酶微生物生产工艺课件.ppt

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1、酶微生物生产工艺27微生物酶制剂生产工艺酶微生物生产工艺27.1 酶生产概论酶生产概论一、酶的定义和分类一、酶的定义和分类二、酶的特性二、酶的特性三、酶的来源三、酶的来源四、酶的生产菌种四、酶的生产菌种五、产酶菌株的制备和优化五、产酶菌株的制备和优化酶微生物生产工艺27.1.1 酶的定义和分类酶的定义和分类酶的定义-酶是生物体内具有特殊催化功能的蛋白质。酶的分类-分为6大类1、氧化-还原酶2、转移酶3、水解酶4、裂合酶5、异构酶6、连接酶（合成酶）酶微生物生产工艺27.1.2微生物酶工业的发展概况早期应用：制曲酿酒1894年，用米曲生产淀粉酶作为消化药二次世界大战后，深层培养技术成功，酶工业快

2、速发展：1949年深层发酵生产淀粉酶日本二十世纪50年代，糖化酶用于葡萄糖生产，60年代，碱性蛋白酶应用于加酶洗衣粉70年代后，酶固定化技术发展，固定酰化酶用于氨基酸拆分，固定葡萄糖异构酶用于高果糖浆生产，近年来有开发了青霉素酰化酶、异淀粉酶、天冬酰胺酶酶微生物生产工艺目前，自然界发现的酶有2500多种，结晶分离的有数百种，有工业应用价值的60多种，已经大量生产的只有20多种。酶微生物生产工艺27.1.3酶制剂的应用1、有机合成和制药工业：酶反应与常规的化学合成结合，如延胡索酸+氨L-天冬氨酸减少步骤，降低成本，无公害，收率高，副产物少。天门冬氨酸酶酶微生物生产工艺2、医药：消化酶类溶血栓酶类

3、3、化学分析和临床检验酶法分析：微量、灵敏、精确高效酶微生物生产工艺27.1.4酶制剂的生产酶的来源酶的来源1、酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物、微生物中，可以直接从生物体中分离提纯而获得，早期酶的生产多是以动植物为主要原料提取而得。2、人工合成酶的方法，目前还受到试剂、设备条件的限制。3、利用动物、植物细胞和组织培养方法来生产酶，由于周期较长、成本较高，也存在一定难度。4、利用微生物生产酶制剂。酶微生物生产工艺利用微生物生产酶制剂的优点利用微生物生产酶制剂的优点（1）能够生产酶的微生物种类繁多，有较大的选择余地。（2）微生物繁殖快、培养周期短、培养方法简便，培养过程容易控制，（3）微生物

4、易变异，具有较强的适应性，能够培育出新的高产菌株。酶微生物生产工艺发酵法生产酶的方式1、固体培养法、固体培养法固体培养法亦称麸曲培养法麸曲培养法，该法是利用麸皮或米糠麸皮或米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼等，加水拌成含水适度含水适度的半固态物半固态物料料作为培养基。一般适用于霉菌的生产。2、深层液体培养法、深层液体培养法液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁殖和产酶。根据通气（供氧）方法的不同，又分为液体表面培养液体表面培养和液体深层培养液体深层培养两种。是目前常用的方法。但无菌要求高。酶微生物生产工艺27.2酶合成的代谢调节及育种酶微生物生产工艺27.2.1 27.2.1 酶

5、生物合成的调节酶生物合成的调节酶生物合成的调节酶生物合成的调节定义：定义：通过调节酶合成的量来控制微生物通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上进行的。进行的。意义：意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物通过阻止酶的过量合成，节约生物合成的原料和能量。合成的原料和能量。酶微生物生产工艺 操纵子基因表达的协同单位操纵子操纵子结构基因结构基因（编码蛋白质（编码蛋白质,structural gene,S）控制部位控制部位操纵基因（操纵基因（operator gene,O）启动子（启动子（promotor gene,P）（一）基因调控理论

6、（一）基因调控理论Jacob and Monod的的操纵子学说（operon theoryoperon theory）酶微生物生产工艺基因操纵子调节系统示意图基因操纵子调节系统示意图 调节基因调节基因 启动基因启动基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 DNA 转录转录 （-）RNA聚合酶聚合酶 （+）转录转录 翻译翻译 mRNA 翻译翻译 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白质蛋白质 诱导剂诱导剂 控制区控制区 信息区信息区操纵子操纵子酶微生物生产工艺调节基因调节基因(regulator gene)(regulator gene)：可产生一种组成型调节蛋白可产生一种组成型调节蛋白(regulatory(

