第2章-沉淀分离法课件.ppt

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1、本科课程本科课程第第 2 章章 沉淀分离法一、概述一、概述 二、分类二、分类 三、常用的沉淀分离方法及试剂三、常用的沉淀分离方法及试剂沉淀分离沉淀分离法法 (Separation by precipitation)沉淀分离沉淀分离法法是在溶液中加入溶剂或沉淀剂是在溶液中加入溶剂或沉淀剂,通过通过化学反应或者改变溶液的化学反应或者改变溶液的pH值、温度、压力等条值、温度、压力等条件件,使分离物以固相物质形式沉淀析出的一种方使分离物以固相物质形式沉淀析出的一种方法。法。能否将分离物从溶液中析出能否将分离物从溶液中析出,取决于分离物的取决于分离物的溶溶解度或溶度积解度或溶度积,关键在于选择适当的沉淀

2、剂和控关键在于选择适当的沉淀剂和控制条件制条件,沉淀的目的在于通过沉淀使目标成分达沉淀的目的在于通过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质到浓缩和去杂质,或是将已纯化的产品由液态变或是将已纯化的产品由液态变成固态。成固态。一、概一、概 述述 沉沉淀淀法法是是最最古古老老、经经典典的的化化学学分分离离方方法法。虽虽然然，沉沉淀淀分分离离需需经经过过过过滤滤、洗洗涤涤等等手手续续，操操作作较较繁繁琐琐费费时时；某某些些组组分分的的沉沉淀淀分分离离选选择择性性较较差差，分分离离不不完完全全。但但由由于于应应用用范范围围广广、不不需需特特殊殊设设备备，沉淀分离法仍然是一种常用的分离方法。沉淀分离法仍然是一种常

3、用的分离方法。2、沉淀分离方法特点、沉淀分离方法特点 沉沉淀淀的的方方法法和和技技术术应应具具有有一一定定的的选选择择性性,才才能使目标成分得到较好分离能使目标成分得到较好分离,纯度较高纯度较高；对于一些活性物质对于一些活性物质(如酶、蛋白质等如酶、蛋白质等)的沉淀的沉淀分离分离,必须考虑沉淀方法对目标成分的活性和化必须考虑沉淀方法对目标成分的活性和化学结构是否破坏学结构是否破坏；对于食品和医药中的目标成分的沉淀分离对于食品和医药中的目标成分的沉淀分离,必须充分估量残留物对人体的危害必须充分估量残留物对人体的危害.在应用沉淀分离技术时在应用沉淀分离技术时,需要考虑三种因素需要考虑三种因素 沉淀

4、分离法分为：沉淀分离法沉淀分离法和共沉淀分离法共沉淀分离法。两种方法的区别主要是：沉淀分离法主要使用于常量组分的分离（毫克数量级以上);共沉淀分离法主要使用于痕量组分的分离(小于1mg/mL).根据分离的对象不同，沉淀分离的方法和技术也有较大差异。因此，分为无机离子及化合物的分离无机离子及化合物的分离和有机及有机及生物化合物的分离生物化合物的分离两大类讨论。二、沉淀分离法的分类二、沉淀分离法的分类三、常用的沉淀分离方法及试剂三、常用的沉淀分离方法及试剂（一）无机离子及化合物的分离（一）无机离子及化合物的分离 1.氢氧化物沉淀分离氢氧化物沉淀分离 2.硫化物沉淀分离硫化物沉淀分离 3.共沉淀分离

5、法共沉淀分离法 4.常用无机沉淀剂常用无机沉淀剂 5.常用有机沉淀剂常用有机沉淀剂 6.常用无机共沉淀剂常用无机共沉淀剂 7.常用有机共沉淀剂常用有机共沉淀剂 氢氧化物沉淀分离氢氧化物沉淀分离 a.a.几种主要的沉淀剂及特点几种主要的沉淀剂及特点 (1)NaOH溶溶液液 可可使使两两性性的的氢氢氧氧化化物物溶溶解解而而于于其其他他氢氢氧氧化化物物沉沉 淀分离。淀分离。(2)氨氨水水加加铵铵盐盐氨氨水水加加铵铵盐盐组组成成的的pH值值为为810，使使高高价价离离子子沉沉淀淀而而于于一一、二二价价的的金金属属离离子子分分离离；另另一一方方面面Ag+,Cu2+,Co2+,Ni2+等离子因形成氨络离子

