【教学课件】第十一章高效毛细管电泳分析法.ppt

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1、第第十一十一章章高效毛细管电泳高效毛细管电泳分析法分析法一、毛细管区带电泳一、毛细管区带电泳(CZE)capillary zone electrophoresis二、毛细管凝胶电泳二、毛细管凝胶电泳(CZE)capillary gel electrophoresis三、胶束电动毛细管色谱三、胶束电动毛细管色谱micelle electrokinetic capillary electrophoresis四、毛细管等电聚焦四、毛细管等电聚焦(CIEF)capillary isoelectric focusing五、毛细管等速电泳五、毛细管等速电泳capillary isotachophoresi

2、s第四节第四节第四节第四节高效毛细管电泳高效毛细管电泳高效毛细管电泳高效毛细管电泳分离模式分离模式分离模式分离模式high performance capillary high performance capillary electrophoresis,HPCEelectrophoresis,HPCEseparate types of HPCEseparate types of HPCE 2023/1/102023/1/10分离类型分离类型八种分离类型，介绍常用的几种；八种分离类型，介绍常用的几种；八种分离类型，介绍常用的几种；八种分离类型，介绍常用的几种；根据试样性质不同，采用不同的分离类型

3、；根据试样性质不同，采用不同的分离类型；根据试样性质不同，采用不同的分离类型；根据试样性质不同，采用不同的分离类型；每种机理的选择性不同；每种机理的选择性不同；每种机理的选择性不同；每种机理的选择性不同；2023/1/102023/1/10一、毛细管区带电泳一、毛细管区带电泳capillary zone electrophoresis，CZE 带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。电泳和电渗流速度的矢量和。电泳和电渗流速度的矢量和。电泳和电渗流速度的矢量和。正离子正离子正离子正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；：两种效应

4、的运动方向一致，在负极最先流出；：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子中性粒子中性粒子中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；出；出；出；阴离子阴离子阴离子阴离子：两种效应的运动方向：两种效应的运动方向：两种效应的运动方向：两种效应的运动方向相反；相反；相反；相反；电渗流电渗流电渗流电渗流 电泳电泳电泳电泳时时时时,阴离子在阴离子在阴离子在阴离子在负极最后流出负极最后流出负极最后流出负极最后流出,在这种情况下在

5、这种情况下在这种情况下在这种情况下,不但不但不但不但可以按类分离可以按类分离可以按类分离可以按类分离,同种类离子由于同种类离子由于同种类离子由于同种类离子由于差差差差速迁移速迁移速迁移速迁移被相互分离。被相互分离。被相互分离。被相互分离。最基本、应用广的分离模式；最基本、应用广的分离模式；最基本、应用广的分离模式；最基本、应用广的分离模式；2023/1/102023/1/10二、毛细管凝胶电泳二、毛细管凝胶电泳 capillary gel electrophoresis，CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝

6、胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、蛋白质、蛋白质、蛋白质、DNADNADNADNA等的电荷等的电荷等的电荷等的电荷/质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，

7、质量比与分子大小无关，CZECZECZECZE模模模模式很难分离，采用式很难分离，采用式很难分离，采用式很难分离，采用CGECGECGECGE能获得良好分离，能获得良好分离，能获得良好分离，能获得良好分离，DANDANDANDAN排序的重要手段。排序的重要手段。排序的重要手段。排序的重要手段。特点特点特点特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。：抗对流性好，散热性好，分离度极高。：抗对流性好，散热性好，分离度极高。：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术无胶筛分技术无胶筛分技术无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘：采用低粘度的线性聚合物溶

8、液代替高粘：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。2023/1/102023/1/10 1.1.1.1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。三、三、胶束电动毛细

9、管色谱胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC 在电场力的作在电场力的作在电场力的作在电场力的作用下，胶束在柱中用下，胶束在柱中用下，胶束在柱中用下，胶束在柱中移动。移动。移动。移动。2023/1/102023/1/10 2.2.2.2.电泳流和电渗流的方向相反，且电泳流和电渗流的方向相反，且电泳流和电渗流的方向相反，且电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流电渗流电渗流电渗流 电泳电泳电泳电泳 ，负电胶束以较慢的速度向负极移动；负电胶束以较慢的速度向负极移动；负电胶束以较慢的速度向负极移动；负

10、电胶束以较慢的速度向负极移动；5.5.5.5.色谱与电泳分离模式色谱与电泳分离模式色谱与电泳分离模式色谱与电泳分离模式的结合。的结合。的结合。的结合。3.3.3.3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.4.4.4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应