7、regulatory protein)protein)（一种变构蛋白），通过与效应物（一种变构蛋白），通过与效应物(effector)(effector)（包括诱导物和辅阻遏物）的特（包括诱导物和辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。基因的结合力。调节基因常位于调控区的上游。调节基因常位于调控区的上游。酶微生物生产工艺cAMP-CRP复合物的作用示意图启动基因（启动基因（promotor genepromotor gene）（启动子）：）（启动子）：有两个位点：有两个位点：（1 1）RNARNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点（

8、2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的结合位点。的结合位点。CAPCAP：分解代谢产物基因活化蛋白（：分解代谢产物基因活化蛋白（catabolite gene catabolite gene activator proteinactivator protein），又称环腺苷酸受体蛋白），又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein(cAMP receptor protein，CRPCRP）。）。只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，复合物结合到启动子的位点上，RNARNA聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才聚合酶才能结合到其在启动

9、子的位点上，酶的合成才能开始。能开始。酶微生物生产工艺操纵基因（操纵基因（Operater geneOperater gene）:位于启动基因和结构基因之间的一段碱位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。结构基因（结构基因（Structural geneStructural gene）:决定某一多肽的决定某一多肽的DNADNA模板，与酶有各自的模板，与酶有各自的对应关系，其中的遗传信息可转录为对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNAmRNA，再翻译为蛋白质。

10、再翻译为蛋白质。酶微生物生产工艺(二二)酶合成调节的类型酶合成调节的类型 1.1.诱导诱导 (induction)(induction)组成酶：细胞固有的酶类。组成酶：细胞固有的酶类。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。物而临时合成的一类酶。2.2.阻遏阻遏 (repression)(repression)分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏(catabolite repression)(catabolite repression)反馈阻遏反馈阻遏(feedback repression)(feedback repression)酶微

11、生物生产工艺（三）酶合成的调节机制1.酶合成的诱导加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。酶合成诱导的现象：酶合成诱导的现象：已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有：-半乳糖苷酶；半乳糖苷酶；-半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶半乳糖苷透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。实验：（实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成；内无上述三种酶合成；（2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成；上述三种酶合成；（3）表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成。）表明菌体生物合成的经济

12、原则：需要时才合成。酶微生物生产工艺调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 关关 闭闭启启动动子子ORPLacZLacYLaca调节调节基因基因操纵操纵基因基因乳糖结构基因乳糖结构基因启启动动子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（无活性）（无活性）基基 因因 表表达达mRNAA、乳糖操纵子的结构、乳糖操纵子的结构B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）诱诱导导酶微生物生产工艺 2.2.末端产物阻遏末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累

13、积引起的阻遏由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。酶合成阻遏的现象：酶合成阻遏的现象：实验：实验：（1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在；（2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。酸合成酶的活性降低，直至消失。（3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。不需要就不合成。酶微生物

14、生产工艺 色氨酸操纵子色氨酸操纵子酶的阻遏酶的阻遏调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达结构基因表达调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基与操纵基因结合，结构基因不能表达因不能表达酶微生物生产工艺酶酶的的诱诱导导和和阻阻遏遏操操纵纵子子模模型型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白D.无活性

15、阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂操纵基因操纵基因启动基因启动基因调节基因调节基因结构基因结构基因 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因结构基因不表达结构基因不表达诱导物诱导物诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏蛋白不能起到阻挡操纵基因的作用到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达结构基因可以表达酶蛋白酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结合,结构基因可以表达结构基因可以表达阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性)酶蛋白酶蛋白mRNA代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋白能

16、够阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达结构基因不表达代谢产物代谢产物酶微生物生产工艺调控方式 阻遏蛋白 添加物 与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性不转录，继而不翻译诱导物转录，继而翻译乳糖操纵子酶的阻遏无活性阻遏物不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶微生物生产工艺3.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。遏利用慢的底物的有关酶合成的现

17、象。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。酶微生物生产工艺分解代谢物阻遏现象：分解代谢物阻遏现象：实验：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的生了两个对数生长期中间隔开一个

18、生长延滞期的“二二次生长现象次生长现象”(diauxie(diauxie或或biphasic growthbiphasic growth）。）。这一现象又称葡萄糖效应，这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（受体蛋白（CRPCRP）,亦称降解物亦称降解物基因活化蛋白（基因活化蛋白（CAPCAP）。）。酶微生物生产工艺分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基基 因因 表表达达CAP基因基因结