6、留于溶液中。等离子因形成氨络离子留于溶液中。(3)ZnO悬悬浊浊液液ZnO为为一一难难溶溶碱碱，用用水水调调成成悬悬浊浊液液，可可在在氢氢氧氧化物沉淀分离中用作沉淀剂。化物沉淀分离中用作沉淀剂。(4)有有机机碱碱六六亚亚甲甲基基四四胺胺、吡吡啶啶、苯苯胺胺、苯苯肼肼等等有有机机碱碱，与与其其共共轭轭酸酸组组成成缓缓冲冲溶溶液液，可可控控制制溶溶液液的的pH，使使某某些些金金属属离离子子生生成成氢氢氧化物沉淀，达到沉淀分离的目的。氧化物沉淀，达到沉淀分离的目的。氢氧化物沉淀分离氢氧化物沉淀分离 1.金金属属氢氢氧氧化化物物沉沉淀淀的的溶溶度度积积相相差差很很大大，通通过过控控制制酸酸度度使使某某

7、 些金属离子相互分离。些金属离子相互分离。2.氢氧化物沉淀为胶体沉淀，共沉淀严重，影响分离效果。氢氧化物沉淀为胶体沉淀，共沉淀严重，影响分离效果。（1）采采用用“小小体体积积”沉沉淀淀法法小体积、大浓度且有大量对测定没有干扰的盐存在下进行沉淀。如：在大量NaCl存在下，NaOH分离Al3+与Fe3+。（2）控控制制pH值值选选择择合合适适的的沉沉淀淀剂剂：不同金属形成氢氧化物的pH值、及介质不同。（3）采用均均匀匀沉沉淀淀法法或在较热、浓溶液中沉淀并且热溶液洗涤消除共沉淀。（4）加入掩蔽剂掩蔽剂提高分离选择性b.氢氧化物沉淀分离的特点：氢氧化物沉淀分离的特点：c.c.影响金属氢氧化物沉淀影响金

8、属氢氧化物沉淀pHpH值的因素值的因素（1 1）金属离子浓度：金属离子浓度：浓度越低，浓度越低，pHpH值就越高；值就越高；图图2.3 2.3 金属离子浓度对数图金属离子浓度对数图pM（2 2）离子的本性：阳离子电荷越多，半径越小）离子的本性：阳离子电荷越多，半径越小则极化作用越强，沉淀所需则极化作用越强，沉淀所需pHpH值较低；值较低；（3 3）同一周期，自左向右，阳离子电荷增加，）同一周期，自左向右，阳离子电荷增加，极化作用增强，与极化作用增强，与OHOH-结合逐渐牢固，则阳离子结合逐渐牢固，则阳离子沉淀时的沉淀时的pHpH值就逐渐降低。值就逐渐降低。例如：Mg2+沉淀时的pH值为10.5

9、，而Al3+则pH=4.2（4 4）不同价态金属离子生成氢氧化物或水合氧）不同价态金属离子生成氢氧化物或水合氧化物不同。化物不同。c.影响金属氢氧化物沉淀影响金属氢氧化物沉淀pH值的因素值的因素原原 理理 能形成难溶硫化物沉淀的金属离子约有40余种，除碱金属和碱土金属的硫化物能溶于水外，重金属离子个分别在不同的酸度下形成硫化物沉淀。因此在某些情况下，利用硫化物进行沉淀分离还是有效的。硫化物沉淀分离法所用的主要沉淀剂是H2S。H2S是二元弱酸，溶液中的S2-与溶液的酸度有关，随着H+的增加，S2-迅速的降低。因此，控制溶液的pH值，即可控制S2-，使不同溶解度的硫化物得以分离。2、硫化物沉淀分离

