饰的方法酶化学修饰的方法（1）酶的表面化学修饰

42、）酶的表面化学修饰 大分子修饰大分子修饰 可溶性大分子，如聚乙二醇可溶性大分子，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙、聚丙烯酸烯酸(PAA)、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精、乙烯顺丁烯二酰肼共聚物、聚氨基酸、葡聚糖、环糊精、乙烯顺丁烯二酰肼共聚物、羧甲基纤维素、多聚唾液酸、肝素等可通过共价键连接在酶分子表面，形羧甲基纤维素、多聚唾液酸、肝素等可通过共价键连接在酶分子表面，形成覆盖层。成覆盖层。相对分子质量在相对分子质量在50020000范围内的范围内的PEG类修饰剂应用最广，它是既类修饰剂应用最广，它是既能溶于水，又可以溶于绝大多数有机溶剂的两亲分子，一般没有免疫原性

43、能溶于水，又可以溶于绝大多数有机溶剂的两亲分子，一般没有免疫原性 和毒性，其生物相容性已经通过美国和毒性，其生物相容性已经通过美国FDA认证。认证。一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰（1）酶的表面化学修饰）酶的表面化学修饰 小分子修饰：小分子修饰：利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行利用小分子化合物对酶的活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，以改变酶学性质。化学修饰，以改变酶学性质。已被广泛应用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、已被广泛应用的小分子化合物主要有氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、邻苯二酸酐、乙酸一邻苯二酸酐、乙酸一N一丁二酰亚胺酯等。一丁二酰亚

44、胺酯等。一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰（1）酶的表面化学修饰）酶的表面化学修饰交联修饰交联修饰 应用双功能基团试剂如戊二醛、应用双功能基团试剂如戊二醛、PEG等将酶蛋白分子之间、亚基之等将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联，可使酶分子活性结构加固，并间或分子内不同肽链部分间进行共价交联，可使酶分子活性结构加固，并可提高其稳定性，增加了酶在非水溶液中的使用价值。可提高其稳定性，增加了酶在非水溶液中的使用价值。固定化修饰固定化修饰一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰（2）酶分子内部修饰）酶分子内部修饰非催化活性基团的修饰非催化活性基团的修饰 最常修饰的残基既可以是亲核的，如最

45、常修饰的残基既可以是亲核的，如Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His；也可以是亲电的，如；也可以是亲电的，如Tyr、Trp；或者是可氧化的，如；或者是可氧化的，如Tyr、Trp、Met。对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。的束缚能力。一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰（2）酶分子内部修饰）酶分子内部修饰 蛋白主链的修饰蛋白主链的修饰 蛋白主链修饰主要靠酶法。蛋白主链修饰主要靠酶法。将猪胰岛素转变成人胰岛素就是一个成功的例子。猪和人的胰岛素仅将猪胰岛素转变成人胰岛

46、素就是一个成功的例子。猪和人的胰岛素仅在在链羧基端有一个氨基酸的差别。用蛋白水解酶将猪胰岛素链羧基端有一个氨基酸的差别。用蛋白水解酶将猪胰岛素链末端的链末端的Ala水解下来，再在一定条件下，用同一个酶将水解下来，再在一定条件下，用同一个酶将Thr接上去，就可以将猪胰接上去，就可以将猪胰岛素转变成人胰岛素。岛素转变成人胰岛素。一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰 （2）酶分子内部修饰）酶分子内部修饰 催化活性基团的修饰催化活性基团的修饰 选择性修饰氨基酸侧链。选择性修饰氨基酸侧链。一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰（2）酶分子内部修饰）酶分子内部修饰 与辅因子有关的修饰：包括以下几个方面与辅因子有关的

47、修饰：包括以下几个方面 A.依赖辅因子的酶可用两种方法进行化学修饰。依赖辅因子的酶可用两种方法进行化学修饰。第一，如果辅因子与酶的结合不是共价的，则可将辅因子共价第一，如果辅因子与酶的结合不是共价的，则可将辅因子共价 结合在酶上；结合在酶上；第二，引入新的或修饰过具有强反应性的辅因子。第二，引入新的或修饰过具有强反应性的辅因子。B.将新的辅酶引入结构已经弄清的蛋白质上。将新的辅酶引入结构已经弄清的蛋白质上。C.金属酶中的金属取代。金属酶中的金属取代。酶分子中的金属取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。酶分子中的金属取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。一、酶的化学修饰一、酶的化学修

48、饰（2）酶分子内部修饰）酶分子内部修饰 肽链伸展后的修饰肽链伸展后的修饰 为了有效地修饰酶分子的内部区域，可以先用脲或盐酸胍处理为了有效地修饰酶分子的内部区域，可以先用脲或盐酸胍处理酶，使酶分子的肽链充分伸展，这就提供了化学修饰酶分子内部疏酶，使酶分子的肽链充分伸展，这就提供了化学修饰酶分子内部疏水基团的可能性。然后，让修饰后的伸展肽链，在适当条件下，重水基团的可能性。然后，让修饰后的伸展肽链，在适当条件下，重新折叠成具有某种催化活力的构象。新折叠成具有某种催化活力的构象。一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰（3）结合定点突变的化学修饰）结合定点突变的化学修饰 通过一些可控制的方法在酶或蛋白质特殊

49、的位点引入特定分子来修通过一些可控制的方法在酶或蛋白质特殊的位点引入特定分子来修饰酶或蛋白质，结合定点突变引入一种非天然氨基酸侧链来进行化学修饰酶或蛋白质，结合定点突变引入一种非天然氨基酸侧链来进行化学修饰，从而得到一些新颖的酶制剂。饰，从而得到一些新颖的酶制剂。它的策略是利用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸它的策略是利用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用化学修饰法将突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小残基，然后利用化学修饰法将突变的氨基酸残基进行修饰，引入一个小分子化合物，得到一种称为化学修饰突变酶分子化合物，得到一种称为化学修饰突变酶(chemicall

50、y modifiedmutant enzyme,CMM)的新型酶。的新型酶。4.修饰酶的特性修饰酶的特性 酶分子经过化学修饰后，其特性在一定程度上发生了改变，天酶分子经过化学修饰后，其特性在一定程度上发生了改变，天然酶的一些不足之处可以得到改善。然酶的一些不足之处可以得到改善。（1）热稳定性提高；）热稳定性提高；（2）抗各类失活因子能力提高；）抗各类失活因子能力提高；（3）抗原性消除；）抗原性消除；（4）体内半衰期延长；）体内半衰期延长；（5）最适）最适pH改变；改变；（6）酶学性质变化；）酶学性质变化；（7）对组织分布能力改变。）对组织分布能力改变。一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰5.酶化学