19、构基因结构基因TCAPOCAP结结合部位合部位 RNA聚合酶聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖葡萄糖分解代分解代谢产物谢产物腺苷酸腺苷酸环化酶环化酶磷酸二酯磷酸二酯酶酶ATPcAMP5-AMP抑制抑制激活激活葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP的关系的关系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）降低降低cAMP浓度浓度使使CAP呈失活状态呈失活状态酶微生物生产工艺27.2.2、提高酶产量的策略、提高酶产量的策略（一）菌种选育（一劳永逸）（一）菌种选育（一劳永逸）1.1.诱变育种诱变育种 (1)使诱导型变为组成型

20、使诱导型变为组成型选育组成型突变株选育组成型突变株(2)(2)使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株选育营养缺陷型突变株解除反馈阻遏解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株选育结构类似物抗性突变株解除分解代谢物阻遏解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢阻遏突变株选育抗分解代谢阻遏突变株 2.基因工程育种基因工程育种 酶微生物生产工艺（二）条件控制（二）条件控制1.1.添加诱导物添加诱导物 酶的底物类似物最有效。酶的底物类似物最有效。2.2.降低阻遏物浓度降低阻遏物浓度 除去终产物除去终产物产物阻遏产物阻遏 添加阻止产物形成的抑制剂添加阻止产物形成的抑制剂 避免使用葡萄糖避免使用

21、葡萄糖分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 避免培养基过于丰富避免培养基过于丰富 添加一定量的添加一定量的cAMPcAMP酶微生物生产工艺3.3.添加表面活性剂添加表面活性剂离子型离子型 对细胞有毒害作用对细胞有毒害作用表面活性剂表面活性剂 TweenTween8080 非离子型非离子型 增加细胞通透性增加细胞通透性 TritonXTritonX1001004.4.添加产酶促进剂添加产酶促进剂酶微生物生产工艺27.2.3目前常用的产酶微生物目前常用的产酶微生物大肠杆菌-用来生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶。曲霉（黑曲霉、黄曲霉）-用来生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖

22、氧化酶、氨基酰化酶、脂肪酶。枯草杆菌-用于生产a-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶。啤酒酵母-用来生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶。青霉菌-用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5-磷酸二酯酶、脂肪酶。木霉菌-用于生产纤维素酶。根霉菌-用于生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶。链霉菌-用来生产葡萄糖异构酶。酶微生物生产工艺27.3产酶菌株的制备和优化产酶菌株的制备和优化1、产酶菌株的培养条件、产酶菌株的培养条件2、菌种的分离筛选、菌种的分离筛选3、菌种的变异诱导技术、菌种的变异诱导技术4、原生质体诱导实际生产例子、原生质体诱导实际生产例子酶微生物生产工艺1、产酶菌株的培养条件、产酶菌株的培养条件

23、（1）产酶促进剂）产酶促进剂（2）影响酶产量的各种因素）影响酶产量的各种因素（3）诱导剂和抑制剂）诱导剂和抑制剂酶微生物生产工艺（1）产酶促进剂）产酶促进剂在酶制剂的生产过程中，如果添加少量的某种物质就能增加酶的产量，则这类物质就称为产酶促进剂。产酶促进剂多数是酶的诱导物、或者是表面活性剂，常用的产酶促进剂有：（A）吐温）吐温-80（B）脂肪酰胺磺酸钠）脂肪酰胺磺酸钠（C）聚乙烯醇）聚乙烯醇（D）糖脂）糖脂（E）乙二胺四乙酸（）乙二胺四乙酸（EDTA）酶微生物生产工艺（2）影响酶产量的各种因素）影响酶产量的各种因素A、温度、温度-各种产酶微生物对于温度的要求是各不相同的。细菌：35-37度霉菌

24、：30度酵母菌：30-35度B、PH值值-通过掌握原料的配比保持一定的C/N水平、或者通过添加缓冲剂、能够控制发酵液的PH值。C、通气量（供氧量）、通气量（供氧量）讫今为止，产酶和微生物都是需氧性的微生物。在液体深层发酵中，微生物利用的氧必须是溶解于培养基中和溶解氧。空气中的氧气-培养基溶解氧-透过细胞膜进入原生质。精确测定时采用溶氧仪。D、搅拌、搅拌-搅拌可将泡沫打碎、增加氧气的溶解速度、加强了液体的湍流作用，有利于营养物质与菌体细胞的接触，促进细胞新陈代谢。E、泡沫、泡沫酶微生物生产工艺E、泡沫、泡沫酶制剂发酵过程中泡沫较多。泡沫的存在会阻止CO2的排除、同时直接影响O2的溶解。排除常常采