10、、硫化物沉淀分离 沉淀剂：沉淀剂：H2S 约约40余种金属离子可生成难溶硫化物沉淀；余种金属离子可生成难溶硫化物沉淀；各种金属硫化物沉淀的溶解度相差较大；各种金属硫化物沉淀的溶解度相差较大；根根据据H2S的的分分布布曲曲线线，溶溶液液中中S2-的的浓浓度度与与pH有有关，控制溶液关，控制溶液pH 可控制分步沉淀。可控制分步沉淀。H2S 有毒，气味难闻；选择性差。有毒，气味难闻；选择性差。（1）硫硫化化物物的的溶溶度度积积相相差差比比较较大大的的，通通过过控控制制溶溶液液的的酸酸度度来来控控制制硫硫离子浓度，而使金属离子相互分离。离子浓度，而使金属离子相互分离。（2）硫化物沉淀分离的选择性不高。

11、）硫化物沉淀分离的选择性不高。（3）硫硫化化物物沉沉淀淀大大多多是是胶胶体体，共共沉沉淀淀现现象象比比较较严严重重，甚甚至至还还存存在在继继沉沉淀淀现现象象。可可以以采采用用硫硫代代乙乙酰酰胺胺在在酸酸性性或或碱碱性性溶溶液液中中水水解解进进行行均均相相沉沉淀。淀。在酸性溶液中：在酸性溶液中：CH3CSNH2+2H2O+H+=CH3COOH+H2S+NH4+在碱性溶液中：在碱性溶液中：CH3CSNH2+3OH-=CH3COO-+S2-+NH3+H2O（4）适用于分离除去重金属（如）适用于分离除去重金属（如Pb2+）2、硫化物沉淀分离的特点、硫化物沉淀分离的特点（二）有机试剂沉淀分离法 特点：特

12、点：高选择性、高灵敏度；应用普遍；高选择性、高灵敏度；应用普遍；有机沉淀剂与金属离子生成的三种沉淀类型：有机沉淀剂与金属离子生成的三种沉淀类型：1.螯合物沉淀螯合物沉淀 8-羟基喹啉与羟基喹啉与Mg2+生成六元环结构的螯合物沉淀；生成六元环结构的螯合物沉淀；在在氨氨缓缓冲冲溶溶液液中中，可可实实现现镁镁与与碱碱金金属属及及碱碱土土金金属属的的分分离；离；2.缔合物沉淀缔合物沉淀 痕量痕量Zn2+的共沉淀；的共沉淀；3.三元化合物三元化合物 提高选择性和灵敏度的一条途径；提高选择性和灵敏度的一条途径；a 定定义义：共沉淀分离法就是加入某种离子同沉淀剂生成沉淀作为载体（沉淀剂，将痕量组分定量地沉淀

13、下来，然后将沉淀分离（溶解在少量溶剂中、灼烧等方法），以达到分离和富集的目的的一种分析方法。b 沉淀剂要求沉淀剂要求 （1）要求对欲富集的痕量组分回收率高。（2）要求共沉淀剂不干扰待富集组分的测定。四、共沉淀分离法四、共沉淀分离法1 1、常用无机共沉淀剂、常用无机共沉淀剂无机共沉淀剂1、吸附共沉淀剂 吸附是在沉淀表面吸附和沉淀有共同离子的盐。Fe(OH)3:金属Cu中分离微量的Al PbS:富集微量的Cu2+2、混晶共沉淀剂 两种化合物的晶型相同，离子半径相差在10%-15%以内产生混晶。钢中的铍，可以利用BaSO4形成混晶富集。SrSO4生成混晶以富集食物中的痕量Pb2+，Fe3+、Cd2+