11、用可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围范围范围范围；2023/1/102023/1/10 1.1.1.1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.2.2.2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流

12、电压（围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6 6 6 68 8 8 8V V V V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pHpHpHpH梯度；梯度；梯度；梯度；3.3.3.3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pHpHpHpH有关，有关，有关，有关

13、，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；电中性，淌度为零；电中性，淌度为零；电中性，淌度为零；四、毛细管等电聚焦四、毛细管等电聚焦 capillary isoelectric focusing，CIEF2023/1/102023/1/10 4.4.4.4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下聚焦：具有不同等电

14、点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点迁移，分别到达满足其等电点迁移，分别到达满足其等电点迁移，分别到达满足其等电点pHpHpHpH的位置时，呈电中性，停止的位置时，呈电中性，停止的位置时，呈电中性，停止的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；移动，形成窄溶质带而相互分离；移动，形成窄溶质带而相互分离；移动，形成窄溶质带而相互分离；5.5.5.5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOHNaOHNaOHNaOH溶液；溶液；溶液；溶液；6.6.6.6.加压将毛细管内分离后的溶液推

15、出经过检测器检测；加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.7.7.7.电渗流在电渗流在电渗流在电渗流在CIEFCIEFCIEFCIEF中不利，应消除或减小。中不利，应消除或减小。中不利，应消除或减小。中不利，应消除或减小。2023/1/102023/1/10 1.1.1.1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满充满充满充满毛细管毛细管毛细管毛细管)和尾随离子

16、，试样离子的淌度全部位于两者之间，和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。并以同一速度移动。并以同一速度移动。并以同一速度移动。2.2.2.2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐离子的

17、。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。五、毛细管等速电泳五、毛细管等速电泳 capillary isotachophoresis，CITP2023/1/102023/1/10 3.3.3.3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=EEEE)，淌度大的离子区带

18、电场强度小；淌度大的离子区带电场强度小；淌度大的离子区带电场强度小；淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序沿出口到进口，将不同区带依次排序沿出口到进口，将不同区带依次排序沿出口到进口，将不同区带依次排序1 1 1 1、2 2 2 2、3 3 3 3、4 4 4 4 电场强度依次增大。假设电场强度依次增大。假设电场强度依次增大。假设电场强度依次增大。假设“2”“2”“2”“2”号中离子扩散到号中离子扩散到号中离子扩散到号中离子扩散到“3”“3”“3”“3”号，号，号，号，该区电场强度大，离子被加速，返回到该区电场强度大，离子被加速，返回到该区电场强度大，离子被加速，返回到该

19、区电场强度大，离子被加速，返回到“2”“2”“2”“2”区；当区；当区；当区；当“2”“2”“2”“2”号号号号中离子跑到中离子跑到中离子跑到中离子跑到“1”“1”“1”“1”号区，离子被减速使之归队；号区，离子被减速使之归队；号区，离子被减速使之归队；号区，离子被减速使之归队；4.4.4.4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；特点：界面明显，富集、浓缩作用；特点：界面明显，富集、浓缩作用；特点：界面明显，富集、浓缩作用；capillary isotachophoresis，CITP2023/1/102023/1/10 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电在毛细管壁上键合或涂渍高效液

20、相色谱的固定液，以电在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；色谱过程；色谱过程；色谱过程；六、毛细管电渗色谱六、毛细管电渗色谱 capillary electroosmostic chromatography，CEC2023/1/102023/1/10请选择内容请选择内容第一节第一节第一节第一节 概述概述概述概述genera

21、lizationgeneralization第二节第二节第二节第二节 高效毛细管电泳的理论基础高效毛细管电泳的理论基础高效毛细管电泳的理论基础高效毛细管电泳的理论基础basic theory of HPCEbasic theory of HPCE第三节第三节第三节第三节 高效毛细管电泳仪器高效毛细管电泳仪器高效毛细管电泳仪器高效毛细管电泳仪器high performance capillary electrophoresis high performance capillary electrophoresis apparatusapparatus第四节第四节第四节第四节 高效毛细管电泳的分离模式高效毛细管电泳的分离模式高效毛细管电泳的分离模式高效毛细管电泳的分离模式separate types of HPCEseparate types of HPCE第五节第五节第五节第五节 应用与进展应用与进展应用与进展应用与进展application and advances of HPCEapplication and advances of HPCE结束结束结束结束2023/1/102023/1/10