25、用：机械力消泡沫法、化学消泡剂消泡沫法。常用的消泡剂有：天然油类、矿物油类、醇类、脂肪酸类、天然油类、矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、磷酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷胺类、酰胺类、醚类、磷酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷等等物质。国内酶制剂工业常用的消泡剂为：甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）甘油聚醚（聚氧丙烯甘油醚）泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油醚）泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油醚）酶微生物生产工艺（3）诱导剂和抑制剂）诱导剂和抑制剂某些酶反应，当培养基中不存在诱导物质时，其酶的合成就受到抑制，而当添加诱导物质时，酶的合成就能顺利进行，这类物质称作诱导剂。使用某些酶的抑制剂常常能够促进酶的合成，如在

26、多粘芽孢杆菌的培养基中添加淀粉酶抑制剂S-AI，能增加淀粉酶的产量。在酶的生产中，加入适量表面活性剂，也能提高酶制剂产量，如用爪哇真青霉生产纤维素酶时，如果添加0.1%的吐温-80，则纤维素酶的产量可提高4倍。酶微生物生产工艺27.4酶类药物的提取和纯化酶类药物的提取和纯化一、生物材料的预处理一、生物材料的预处理（一）动物材料的预处理（一）动物材料的预处理1、机械处理、机械处理 用绞肉机绞，一般细胞并不破碎。有的酶必须细胞必须细胞破碎破碎后才能有效地提取，在实验室常用的是玻璃匀浆玻璃匀浆器和组织捣碎器。器和组织捣碎器。2、反复冻融、反复冻融冷冷到到-10左左右右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次

27、。由于细胞中冰晶的形成，及剩剩下下液液体体中中盐盐浓浓度度的的增增高高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些酶酶释释放放出来出来。酶微生物生产工艺3、丙酮粉、丙酮粉组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉丙酮粉，不仅可减减少酶的变性少酶的变性，同时因细胞结构成份的破碎细胞结构成份的破碎使蛋白质与蛋白质与脂质结合脂质结合的某些化学键打开化学键打开，促使某些结合酶结合酶释放到溶液中，常用的方法是将组织糜或匀浆悬浮于0.0lmolL，pH6.5的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液中，在0下下一边搅拌，一边徐徐倒入10倍体积的-15无水丙酮无水丙酮内，10分钟后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次，真空干燥即得丙

28、酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年丙酮粉在低温下可保存数年。酶微生物生产工艺（二）微生物的预处理（二）微生物的预处理要是酶是胞外酶胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵液中吸附提取酶吸附提取酶。但对胞内酶胞内酶则需将菌体细胞破壁，制成无细胞无细胞的悬液后再行提取。菌体用生理盐水洗涤除去培养基后，应深冻保存深冻保存。干干燥燥法法，因为干干燥燥常能导致细细胞胞自自溶溶，增加酶的释放，从而在后处理中破壁不必太剧烈就能达到预期目的。1、干燥法：、干燥法：空气干燥空气干燥 2530 真空干燥还真空干燥还 原剂作保护剂原剂作保护剂(如谷胱甘肽）如谷胱甘肽）冷冻干燥对较敏感的冷冻干燥对较敏感的酶酶宜用此法。2、机械

29、法：、机械法：常用的方法有研磨法，组织匀浆法，超声波法，高压匀浆法等。酶微生物生产工艺3、酶法处理、酶法处理用得最多的是溶溶菌菌酶酶，用量为细胞压积重的1/1000.如在37，pH8.0下对小球菌进行破壁处理，历时15分钟，即可提取核核酸酸酶酶。也有用脱脱氧氧核核糖糖核核酸酸酶酶处理，操作与溶菌酶溶菌酶同。二、酶的提取二、酶的提取1、水溶液法、水溶液法常用稀盐溶液或缓冲液提取稀盐溶液或缓冲液提取。一般在低温下操作低温下操作。在酸性条件下稳定的酶要在酸性条件下提取。一般来一般来说说，碱性蛋白酶用酸性溶液提取碱性蛋白酶用酸性溶液提取，酸性蛋白酶用碱性酸性蛋白酶用碱性溶液提取。溶液提取。酶微生物生产

30、工艺 盐盐浓浓度度一般以等等渗渗为为好好，相当于0.15molL NaCl的离子强度是最适宜于酶的提取。的离子强度是最适宜于酶的提取。2、有机溶剂法、有机溶剂法某些结合酶结合酶如微粒体和线粒体膜的酶微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂和脂质牢固结合质牢固结合，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶变性，最常用的有机溶剂是丁醇有机溶剂是丁醇。丁醇的特性：a亲脂性强，b兼具亲水性。C在脂与水分子之间起类似去垢剂的作用。丁醇提取方法：一是均相法，少量丁醇，搅拌均匀，提取较长时间，离心，取下层液相。二是二相法，适用于易在水溶液中变性的酶。方法是每克组织干粉或干菌体用丁醇5毫升，搅拌20分钟，离心，取沉淀。酶微生