14、、Co2+等离子不干扰。（选择性好）3、形成晶核的共沉淀剂（极微量离子）4、沉淀的转化作用（溶液中微量的Cu2+，CdS滤纸)2 2、常用有机共沉淀剂、常用有机共沉淀剂 有机及生物化合物的分离有机及生物化合物的分离1.溶剂沉淀 2.盐析沉淀3.沉淀剂沉淀 溶剂沉淀溶剂沉淀 在有机化合物在有机化合物(如蛋白质、酶、多糖、核酸等如蛋白质、酶、多糖、核酸等)水溶液中加入水溶液中加入有机溶剂有机溶剂(如乙醇、丙如乙醇、丙酮酮等等)后后,显著降低待分离物质的溶解度从而显著降低待分离物质的溶解度从而将其沉淀析出的一种方法。将其沉淀析出的一种方法。机机 理理 在于溶质在于溶质(待分离物质待分离物质)在溶液中

15、化学势发生变化造成溶解度的下在溶液中化学势发生变化造成溶解度的下降。降。优优 点点 在于选择性好、分辨率高在于选择性好、分辨率高,因为一种有机化合物往往只能在某一因为一种有机化合物往往只能在某一溶剂狭窄的浓度范围内沉淀溶剂狭窄的浓度范围内沉淀,溶剂易除去易回收溶剂易除去易回收,但条件控制不当容但条件控制不当容易使待分离物质易使待分离物质(如蛋白质如蛋白质)变性变性。1、溶剂沉淀溶剂沉淀 选择合适的溶剂是溶剂沉淀的关键,溶剂必须是能与水相混溶的有机溶剂,如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙醚、石油醚、二甲基亚砜、己烷、四氢呋喃等。其中乙醇最为常用,能沉淀蛋白质、核酸、核苷酸、多糖、果胶和氨

16、基酸等化合物,且安全性最高。同时,不同的有机化合物沉淀所需要的溶剂浓度有不同要求,使用不同浓度的同一种溶剂,往往可以在混合溶液中起到分级沉淀的效果。1).溶剂的选择及其添加量溶剂的选择及其添加量 对于蛋白质样品溶液的沉淀分离,如果样品浓度低一些,可以减少蛋白质之间的相互作用,防止共沉淀现象,但易引起蛋白变性,另一方面,如果样品浓度高一些,可以减少蛋白变性,有机溶剂的使用量也可减少,但控制不当易出现共沉淀现象,一般而言,控制蛋白质起始浓度为5-0mg/mL。2).样品浓度的确定样品浓度的确定 对蛋白质溶液进行溶剂沉淀分离对蛋白质溶液进行溶剂沉淀分离,一般在低温条一般在低温条件下进行件下进行,大多

17、数酶和蛋白质的溶解度随温度降低而大多数酶和蛋白质的溶解度随温度降低而降低降低,可以利用温度差进行蛋白质分级沉淀。如果温可以利用温度差进行蛋白质分级沉淀。如果温度过高度过高,促使蛋白质的分子结构松散促使蛋白质的分子结构松散,使得溶剂分子使得溶剂分子与一些氨基酸残基产生疏水性结合而引起蛋白质的不与一些氨基酸残基产生疏水性结合而引起蛋白质的不可逆变性。可逆变性。3).温度的调节温度的调节 蛋白质溶液中的溶质溶解度受蛋白质溶液中的溶质溶解度受pH值影响值影响,一般一般在等电点的溶解度最低在等电点的溶解度最低,将将pH值调节到溶液中多数值调节到溶液中多数蛋白质带有相同的净电荷蛋白质带有相同的净电荷,可减

18、少蛋白质之间的相可减少蛋白质之间的相互作用互作用,防止共沉淀。利用改变溶液的防止共沉淀。利用改变溶液的pH值可实现值可实现有选择的分段沉淀有选择的分段沉淀,另外另外,pH值与离子强度有协同值与离子强度有协同作用作用 而改变蛋白质的溶解度。而改变蛋白质的溶解度。4).pH 值的调节值的调节 低浓度的中性盐类增加蛋白质在有机溶剂低浓度的中性盐类增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度中的溶解度,并且对蛋白质具有保护作用并且对蛋白质具有保护作用,防止防止变性。要将蛋白质从低离子强度的溶液中沉淀变性。要将蛋白质从低离子强度的溶液中沉淀出来往往需要更高的溶剂浓度。出来往往需要更高的溶剂浓度。5).离子强度的调节离