31、物生产工艺3、表面活性剂法、表面活性剂法 表面活性剂能与蛋白质结含而分散在表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中，故可用于提取结合酶。溶液中，故可用于提取结合酶。酶微生物生产工艺三、酶制剂的工业提取法三、酶制剂的工业提取法（一）发酵液的预处理及过滤（一）发酵液的预处理及过滤 微生物发酵液的分离分离，过滤过滤，发酵液中加絮凝剂絮凝剂或凝固剂或凝固剂。絮凝剂絮凝剂有聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸氨酸。（二）酶液的脱色（二）酶液的脱色 活性炭、脱色树脂活性炭、脱色树脂。（三）盐析法（三）盐析法用得最多的是（NH4）2SO4，在常温下不会造成酶在常温下不会造成酶的失活的失活，

32、若分级沉淀分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少。酶微生物生产工艺（四）有机溶剂法（四）有机溶剂法有机溶剂沉淀蛋白质的能力有机溶剂沉淀蛋白质的能力为丙酮异丙醇乙醇丙酮异丙醇乙醇甲醇甲醇。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。（五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂（五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂喷雾干燥用于干燥菌体干燥菌体，药用酶常用冷冻干燥。四、酶的纯化四、酶的纯化评价纯化工艺主要看二个指标，一是酶比活酶比活，二是二是总活力总活力回收。酶微生物生产工艺酶在纯化过程中的一些技术难点：酶在纯化过程中的一些技术难点：（一）杂质的除去（一）杂质的除去酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白

33、杂蛋白、多糖、脂类和核酸多糖、脂类和核酸等。（1）pH和加热沉淀法和加热沉淀法（2）蛋白质表面变性法）蛋白质表面变性法利用蛋白质表面变性表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白除去杂蛋白，加入氯仿和乙醇进行震荡氯仿和乙醇进行震荡，可以除去杂蛋白。酶微生物生产工艺（3）选择性变性法）选择性变性法利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。甚至可用2.5%三氯乙酸三氯乙酸处理。（4）核酸沉淀剂法）核酸沉淀剂法用核核酸酸酶酶，将将核核酸酸降降解解成成核核苷苷酸酸，使使粘粘度度下下降降便便于于离心分离离心分离。用核核酸酸沉沉淀淀剂剂如三三甲甲基基十十六六烷烷基基溴溴化化铵铵、硫硫酸酸链链霉霉素素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋

34、白和二氯化锰聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等。（5）将酶与底物结合）将酶与底物结合 酶酶和和底底物物结结合合或或竞竞争争性性抑抑制制剂剂结结合合后后，热热稳稳定定性性大大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白。大大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白。酶微生物生产工艺（二）脱盐和浓缩（二）脱盐和浓缩1、脱盐、脱盐脱盐方法是透析和凝胶过滤透析和凝胶过滤。2、浓缩、浓缩酶的浓缩方法浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交换、超滤离子交换、超滤、凝胶吸水凝胶吸水、聚乙二醇吸水聚乙二醇吸水等。（三）酶的结晶（三）酶的结晶把酶酶提提纯纯到一定纯度以后（通常纯纯度度应应达达50%以以上上），可使其结晶，酶的纯度经常有一一定

35、定程程度度的的提提高高。为研究蛋白质空间结构提供X射线衍射样品射线衍射样品。酶微生物生产工艺1、酶的结晶方法、酶的结晶方法酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度缓慢地改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。（1）盐析法）盐析法操作要在低温下进行低温下进行，加盐，缓冲液缓冲液pH要接近酶要接近酶的等电点。多数酶就可形成结晶的等电点。多数酶就可形成结晶。有时也可交替置在交替置在4冰箱中和室温下冰箱中和室温下来形成结晶。（2）有机溶剂法）有机溶剂法酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶液中滴加有机溶剂，有时也能使酶形成结晶。酶形成结晶。一般要含少量无机盐的情况下，选择使酶稳定的pH，缓慢地滴加有机溶