19、子强度的调节 在较低浓度的盐溶液中在较低浓度的盐溶液中,酶和蛋白质的溶解度随盐酶和蛋白质的溶解度随盐浓度升高而增大浓度升高而增大,这称之为这称之为盐溶盐溶;当盐浓度增大至一当盐浓度增大至一定程度后定程度后,酶和蛋白质的溶解度又开始下降直至沉淀酶和蛋白质的溶解度又开始下降直至沉淀析出析出,这称之为这称之为盐析盐析。原理原理在于中性盐离子对蛋白质分子表面活性基团在于中性盐离子对蛋白质分子表面活性基团及水活度的影响结果。及水活度的影响结果。2.盐析沉淀盐析沉淀蛋白质分子的表面特性 蛋白质是两性高分子电解质，蛋白质是两性高分子电解质，由疏水性不同的由疏水性不同的2020多种氨基酸组多种氨基酸组成。成。

20、在水溶液中，多肽链中的疏在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基分的趋势，使亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面。布在蛋白质立体结构的外表面。但是，仍有部分疏水性氨基酸残但是，仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成硫水区。基暴露在外表面，形成硫水区。因此，蛋白质表面由不均匀分布因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水的荷电基团形成的荷电区、亲水区和硫水区构成。区和硫水区构成。产生产生“盐析盐析”（Salting out）的原因的原因n盐离子与蛋白质表面具有相反电性的离盐离子与蛋白质表面具有相反电性的离

21、子基团结合，形成离子对，使其分子之子基团结合，形成离子对，使其分子之间电排斥作用减弱而相互聚集，靠拢。间电排斥作用减弱而相互聚集，靠拢。n中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去水化膜，水中发生水化而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区，由于疏水区的相互作用，暴露出疏水区，由于疏水区的相互作用，使其沉淀。使其沉淀。纯一单蛋白质有公式：纯一单蛋白质有公式：lg S=kSI S为蛋白质溶解度（为蛋白质溶解度（g/L）；）；为为I=0时时lg S，它取决于溶质的性质；，它取决于溶质的性质；kS为盐析常数，主要决定于加入盐的性为盐析常数，主要决定于加入

22、盐的性质及质及Pr性质。性质。I为盐离子强度（为盐离子强度（mol/L）盐析的讨论盐析的讨论n.单一纯蛋白质的盐析单一纯蛋白质的盐析 1 在一定的在一定的pH和温度下，改变离子强度和温度下，改变离子强度 kS盐析法盐析法 盐、盐、Pr一定，一定，kS值一定，值一定，I则则 S 2在一定的离子强度下，改变在一定的离子强度下，改变pH和温度和温度盐析法盐析法 pH：在：在Pr 的的pI时其溶解度较小时其溶解度较小 温度：在保证温度：在保证Pr不变性下，温度不变性下，温度 利于盐析。利于盐析。3原始浓度原始浓度P P小盐析所需小盐析所需I高，高，P大盐析所需大盐析所需I低低 对混合对混合Pr的盐析，

23、的盐析，P大，会发生严重共沉作大，会发生严重共沉作用，一般控制浓度为用，一般控制浓度为 2.5-3%。.混合混合Pr的盐析的盐析1合适盐析范围的选择：不同合适盐析范围的选择：不同Pr盐析峰有盐析峰有重叠，须权衡纯度回收率。重叠，须权衡纯度回收率。2改变原始浓度：改变原始浓度：一种蛋白质的不同浓一种蛋白质的不同浓度的沉淀曲线会变化。度的沉淀曲线会变化。3二次盐析：在原盐浓度下二次盐析，可二次盐析：在原盐浓度下二次盐析，可除去易溶杂质，但不能除去难溶杂质。除去易溶杂质，但不能除去难溶杂质。盐析操作要点盐析操作要点n1盐的种类及选择盐的种类及选择 可使用的中性盐有：可使用的中性盐有：(NH4)2SO