36、剂有机溶剂。使用的缓冲液使用的缓冲液一般不用不用磷酸盐磷酸盐，而用氯化物或乙酸盐氯化物或乙酸盐。酶微生物生产工艺（3）复复合合结结晶晶法法有时可以利用某些酶与有有机机化化合合物物或金属离子形成复合物或盐的性质金属离子形成复合物或盐的性质来结晶。（4）透析平衡法）透析平衡法（5）等电点法）等电点法 2、结晶条件的选择、结晶条件的选择（1）酶的纯度）酶的纯度 酶的纯度越高，结晶越容易，长成大的单晶可能性也越大。结晶对酶有明显的纯化作用纯化作用。（2）酶的浓度）酶的浓度（3）温温度度结晶的温度通常在4下下或或室室温温25下下，低温条件下酶不仅溶解度低，而且不易变性低温条件下酶不仅溶解度低，而且不易变

37、性。酶微生物生产工艺（4）时时间间结晶形成的时间,数数小小时时到到几几个个月月，有的甚至需要1年年或更长时间。一般来说，较大而性能好的结晶是在生长慢的情况下得到的。一般希望使微晶的形成快些，然后慢慢地改变沉淀条件，再使微晶慢慢长大。（5）pH调整pH可使结晶长到最最佳佳大大小小，也可改改变变晶晶形形。结晶溶液pH一般选择在被结晶酶的等电点附近。被结晶酶的等电点附近。（6）金属离子）金属离子 许多金属离子能引起或有助于酶的结晶引起或有助于酶的结晶，在酶的结晶过程中常用金属离子有Ca2+、Zn2、Co2、Cu2、Mg2、Mn2、Ni2等等。酶微生物生产工艺（7）晶晶种种不不易易结结晶晶的蛋白质和酶

38、，有的需加加入入微微量量的晶种才能结晶的晶种才能结晶，（8）结晶器皿处理）结晶器皿处理结晶用的器皿要充分清洗、烘干清洗、烘干。使用前用结晶母液再冲洗再冲洗一次。结晶的玻璃器皿，可用硅涂料硅涂料进行表面处理，以使表面光滑且不润湿光滑且不润湿。这样可减少晶减少晶核数目核数目，形成大的结晶。，形成大的结晶。（四）酶分离和纯化工作的注意事项（四）酶分离和纯化工作的注意事项 1、防止酶蛋白变性、防止酶蛋白变性 2、防止辅因子的流失、防止辅因子的流失3、防止酶被蛋白水解酶降解、防止酶被蛋白水解酶降解酶微生物生产工艺27.5 酶类药物酶类药物一、药用酶类的概述一、药用酶类的概述早期酶制剂主要用于治疗消消化化

39、道道疾疾病病，烧伤及感染引起的炎炎症症疾疾病病，现在国内外己广泛应用于多种疾病的治疗，其制剂品种已超过700余种。（一）促进消化酶类（一）促进消化酶类（二）消炎酶类（二）消炎酶类（三）与纤维蛋白溶解作用有关的酶类（三）与纤维蛋白溶解作用有关的酶类（四）抗肿瘤的酶（四）抗肿瘤的酶（五）其它药用酶（五）其它药用酶酶微生物生产工艺（一）胃蛋白酶（一）胃蛋白酶（Pepsin，EC3.4.4.1）胃胃蛋蛋白白酶酶广泛存在于哺乳类动物的胃胃液液中，药用胃蛋白酶系从猪、牛、羊等家畜的胃粘膜中提取胃粘膜中提取。1、组成（结构）、性质、组成（结构）、性质药用胃蛋白酶是胃液中多多种种蛋蛋白白水水解解酶酶的混混合合

40、物物，含有胃胃蛋蛋白白酶酶、组组织织蛋蛋白白酶酶、胶胶原原酶酶等，为粗制的酶制剂。水溶液呈酸性酸性，难溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。pI为为pH1.0，最最适适pH1.52.0。可可溶溶于于70乙乙醇醇和和pH4的的20乙醇中。乙醇中。胃蛋白酶能水解大多数天然水解大多数天然蛋白质底物。酶微生物生产工艺2、生产工艺、生产工艺（1）工艺路线：）工艺路线：胃蛋白酶原盐酸催化激活胃蛋白酶原盐酸催化激活成胃蛋白酶。常用的脱脂剂脱脂剂有乙醚乙醚、氯仿氯仿、四氯化碳四氯化碳。酶微生物生产工艺（2）工艺过程：）工艺过程：（3）胃胃膜膜素素和和胃胃蛋蛋白白酶酶联联产产工工艺艺：向经消消化化、提提取取、脱脱脂脂、分分