24、4、Na2SO4、MgSO4、NaCl NaAc、Na3PO4 柠檬酸钠和柠檬酸钠和 硫氰化钾等，硫氰化钾等，(NH4)2SO4、Na2SO4最广泛，前者最受欢迎最广泛，前者最受欢迎n2盐析范围的确定盐析范围的确定 可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得。（从回收可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得。（从回收率和纯度考虑）率和纯度考虑）n3盐的加入方式盐的加入方式 固体固体 缓慢加，防泡沫，要平衡。缓慢加，防泡沫，要平衡。液体（饱和盐溶液）液体（饱和盐溶液）要求盐析范围小于要求盐析范围小于50%饱和度取一份小饱和度取一份小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围样分段盐析，从回收率和纯度

25、考虑来确定范围n4.Pr的原始浓度的原始浓度 太稀的蛋白质溶液，不仅消耗大量中性盐，对太稀的蛋白质溶液，不仅消耗大量中性盐，对Pr回收也有回收也有影响；高浓度可节约盐用量，但须适中，以避免共沉。影响；高浓度可节约盐用量，但须适中，以避免共沉。盐析操作的其他方法盐析操作的其他方法n1透析盐析透析盐析 将将Pr溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性变化，使变化，使Pr 2反抽提法（反抽提法（Back-Extraction）将包括要分离的将包括要分离的Pr在内的多种在内的多种Pr一起沉淀

26、出来，一起沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物。物。影响盐析的因素影响盐析的因素1.溶质（蛋白质等）种类溶质（蛋白质等）种类 不同溶质的不同溶质的kS和和均不相同，所需的离子强度也不同。均不相同，所需的离子强度也不同。2.溶质（蛋白质等）浓度溶质（蛋白质等）浓度 蛋白质浓度大时，中性盐的极限沉淀浓度低，共沉作用强，蛋白质浓度大时，中性盐的极限沉淀浓度低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量少，蛋白质溶解损失小；分辨率低，但用盐量少，蛋白质溶解损失小；蛋白质浓度较小时，情况相反。一般蛋白质浓度控制在蛋白质浓度较小时，情况相反。一般蛋白质浓度控制在

27、2-3为宜为宜3.pH 等电点附近，用盐量少，蛋白质收率高。等电点附近，用盐量少，蛋白质收率高。4.温度温度 温度升高，溶解度升高；多数蛋白质在高盐浓度下，其溶解度温度升高，溶解度升高；多数蛋白质在高盐浓度下，其溶解度反而下降，胃蛋白酶，大豆球蛋白例外。反而下降，胃蛋白酶，大豆球蛋白例外。1.在固定蛋白质溶液的在固定蛋白质溶液的 pH 值与温度的前提下值与温度的前提下,添加盐来调节添加盐来调节溶液离子强度以达到沉淀蛋白质的目的。此法常用于蛋白质粗溶液离子强度以达到沉淀蛋白质的目的。此法常用于蛋白质粗制品的分级沉淀和酶制剂的制备等。制品的分级沉淀和酶制剂的制备等。2.在一定的离子强度下在一定的离

28、子强度下,调节溶液的调节溶液的pH值或温度以达到沉淀蛋值或温度以达到沉淀蛋白质的目的白质的目的,此法适用于蛋白质的提纯精制以及饱和结晶等。此法适用于蛋白质的提纯精制以及饱和结晶等。影响盐析效果的因素有蛋白质的浓度影响盐析效果的因素有蛋白质的浓度、盐类、离子类型、离盐类、离子类型、离子浓度、子浓度、pH 值、温度等值、温度等.蛋白质类化合物的盐析沉淀手段通常有两种蛋白质类化合物的盐析沉淀手段通常有两种:盐析沉淀条件中,中性盐的合理选择至关重要,根据离子促变序列,多多价价盐盐类类的的盐盐析析效效果果比比单单价价的的效效果果好好,阴阴离离子子的的效效果果比比阳阳离离子子的的好好。顺顺序序大大致致如如

29、下下:柠柠檬檬酸酸根根 酒酒石石酸酸根根 PO43-F-I03-SO42-醋醋酸酸根根 B2O3-Cl-Cl03-Br-N03-ClO4-I-SCN-；Th4+A13+H+Ba2+Sr2+Ca2+；Mg2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+。在蛋白质溶液中,一般以硫酸铵、硫酸钠应用最广,选择中性 盐时注意添加盐的纯度,避免杂质带来干扰或对蛋白质的毒害。使 用带金属离子的盐类时,可考虑添加一定量的金属整合剂如 EDTA 等。蛋白质或酶等物质经盐析沉淀分离后,产品夹带盐分,需脱盐处理。常用的脱盐处理方法有透析法、超滤法、电渗析法和葡聚糖凝胶过滤法等。添加某种化合物与溶液中的待分离物质生成难溶性的

30、复合物，从而从溶液中沉淀析出的方法,称为沉淀剂沉淀。添加的化合物称为沉淀剂。沉淀剂沉淀分离主要有金属离子沉淀法,酸类及阴离子沉淀法,非离子型聚合物沉淀法以及均相沉淀法等。3.沉淀剂沉淀沉淀剂沉淀 蛋白质在碱性溶液中带负电蛋白质在碱性溶液中带负电,金属离子与蛋白质中的金属离子与蛋白质中的-COOH、-OH、-NH2、-SH 等基团反应生成难溶性的复合盐等基团反应生成难溶性的复合盐 而析出而析出。根据金属离子与蛋白质的相互作用关系根据金属离子与蛋白质的相互作用关系,将金属离子分成将金属离子分成 以以下三类。下三类。(1)与与羧羧基基、氨氨基基等等含含氮氮化化合合物物以以及及含含氮氮杂杂环环化化合合

31、物物强强烈烈结结合合的的金金属属离离子子有有：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+和和Cd2+等。等。(2)与与羧羧酸酸结结合合而而不不与与含含氮氮化化合合物物结结合合的的金金属属离离子子有有:Ca2+、Mg2+、Pb2+和和 Ba2+等。等。(3)与与巯巯基化合物强烈结合的金属离子有基化合物强烈结合的金属离子有:Hg+、Ag+和和Pb2+等。等。1).金属离子沉淀法金属离子沉淀法 金属离子沉淀分离效果除与金属离子沉淀分离效果除与金属离子的种类金属离子的种类、蛋白质的性质、蛋白质的性质、离子化程离子化程度以及相互结合的位置度以及相互结合的位置等因素有关等因素有关,沉淀的复

32、合物的溶解度与溶液的介电常数沉淀的复合物的溶解度与溶液的介电常数相关相关,介电常数减小则溶解度降低。一般而言介电常数减小则溶解度降低。一般而言,金属离子浓度调节在金属离子浓度调节在 0.02mol/L 左右。浓度过高左右。浓度过高,易引起共沉淀易引起共沉淀,并且产生的静电力可能影响蛋白质的二、三、并且产生的静电力可能影响蛋白质的二、三、四级空间结构四级空间结构,引起蛋白质变性。复合物中金属离子的去除引起蛋白质变性。复合物中金属离子的去除,可通人可通人H2S形形 成成硫化物去除或添加硫化物去除或添加鳌鳌合剂合剂 EDTA。金属离子沉淀法常有共沉淀现象和吸附作用金属离子沉淀法常有共沉淀现象和吸附作

33、用,同时有一些金属同时有一些金属 盐的溶解度盐的溶解度相对也比较大相对也比较大,因此分离效果受到影响因此分离效果受到影响,实践中一般用实践中一般用 作初步分离作初步分离,并且通常并且通常是与其他分离方法配合使用。是与其他分离方法配合使用。一些含氮的有机酸如苦酸、苦酮酸和鞣酸等能与有机分子的碱性基团反应生成难溶性的盐复合物析出,但这种盐复合物沉淀往往是属于不可逆反应,引起蛋白质发生变性,因此,需要采取预防蛋白质变性的措施,如采用温和的反应条件,并加入一定量的稳定剂(如抗坏血酸等)。许多元机杂多酸能与氨基酸、蛋白质作用形成盐类复合物沉淀,如磷钨酸、砷钨酸、硼钨酸、硅钨酸以及磷、砷、硼、硅的钼酸或钒