41、层层、浓浓缩缩及60丙丙酮酮沉沉淀淀分分离离胃胃膜膜素素的母液中，边搅拌边加冷冷丙丙酮酮，至比比重重为为0.91，即有淡黄色胃蛋白酶沉出，静放过夜，去上清液，沉淀真空干燥，即得胃蛋白酶。（4）结结晶晶胃胃蛋蛋白白酶酶的的制制备备：药用胃蛋白酶原粉，溶于20酒酒精精中，加H2SO4调pH3.0，5静置20h后过滤，加硫硫酸酸镁镁至饱和，进行盐盐析析。盐析物再在pH3.84.0的乙醇中溶解，过滤，滤液用硫硫酸酸调调pH至至1.82.0，即析出针状胃蛋白酶。沉淀再溶于20%pH4的的乙乙醇醇中，过滤，滤液用硫酸调pH至至1.8，在20放置，可得板状或针状结晶。酶微生物生产工艺（二）胰蛋白酶（二）胰蛋

42、白酶胰蛋白酶是从牛牛、羊羊胰胰脏脏提取、结晶的冻干制剂。易易溶溶于于水水，不不溶溶于于氯氯仿仿、乙乙醇醇、乙乙醚醚等等有有机机溶溶剂剂。在pH1.8时，短时煮沸几乎不失活；在碱溶液中加热则变性沉淀，Ca2+有有保保护护和和激激活活作作用用，胰蛋白酶的pI为为10.1。牛胰蛋白酶在肠肠激激酶酶或自自身身催化下，释放出6肽，变成有有活活性性的的胰胰蛋蛋白白酶酶。胰蛋白酶分分子子量量24000，由223个氨基酸残基组成。胰胰蛋蛋白白酶酶专一作用于由碱碱性性氨氨基基酸酸精精氨氨酸酸及及亮亮氨氨酸羧基所组成的肽键酸羧基所组成的肽键。酶本身很容易自溶很容易自溶。酶微生物生产工艺2、生产工艺、生产工艺 （1

43、）工艺路线：）工艺路线：酶微生物生产工艺（三）糜蛋白酶（三）糜蛋白酶（Chymotrypsin，EC3.4.4.5）胰蛋白酶可激活糜蛋白酶原成胰蛋白酶可激活糜蛋白酶原成-糜蛋白酶糜蛋白酶。2、生产工艺、生产工艺（1）工艺路线：）工艺路线：（2）工艺过程：）工艺过程：酶原加少量胰蛋白酶酶原加少量胰蛋白酶，pH7.6酶微生物生产工艺（四）尿激酶（四）尿激酶（Urokinase，EC3.4.99.26）尿激酶，是一种碱碱性性蛋蛋白白酶酶。由肾肾脏脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿尿中中。人尿平均含量56国国际际单单位位m1。1、组成（结构）性质、组成（结构）性质（1）尿激酶有多种分子量形式。尿中的尿

44、胃蛋白酶原，在酸酸性性条条件件下下可以激活生成尿尿胃胃蛋蛋白白酶酶，把天然尿激酶降解降解成为尿激酶尿激酶。（2）尿激酶是专一性很强的蛋蛋白白水水解解酶酶，血纤维蛋白溶酶原是它唯唯一一的天然蛋白质底物，它作用于精精氨氨酸酸-缬缬氨氨酸酸键键使使纤纤溶溶酶酶原原转为纤溶酶。尿激酶也具有酯酶活力酯酶活力。酶微生物生产工艺（3）尿激酶的pI为为pH89，主要部分在pH8.6左左右右。溶溶液液状状态态不不稳稳定定，冻干状态可稳稳定定数数年年。加入1EDTA、人血白蛋白或明胶人血白蛋白或明胶可防止酶的表面变性表面变性作用。2、生产工艺、生产工艺（1）工艺路线：）工艺路线：酶微生物生产工艺（2）工艺过程：）

45、工艺过程：硅藻土吸附，0.02氨水加0.1molL氯化钠洗脱。QAESephadex层析柱去热原、色素。CMC浓缩。酶微生物生产工艺（五）细胞色素（五）细胞色素C（Cytochrome C）细细胞胞色色素素C存在于自然界中一切生物细胞里，其含量与组织的活活动动强强度度成成正正比比。以哺乳动物的心心肌肌、鸟类的胸胸肌肌和昆虫的翼翼肌肌含量最多，肝肝、肾肾次之，皮肤和肺中最少。1、组成（结构）、性质、组成（结构）、性质 细细胞胞色色素素C是含含铁铁卟卟啉啉的结结合合蛋蛋白白质质，铁铁卟卟啉啉环环与蛋白质部分比比例例为为1 1。猪心细胞色素C分分子子量量12200。pI为为pH10.210.8。酶微