34、酸等。反应过量的这些无机杂多酸可在无机盐溶液中由乙醚萃取出来。2).酸沉淀法酸沉淀法 一些非离子型多聚物(如聚乙二醇、壬苯乙烯化氧、葡聚糖和右旋糖酐硫酸钠等)作为沉淀剂,能将溶液的一些有机物质沉淀分离出来,如蛋白质、酶、核酸、细菌、病毒等3).非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法 非离子型聚合物沉淀法操作条件温和,不易引起生物分子的变性,少量的沉淀剂就能沉淀大量的生物大分子物质,并且沉淀后的多聚物容易除去。聚乙二醇(PEG)是应用较多的水溶性的非离子型多聚物,多用于沉淀蛋白质,其沉淀效果除与溶液的离子强度、pH值、温度及蛋白质浓度等因素有关之外,还与沉淀剂本身的分子量及浓度有关,一般而言,

35、聚乙二醇浓度与溶液的离子强度成反比。当pH值越接近蛋白质等电点,所需 PEG浓度也越低。同时在一定范围内,PEG的相对分子质量越大沉淀效果越好。非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物沉淀法的特点的特点 直接将沉淀剂加入溶液中,容易出现局部浓度过度,产生的沉淀物过于细小或者结构疏松,均匀不一,易吸附杂质影响纯度,而 借助于化学反应使溶液中缓慢而均匀地产生沉淀剂以获得较纯净的晶形或非晶形沉淀,这就是均相沉淀法。4.均相沉淀法均相沉淀法影响沉淀类型和性状的因素1.定向速率：沉淀物质本性决定2.聚集速率：决定于沉淀的相对过饱和度Q:加入沉淀剂瞬间生成沉淀的浓度S:沉淀的溶解度K：比例常数实现均相沉淀实现均

36、相沉淀的的手段手段(1)在溶液中加入能产生沉淀剂的化学试剂,使得通过化学反应均匀产生出沉淀剂。(2)利用某种试剂的水解反应使溶液的pH值发生变化,使pH 值达到一定值时就会生成沉淀。(3)将溶液与沉淀剂在某种能与水混溶的溶剂中混合,再缓慢蒸去溶剂,使之在缓冲条件下实现均相沉淀。(4)破坏可溶性络合物。等电点沉淀分离法主要是利用两性电解质分子在电中性时溶解 度最低,不同的两性电解质具有不同的等电点而进行分离的一种方法。如蛋白质、酶以及氨基酸等两性电解质,当其整体电荷为中性时,溶解度最小,控制不同的等电点,就能将不同的电解质分离。5.等电点沉淀分离法等电点沉淀分离法 变性沉淀是利用生物大分子(如蛋

37、白质)在变性后溶解度降低而从溶液中沉淀析出,当然轻度变性的蛋白质不一定沉淀出来,变性后蛋白质能恢复原来结构与功能的过程称为可逆变性,反之称为不可逆变性。引起蛋白质变性的因素包括温度、pH 值以及其他的化学因素,能引起蛋白质变性的化学试剂有甲酸、乙酸、二氯乙 酸、三氯乙酸等酸类;甲醇、乙醇、甘油等醇类；甲酰胺、N-甲基乙酰胺等酰胺类;以及二脲、盐酸胍、氯仿、酚等,还有表面活 性剂如十二烷基磺酸钠(SDS)等,另外,一些酶也会使蛋白质变性。6.变性沉淀变性沉淀法法 絮凝沉淀是在悬浮或胶体溶液中加入絮凝剂,使之与胶体或悬浮液中的微粒产生絮状物沉淀,有无机絮凝剂和有机絮凝剂之分。无机絮凝剂常用的有铝盐(如明矶、三氯化铝、硫酸铝、聚合氯化铝),铁盐(如三氯化铁、硫酸亚铁、聚合硫酸铁等),有机絮凝剂都是高分子化合物,如聚丙烯酰胺(PAM)等。7.絮凝沉淀絮凝沉淀法法