46、生物生产工艺细胞色素C对干燥、热和酸干燥、热和酸都较稳定。氧化型氧化型呈水溶液深红色，在饱和硫酸铵中可溶解。还原型还原型水溶液呈桃红色，溶解度较小。2、生产工艺、生产工艺 （1）工艺路线：）工艺路线：酶微生物生产工艺人造沸石人造沸石 pH7.5吸附吸附，蒸馏水和氯化钠溶液反复洗涤，25硫酸铵溶液洗脱硫酸铵溶液洗脱。20三氯醋酸沉淀细胞色素C，AmberliteIRC50（NH4）树脂柱吸附。酶微生物生产工艺（六）溶菌酶（六）溶菌酶（Lysozyme）溶溶菌菌酶酶，又称胞胞壁壁质质酶酶或N-乙乙酰酰胞胞壁壁质质聚聚糖糖水水解解酶酶。它广泛存在于鸟鸟类类和和家家禽禽的蛋蛋清清、哺乳动物的泪泪、唾唾

47、液液、血血浆浆、尿尿、乳乳汁汁、白白细细胞胞和和组组织织（如如肝肝、肾）细胞内肾）细胞内，其中以蛋清含量最丰富蛋清含量最丰富。溶菌酶是一种具有杀杀菌菌作作用用的的天天然然抗抗感感染染物物质质，具有抗菌、抗病毒、抗炎症抗菌、抗病毒、抗炎症。1、组成（结构）和性质、组成（结构）和性质溶菌酶是一碱性球蛋白碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸碱性氨基酸、酰酰氨残基氨残基及芳香族氨基酸芳香族氨基酸（如色氨酸）比例很高。酶微生物生产工艺溶菌酶能催化粘粘多多糖糖或甲甲壳壳素素中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4糖苷键糖苷键。溶菌酶是一种罕见的稳定蛋白质稳定蛋白质。在pH5.5 加热4h后，酶变得更活

48、泼。低浓度的低浓度的Mn（10-7molL）在中性和碱性条件下中性和碱性条件下能使酶免受热的失活作用。酶微生物生产工艺2、生产工艺、生产工艺（1）工艺路线）工艺路线酶微生物生产工艺（七）（七）L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶（L-asparaginase）1、组成（结构）、性质、组成（结构）、性质L-天天门门冬冬酰酰胺胺酶酶是酰酰胺胺基基水水解解酶酶，是从大大肠肠杆杆菌菌菌体中提取分离的酶类药物，用于治疗白血病。性状呈白色粉末状，微有湿性，溶溶于于水水，不溶于丙丙酮酮、氯氯仿仿、乙乙醚醚及及甲甲醇醇。最最适适pH8.5，最最适适温温度度37。L-天门冬酰胺酶的产生菌是霉霉菌菌和和细细菌菌，故可作制

49、造酶的原料。酶微生物生产工艺2、生产工艺、生产工艺（1）工艺路线：）工艺路线：酶微生物生产工艺（八）激肽释放酶（八）激肽释放酶（Kallikrein）激激肽肽释释放放酶酶是一种蛋蛋白白酶酶。哺乳动物的激肽释放酶有两大类：血血液液激激肽肽释释放放酶酶和组组织织激激肽肽释释放放酶酶。药用激肽释放酶又称血血管管舒舒缓缓素素，主要来自颌颌下下腺腺或或胰胰腺。腺。酶微生物生产工艺猪胰激肽释放酶是一种糖蛋白糖蛋白，含有唾液酸含有唾液酸，在腺体中以酶原形式酶原形式存在。唾液酸的除去并不影响酶的活唾液酸的除去并不影响酶的活性性。（1）专一性）专一性激肽释放酶是一种内切蛋白水解酶内切蛋白水解酶，当它作用于蛋白质

50、底物激肽原激肽原后释放出激肽激肽。激肽释放酶只作用于天然激肽原天然激肽原。（2）稳定性）稳定性 一般说，激肽释放酶的纯度越高纯度越高，稳稳定性越差定性越差。在水溶液中不稳定，但在在水溶液中不稳定，但在pH8.0的水或缓的水或缓冲液中，可在冷冻状态下保存相当长时间不失活。冲液中，可在冷冻状态下保存相当长时间不失活。酶微生物生产工艺2、生产工艺、生产工艺 （1）工艺路线：）工艺路线：（2）工艺过程：）工艺过程：冷丙酮33、70，用丙酮、乙醚脱脂、脱水脱脂、脱水。40%、60%冷丙酮分级沉淀。弱酸性阳树脂AmberliteCG50（钠型）酶微生物生产工艺（九九）超超氧氧化化物物歧歧化化酶酶（Supe